猪Caspase_3基因的克隆及序列分析

收稿日期:20060726基金项目:广西大学科学技术研究基金重点资助项目(2003ZD 01);广西科技攻关项目(桂科攻0480001)作者简介:李军(1971),男,广东梅州人,助理研究员,博士研究生,研究方向为动物传染病防治与分子病毒学。

*为通讯作者。

猪Caspase -3基因的克隆及序列分析李　军,　刘　兵,　曾　兰,　罗廷荣*(广西大学动物科学技术学院,　南宁　530005)摘要:天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是与细胞凋亡有关的一类蛋白酶,其中Caspase-3是细胞凋亡的最终执行者。

为了进一步研究Caspase-3的生物学功能,从P K-15细胞中提取总RN A ,用RT -PCR 方法扩增出猪Caspase-3基因,序列分析表明克隆的Caspase-3基因与GenBank 上登录的猪Caspase-3基因核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和98.6%,与人和鼠的Ca spase -3基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.6%、83.5%和87.8%、86.7%,而且猪、人、鼠的Caspase-3上的催化和剪切位点都极为保守。

关键词:Caspase-3;克隆;序列分析中图分类号:S 813.1　文献标识码:A 文章编号:1002—8161(2006)05-0584-05Cloning and sequence analysis of Caspase -3gene of pigLI Jun ,LIU Bing ,ZENG Lan ,LU O Ting -r ong*(A nimal Science and T echnology College ,Guang x i Univers ity ,N anning 530005,China )Abstract :Caspase is a kind of pr ot eases which is r elated to apopto sis ,and Caspase -3is the ultimate ex ecute in apoptosis.In or der to st udy t he bio log ical functio n o f Caspase-3,t he Caspase-3gene of pig wa s amplified by RT -PCR w it h the ex tr actio n o f RN A fr om P K -15cells.Aft er clo ning and sequencing ,the results show ed that t he nu-cleo tide a nd the deduced amino acid sequences of clo ned Caspase -3sha red 98.9%and 98.6%homo log y w ith thoseof Caspase -3published in GenBank .A s co mpar ed with that of human a nd mouse ,the Caspase -3gene homo lo gy of the nucleotide and the deduced amino acid sequences w er e 88.6%,83.5%and 87.8%,86.7%,respect ively.T he activ e sites cor responding catalysis and cleav ag e o n Caspase-3amo ng the pig ,human and mo use w ere conser vative ver y much .Key words :Caspase -3;cloning ;sequence a nalysis 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(aspartate-specific cy steinyl pro teinase,Caspase)家族是执行细胞凋亡的一类重要蛋白酶。

Caspase 通常以单一的蛋白酶原前体形式存在,被激活后引起一系列酶级联效应,特异性地在特定的氨基酸序列中将肽链从天冬氨酸(Asp )之后切断,还可引起染色体DNA 的降解及细胞的解体[1,2]。

在细胞凋亡信号传导的Caspase 级联反应中,Caspase-3是凋亡信号传导途径下游的一个关键效应因子,它可以被Fas /FasL 途径活化,也可经颗粒酶B 途径活化。

研究表明,Caspase-3可以导致所有类型的细胞发生染色质浓缩和形成DNA 片段化[3,4]。

此外,Caspase -3可以抑制白细胞介素18的生物学活性[5],因此Caspase-3在细胞凋亡和炎症反应中起到关键的作用。

猪的许多病毒病都涉及到细胞凋亡[6～9],有的病毒既能促进细胞凋亡又能抑制细胞凋亡;有的只能诱导细胞凋亡;而有的只能抑制细胞凋亡。

但是Caspase-3在其中的分子作用机制尚未完全清楚,本研究通过克隆猪的Caspase-3基因,以便进一步研究在病毒感染过程中Caspase -3对细胞凋亡的影响。

1　材料与方法1.1　主要试剂　RNA 抽提试剂Tr izol Reag ent 、T aq DNA 聚合酶,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

M-M uLV反转录酶、Rnasin、DNA回收试剂盒购自Prom eg a公司。

PM D18-T载体、限制性内切酶购自Takara公司。

DM EM购自GIBICO公司。

其他化学试剂为进口或国产分析纯产品。

PK-15猪肾细胞系和大肠杆菌感受态细胞E coli DH5 为本实验室保存。

1.2引物根据Genbank上Caspase-3(AB029345)的基因序列,设计1对引物,扩增大小为834bp,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

Csapase-3-1:5, AT GGAGAACA ATAAAACCT3,Csapase-3-2:5, CTAGT GAT A AAA GT AGAGT TC3。

1.3　模板的制备　取PK-15细胞进行总RNA的抽提,方法按T rizol说明书操作。

1.4　RT-PCR　取16 l总RN A置于反应管内,加1 l(25Pmol/ l)的反向引物混匀,于PCR仪内70℃5min,90℃5m in后迅速放入冰浴5min。

依次加入5×RT Buffer,dNT P,Rnasin,M-M uLV反转录酶,至总量25 l,42℃反转录1h。

PCR反应在50 l反应体系中进行,扩增的条件为95℃5m in预变性;95℃1min,50℃1m in,72℃1m in,共进行35个循环;72℃10min。

1.5　基因克隆及序列分析　PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,用DNA回收试剂盒将扩增的目的片段纯化后连接到PM D18-载体,4℃过夜,然后转化E co li DH5 ,涂布于Amp/X-gal LB平板上,37℃培养过夜,经PCR和双酶切鉴定。

阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

用DNAstar 分析软件对测得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它种类的Caspase-3进行同源性比较和分析。

2　结果2.1　Caspase-3基因的RT-PCR扩增　从PK-15细胞中抽提总RNA,经RT-PCR扩增后得到一条834bp的片段,扩增产物大小与预期结果相符(图1)。

2.2　Caspase-3基因的克隆与鉴定　RT-PCR扩增的Caspase-3产物与PM D-18T载体连接后转化E coli DH5 ,小量抽提重组质粒,重组质粒经PCR 扩增产生一个834bp的片段。

而经HincII和SacI 双酶切后增加了2个酶切位点的长度,所以产生了2660bp和866bp的2个片段,证明是阳性重组质粒(图2)。

2.3　测序结果及序列分析　测序结果表明,扩增出的834bp的猪Caspase-3基因是一个完整开放阅读框(ORF),编码277个氨基酸,其中亲水性氨基酸占30.3%,疏水性氨基酸占29.2%,碱性氨基酸占13%,酸性氨基酸占13.4%。

推断的蛋白分子量约为32KDa(图3)。

它与GenBank上登录的猪Cas-pase-3基因的核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性为98.9%和98.6%。

与人、鼠Caspase-3基因的核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性分别为88. 6%、83.5%和87.8%、86.7%。

克隆的猪Caspase-3基因推断的氨基酸序列上含有His121和Gln161-Ala162-Cy s163-Arg164-Gly165(QACRG)五肽这两个参与将底物切割的催化位点以及加工酶原前体成为成熟的酶亚基的两个剪切位点Asp28和Asp175(图4)。

AT G GAG AAC AAT AAA ACC T CA GT G GAT T CA AAA TCC AT T AAA ACT TT G GAG AC A M E N N K T S V D S K S I K T L E T AAG ATC T TA CAT GGA AGC AAA T CA GT G GAC TC T GGA AT A T CC T TG GAT GT C AGT K I L H G S K S V D S G I S L D V S T AC AAA AT G GAT T AT CCT GAA AT G GGT T TA TGT ATA AT A ATT AAT AAT AAG AAC Y K M D Y P E M G L C I I I N N K N T T T GAT AAA AAT AC C GGA ATG GCA TGT CGA TC T GGT ACA GAT GT G GAT GCT GCAF D K N TG M A C R S G T D V D A AAAT CT C AGG GAG AC C TT C ACA AAC TT G AAA T AT GAA GT C AGG AAT AAA AAT GAT N L R E T F T N L K Y E V R N K N D CTT ACA C GT GAA GAA AT T TT G GAG TT A AT G CAC AGT GT T T CT AAA GAA GAC CAT L T R E E I L E L M H S V S K E D H AGT AAA AGG AGC AGT TT T ATT TGC GT G C TT CTA AGC C AT GGT GAA GAA GGA AAA S K R S S F I C V L L S H G E E G K AT T TT T GGA AC A AAT GGA C CT GT T GAT C TG AAA AA A T T A ACA AGT T TC T T C AGAI F G T N G P V D L K K L T S F F RGGG GAC T GT TGT AGA ACT CT A AC T GGC AAA CC C AA A CT C T TC AT A ATT CAG GCCG D C C R T L T G K P K L F I I Q ATGC CGA GGC AC A GAA T T G GAC T GT GGG AT T GAG ACG GAC AGT GGG ACT GAA GATC R G T E LD C G IE T D S G T E DGAC ATG GCG TGT CAG AAA ATA CCA GT T GAG GC A GAC TT C TT G T AT GC A T AT TC TD M A C Q K I P VE A DF L Y A Y SACA GCG CCT GGT T AC T AT T CC T GG CGA AAT TCA AAG GAC GGA TC C TGG T T C ATC T A P G Y Y S W R N S K D G S W F IC AG TC A C TT TGT GCA GCG CT G AAA CAG T AC GCT CA C AAG C CT GAG CT T AT G CACQ S L C A A L K Q Y A H K P E L M H AT T CT T ACT CGG GTT AAC CGA AAG GT A GCA GT A GAA TT C GAG TC C TT T T CT ACTI L T R V N R K V A V E F E S F S TGAC T CT ACT TT T CAT GCA AAG AAA CAG AT T CCA T GT AT T GTG TC C AT G CTC AC AD S T F H A K K Q I P C I V S M L TAAA GAA CT C TAC T TT T AT CAC T AGK E L Y F Y H*图3　Caspase-3核苷酸序列及其推导的氨基酸序列3　讨　论Caspase家族蛋白酶可以经一系列的级联反应,通过不同的信号途径参与多种类型的细胞凋亡[10],其中Caspase-3切割底物直接介导凋亡是细胞凋亡的一个重要途径[11,12]。