里氏木霉产酶菌株的选育研究_张秀江

目前已有不少关于里氏木霉产酶性能的研究 . 管斌（1998）等［3］，以 T. reesei DWC 为出发菌株，经紫外
收稿日期：2014-07-03 作者简介：张秀江（1963-），男，河南信阳人，研究员，研究方向为无公害饲料和饲料添加剂 .
2014 年 11 月
张秀江，等：里氏木霉产酶菌株的选育研究
挑取一环生长在 PDA 斜面上的新鲜孢子接入装有 50 mL 液体培养基的 500 mL 三角瓶中，培养温度为
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河南科学
第 32 卷 第 11 期
31 ℃，培养时间 3 d，测定酶活 . 2.3 固体培养方法
挑取一环生长在 PDA 斜面上的新鲜孢子接入装有 50 g 培养基的 500 mL 三角瓶中，培养温度为 31 ℃，培 养时间 5 d，测定酶活 . 2.4 酶活测定方法
Zhang Xiujiang1， Lan Fangfei2， Hu Hong2， Wang Chuanxing3
（1. Institute of Biology Co. Ltd.，Henan Academy of Sciences，Zhengzhou 450008，China； 2. Henan Ruiteli Biological Technology Limited Company，Zhengzhou 450008，China； 3. Jiyuan Forestry Bureau Forest Tree Seed Station，Jiyuan 459000，China）
木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶酶活力的测定采用国标及相关的行业标准进行 .
3 里氏木霉（Trichoderma reesei-xy07）高产菌种的选育结果
3.1 紫外线诱变 紫外线诱变的机理是能作用于嘧啶，形成嘧啶二聚体（主要是 TT），影响 DNA 正常解链与碱基配对，从
而引起基因突变，提高酶产量［9］. 为了提高菌株的发酵水平或改良生产菌，过去经典的理化诱变育种技术仍 然广泛地被采用，本实验采用紫外诱变的方法照射原菌，稀释分离后涂布在分离平皿 . 紫外照射孢子成活率 结果如表 1 所示 .
里氏木霉（Trichoderma reesei）是多细胞的真核微生物，隶属于丛梗孢目（Moniliales）、木霉属（Penicillium）. 里氏木霉为好气菌，其菌落在 PDA 平板上生长快，菌丝层较厚，致密丛束状，初期为白色，平坦，后期因产生 分生孢子而呈深绿色 . 产孢区常排列成同心轮纹状 . 菌落背面无色，有时呈浅黄色 . 菌丝透明，有隔，细胞 壁光滑，分生孢子梗由菌丝直立生出，无色，分枝多，对生或互生二至三级分枝，整体像树枝；分枝与分生孢 子梗近似直角，末端为小梗，小梗瓶形，分生孢子球形或长椭圆形，表面粗糙，布满小刺；单胞，靠黏液在小梗 上聚集成球状绿色的分生孢子头［2］.
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线、亚硝酸钠、亚硝基胍反复多次诱变处理，筛选出一突变株 T. reesei GB6 . 菌株产纤维素酶酶活力其中滤纸 酶活达到 3.62 IU/mL、CMC 酶活达到 24.64 IU/mL. 邬敏辰（1998）等［4］，以里氏木霉突变株 RM-27 为纤维素酶 生产菌，采用固体发酵法，29 ℃发酵 144 h，其滤纸酶活和β-葡萄苷糖酶活分别为 600 mg 葡萄糖/gDMh 和 115 mg 葡萄糖/gDMh . 并系统研究了各种营养成分和培养条件对 RM-27 菌株纤维素酶的影响 . 傅力（2009） 等［5］，通过对里氏木霉 DWC 原生质体紫外线诱变，筛选产纤维素酶活力高的突变菌株并对该菌株的产酶 培养基进行优化 . 研究原生质体最佳诱变时间以筛选高产纤维素酶的突变株，同时分别对产酶培养基中 不同种类碳源和氮源、Vogel’s 母液、表面活性剂对 CMC 酶活（CMCA）、FP 酶活（FPA）的影响进行了研究 . 方浩（2009）等［6］，研究了利用里氏木霉和黑曲霉混合培养的形势产纤维素酶，以农林废弃物之一的玉米秸 秆为底物，经过蒸汽爆破预处理后，用作产酶碳源 . 以里氏木霉单一培养与黑曲霉单一培养为参照进行对 比研究 . 结果表明，黑曲霉接种较里氏木霉延迟 48 h，里氏木霉与黑曲霉接种量比是 5∶1 时，滤纸酶活最 高，达到 3.295 IU/mL，高于里氏木霉单一培养（2.480 IU/mL），β-葡萄苷糖酶活达 1.010 IU/mL，也远远高于里氏 木霉单一培养（0.243 IU/mL）. 张晓垣（2011）等［7］，以里氏木霉 40 359 为出发菌株，对其进行紫外线、亚硝酸 钠、硫酸二乙酯诱变，选育纤维素酶高产菌株 . 经过平皿初筛和摇瓶复筛，得到一株稳定性好的菌株 YB40359，FPA 酶活达到 57.31 U/mL，较原始菌株提高了 87.12%；CMC 酶活达到 142.60 U/mL，较原始菌株提 高了 58.66%，且遗传稳定性好，可以作为饲用纤维素酶的降解菌 .
本试验以里氏木霉为出发菌种，经紫外线和亚硝酸诱变［8］，选育出一株经固态发酵产品同时富含纤维素 酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的高产菌株，现将菌株选育过程报导如下 .
