里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造

里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造

陈小玲;张穗生;黄俊;雷富;陈东

【摘要】[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于

cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力.

【期刊名称】《南方农业学报》

【年(卷),期】2014(045)010

【总页数】5页(P1739-1743)

【关键词】里氏木霉;纤维素酶;纤维二糖水解酶基因;分子改造;碱基突变

【作者】陈小玲;张穗生;黄俊;雷富;陈东

【作者单位】广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工

程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院广西近海海洋环境科学重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点

实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007

【正文语种】中文

【中图分类】Q785

0 引言

【研究意义】地球上每年光合作用的产物主要为植物枝、干、叶等木质纤维素类物质，产量高达1500多亿t。近年来，如何利用这些纤维素资源来生产燃料乙醇成

为研究热点。有研究发现，微生物产生的纤维素酶可以将纤维素降解为葡萄糖，进而发酵生产乙醇（孙永明等，2006）。纤维素酶不是单种酶，按照催化功能分为

内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）及β-葡萄糖苷酶（BG），这3种

酶协同作用才能将纤维素降解为葡萄糖。cbh1是里氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的主要基因之一，其编码的纤维二糖水解酶（CBH）是纤维素水解酶系

中作用于结晶纤维素的关键酶组分，能够从结晶纤维素的还原端连续催化切下纤维二糖单位，在纤维素水解过程发挥重要作用。由于天然产生的纤维素酶活性较低，

难以满足工业生产要求，因此对里氏木霉的纤维二糖水解酶编码基因cbh1进行人工改造，对提高纤维素酶活性具有重要意义。【前人研究进展】近年来，许多学者对纤维素酶进行分子改造研究。有研究发现，用定点突变的方法改造cbh1，可以提高纤维二糖水解酶作用于无定型纤维素和结晶纤维素的活力（von Ossowskil et al.，2003）。对里氏木霉内切葡聚糖酶EGⅢ的编码基因进行随机突变和定突变，不仅能使酶活得到提高（Xiao et al.，2002），还可使酶的最适pH发生改变（Wang et al.，2005）。在cbh1启动子调控下过表达cbh2基因，均可提高菌株的滤纸酶活和纤维二糖水解酶活（Fang and Xia，2013）。用随机突变的方法改造里氏木霉cre1基因，可使突变菌株的表型发生改变从而提高其纤维素滤纸酶活（陈小玲等，2014）。【本研究切入点】目前，对里氏木霉纤维素酶分子改造的研究主要集中在内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，鲜见有关cbh1分子改造的研究报道，对里氏木霉cbh1进行随机突变能否提高纤维素酶活性有待进一步研究。【拟解决的关键问题】采用分子改造的方法随机改造里氏木霉纤维二糖酶基因cbh1，将改造的cbh1基因转入里氏木霉，通过比较滤纸酶活的方法筛选纤维素酶活提高的突变菌株，并在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1基因序列，以期为工业化生产纤维素酶提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试里氏木霉购自中国科学院微生物研究所菌种保藏室。

供试试剂：限制性内切酶和T4 DNA连接酶购于Promega公司，琼脂糖购于Sigma公司，胶回收和PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，PCR反应所用的酶及试剂、DNA分子量标准DL2000及DNaseI购自Fermentas公司，其他试剂均为国产分析纯。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

涉及的培养基有PDA培养基、CM培养基及MENDEL培养基（陈小玲等，2011），所有培养基均采用高压蒸气灭菌，含葡萄糖的培养基在115℃灭菌15 min，其他培养基在121℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 里氏木霉cbh1基因克隆及改造用PDA培养基培养里氏木霉，3 d后收集菌丝体采用CTAB法（吴志红等，2001）提取总DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列为F（5'-TGCCATCAACCGATACTATG-3'）和R（5'-GGCACTGAGAGTAGTAAGGG-

3'）。以里氏木霉总DNA为模板，按陈小玲等（2011）的方法和反应体系扩增cbh1基因。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；98℃ 30 s，54℃ 1 min，72℃ 1 min，进行30个循环；72℃10 min。将PCR产物保存于-20℃冰箱。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

将经过测序验证的cbh1基因片段用DNaseI消化5~30 min，以1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段大小。通过胶回收纯化100 bp左右的DNA片段，用T4 DNA连接酶进行连接。以连接产物为模板，按照上述方法进行PCR扩增，PCR 产物即为改造后的cbh1基因片段，以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并将剩下的PCR产物保存于-20℃冰箱。

1.2.2 里氏木霉突变体库的构建及突变体筛选将里氏木霉孢子转接于PDA斜面培养基，于30℃培养至表面长满孢子，用无菌水将孢子洗下，并用600目纱布过滤，将滤液转接于CM培养基，在30℃、160 r/min条件下培养约16 h，收集里氏木霉菌丝体，参照艾云灿等（1993）的方法制备里氏木霉原生质体。将改造的cbh1基因片段转化至里氏木霉原生质体（陈小玲等，2011），获得里氏木霉cbh1基因突变体库。将突变体培养于刚果红平板培养基（MENDEL），挑选相对