15研究微生物的基本方法

第5章研究微生物的基本方法

随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术已深入到细胞、分子和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用。医学微生物学实验室的基本任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床标本中的微生物，并对引起感染的微生物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、流行病学调查及研究等提供科学依据。

第一节显微镜观察

由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到。一般形态和结构可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电子显微镜才能看清楚。常用显微镜有如下几种。

1．普通光学显微镜

采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4μm。显微镜的分辨率为波长的二分之一，即0.2μm，而肉眼可见的最小形象为0.2mm。故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0.2μm的微粒放大成肉眼可见的0.2mm。普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察。

2．暗视野显微镜

常用于观察不染色微生物形态和运动。在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从中间直接透入，视野呈暗色，当标本接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。

3．相差显微镜

相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差异转换为光强度差。在相差显微镜下，当光线透过不染色标本时，由于标本不同部位的密度不一致而引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等。

4．荧光显微镜

荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器。目前大多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光。滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种。用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野聚光器，以加强荧光与背景的对比。本法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的检测或鉴定。

5．电子显微镜

用电子流作为光源，波长与可见光相比差几万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或几十万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察。

8.2制片和染色

一. 非染色标本

非染色标本一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况。细菌未染色时无色透明，在显微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同来进行观察。有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛的细菌则呈不规则布朗运动。梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征

鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等。

1．悬滴法

在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边缘的凡士林粘紧封闭后置高倍镜下（或暗视野）观察。

2．压滴法

用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央，在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片，注意避免产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒钟后置高倍镜下明视野（或暗视野）观察。

3．毛细管法

主要用于厌养菌动力的检查。通常选用60~70mm长。0.5~1.0mm孔径的毛细管虹吸厌养菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封。并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗视野观察。

二、染色标本检查

细菌标本经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如荚膜、鞭毛、芽孢等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定。

（一）细菌染色的一般程序

细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脱色）—（复染）。

1．涂片制备

血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀，涂布成1cm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干。

2．固定

目的是杀死细菌，凝固细菌蛋白及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色。通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。

3．染色

根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色。染色时滴加染液，以复盖标本为度。

4．媒染

凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物质，称媒染剂。常用的有明矾、鞣酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色。媒染剂可用于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。

5．脱色

凡能使已着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂。常用乙醇、丙酮等作为脱色剂。脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴别染色之用。

6．复染

已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成一鲜明对比。复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色。

（二）常用染色法

1. 单染色法

只用一种染料染色。由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液。此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显示细菌的结构与染色特性。

2．复染色法

用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值。常用的有革兰染色法和抗酸染色法。

（1）革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染1min，清水冲去染液。②加碘液媒染 1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗，甩干。④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s，水洗。⑤干后显微镜下镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色。

（2）抗酸染色：萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染液蒸干。持续染5min（奴卡菌需要加长时间），水洗，甩干。②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干。③加吕氏美蓝复染液数滴复染1min，水洗。④干后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。

金胺O-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30~90s。②弃去第1液后加第2

液染15min。③用第3液脱色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置荧光显微镜下镜检观察结果在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色。

3．特殊染色法

（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的处理将新载玻片浸泡在95%乙醇中。临用时取出，以干净纱布擦干。②在玻片上滴蒸馏水1滴。③挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2 min轻轻水洗。⑤干后显微镜镜检观察结果鞭毛和菌体呈紫色。

（2）异染颗粒染色(阿尔培托法)：①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。

②滴加乙液，染1min。水洗。③干后显微镜镜检观察结果菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。

（3）荚膜染色：①奥尔特荚膜染色法：将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min，冷却后水洗，待干镜检。结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要用于碳疽芽胞杆菌。②Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5ml加蒸馏水95ml 的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。方法：细菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加热染1min。再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水