1 材料和方法
1.1 试验材料 1.1.1 出发菌株 里氏木霉（Trichoderma reesei）中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）提供 . 1.1.2 出发菌株产酶 木聚糖酶活为 325 U/g，纤维素酶活为 560 U/g，β-葡聚糖酶活为 480 U/g . 1.1.3 培养基
由 560 U/g，提高到 2600 U/g，相对于出发菌株提高了 4.6 倍；β-葡聚糖酶活由 480 U/g，提高到 5500 U/g，相对于出发
菌株提高了 11.5 倍 .
关键词：里氏木霉；菌株选育；紫外线；亚硝酸
中图分类号：Q 933
文献标识码：A
Breeding of the Strain Trichoderma Reesei for Producing Enzyme
液体培养基：葡萄糖 30 g、NaNO3 2 g、K2Hg、H2O1000 mL，pH 值 自然 .
斜面培养基：醋酸纤维素钠 0.5%、硫酸铵 0.2%、酵母膏 1%、琼脂 2%，pH 值自然 . 固体发酵培养基：花生壳粉、麸皮、玉米淀粉的质量比为 70∶20∶10，每 1 kg 培养基中添加硫酸铵 3%，水 1500 mL，pH 值自然 .
出 20 株先经三角瓶液体发酵产酶测定，获得 10 个高产菌株再经三角瓶固体发酵培养复选，菌株产酶及酶活 力如表 2 所示（菌株产其他酶酶活很低，选育过程中未做检测）. 其中 5 株产酶较高，分别为 xz-10、xz-09、xz12、xz-17、xz-08 . 菌株干基木聚糖酶活力达到 8000~9200 U∕g、纤维素酶活力达到 800~930 U∕g、β-葡聚糖酶 活力达到 1600~1900 U∕g .
表 1 紫外照射孢子成活结果 Tab.1 The result of ultraviolet irradiated sporozoites survived
照射时间/min
0
4
6
8
10
12
活菌数（∕ 个·mL-1）
5000
3250
2100
1350
500
100
成活率/%
100
65
42
27
10
2
为了筛选在固体培养条件下产酶高的菌株，经紫外线诱变处理后，得到 100 余株突变株 . 这些菌株在形 态上有一定的差异，依照其菌落的形态、菌落大小、孢子颜色和孢子丰满程度以及水解圈的大小，从中挑选
（1. 河南省科学院 生物研究所有限责任公司，郑州 450008； 2. 河南省瑞特利生物技术有限公司，郑州 450008； 3. 济源市林业局林木种子站，河南 济源 459000）
摘 要：采用紫外线和亚硝酸联合诱变技术，得到产纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的高产的菌株里氏木霉
Y07 . 试验表明，诱变后菌株的木聚糖酶活由 325 U/g，提高到 28 500 U/g，相对于出发菌株提高了 88 倍；纤维素酶活
纤维素酶可破解富含纤维素的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时 又可将纤维素降解为可被畜禽机体消化吸收的还原糖（葡萄糖）. 木聚糖酶的主要作用就是降解畜禽消化道 内的非淀粉多糖，降低消化道内容物的黏性，促进营养物质的消化吸收，减少畜禽下痢，从而促进畜禽生长 和提高饲料利用率 . β-葡聚糖酶可水解β-葡聚糖，降低肠道内容物的黏度，促进消化吸收［1］，提高饲料转化 率，增加养殖业经济效益 .
第 32 卷 第 11 期 2014 年 11 月
文章编号：1004-3918（2014）11-2244-04
河南科学 HENAN SCIENCE
DOI：10.13537/j.issn.1004-3918.2014.11.012
Vol.32 No.11 Nov. 2014
里氏木霉产酶菌株的选育研究
张秀江 1， 兰芳菲 2， 胡 虹 2， 王传兴 3
2 试验方法
2.1 菌株的诱变处理 2.1.1 紫外线诱变处理 用接种环取新鲜 PDA 斜面上的里氏木霉孢子少许，加入无菌水中进行稀释，用血 球计数板进行计数，使每毫升溶液中孢子量约为 5000 个，取 0.1 mL 在醋酸纤维素钠琼脂平板上分区、划线、 接种，用 30 W 紫外灯，相距 30 cm 处分别照射 4、6、8、1 0、12 min，置 28 ℃培养 10~15 d . 10 d 后开始有菌落生 长，菌落有深绿色、绿色、黄色、白色 . 挑取各种类型的单个菌落进行转种斜面 . 经过初筛、复筛，选出一系列 诱变菌株，进行发酵试验，测定代谢物中酶的活力，由此筛选出经紫外线照射选育的里氏木霉菌株 . 2.1.2 亚硝酸诱变处理 用接种环取新鲜 PDA 斜面上的经紫外线照射选育的里氏木霉菌株的孢子少许，加 入无菌水中进行稀释，用血球计数板进行计数，使每毫升溶液中孢子量约为 5000 个，取 2 mL 孢子悬液于三 角瓶中，向其中加入 0.1 mol∕L 亚硝酸溶液 1.0 mL 混匀，28 ℃保温 5 min，加入 0.2 mol∕L 醋酸-醋酸钠缓冲液 1.0 mL，28 ℃保温，10 min，再加入 2.0 mL pH 值 8.6 的磷酸氢二钠溶液中和 . 挑取透明圈大的菌落分别进行 发酵试验 . 2.1.3 初筛与复筛 将亚硝酸诱变处理后的菌株稀释后涂布到初筛固体培养基上，置 28 ℃培养 10 d，挑取水 解圈较大的菌落转接到 PDA 斜面上培养，再挑取透明圈大的菌落分别进行发酵试验，选取酶活力高的菌株 . 2.2 液体培养方法