里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展_覃玲灵
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2 T richoderm a属及其纤维素酶
2 1 T richoderm a属 T richoderm a 属包 括了一组有多种 代谢功能的
好氧嗜温的菌种, 在大多数气候带的土壤中都普遍 存在 [ 27] , 特别常见于潮湿的枯枝落叶中以及硬木林 中 [ 28] 。许多 T richoderm a 属是非常 好的产酶 菌, 因 此其作为生物技术中潜力巨大的微生物而受到广泛
关键词: 里氏木霉 纤维素酶 突变株 基因组 SNV
R esearch D evelopm ent of Trichoderm a reesei and Its Cellulase Hyperproduction Strains
Q in L ing ling H e G ang Chen Jienan
2011年第 5期
覃玲灵等: 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展
45
似但更严格的酶活筛选之后, 从 M 7中分离出了菌 株 NG14, 在胞外蛋 白和纤 维素酶 活力 方面, NG14 与亲本株以及其他可用的纤维素酶突变株相比都提 高了几倍 [ 48] ; 最后, 对 NG 14经过紫外线诱变, 由于 2 脱氧 葡 萄 糖 6磷 酸 的 积 累 会很 快 导 致 生 长抑 制 [ 49] , 所以经过 2脱氧葡萄糖的抗性筛选从而消除 代谢抑制后, 再用一个与前者过程相似的纤维素水 解法, 得到菌株 RU T C30[ 50] 。 Rut C30 刚分离出来 时纤维素酶的产量能够达到 15 FP un its / ( L h) , 能产出大约 20 m g /mL 的胞 外蛋白, 与它的亲本菌
3 Tr ichoderm a reesei的高产突变株
诱变选育是提高菌株酶活的一种有效方法 [ 44] 。 为了提高酶的产量, 从 20世纪 60年代末开始, 很多 实验室都从 T richoderm a reesei野生菌株 QM 6a出发, 将重点集中在对 T richoderm a 的直 接诱变和对高产 菌株的筛选上 [ 35] 。突变株的关系图 谱 ( 截至 1994 年 ) 如图 1所示 [ 1, 35, 。 45 - 47] 3 1 T. reesei RUT C30
44
Baidu Nhomakorabea
生物技术通报 B iotechnology Bulletin
2011年第 5期
产生的纤维素酶各组分较为齐全, 所以一般用于 工业化生产的 纤维素 酶大多 来自于 真菌 [ 7] , 在这 些真菌 中, T richoderm a 属, 尤 其 是 里 氏 木 霉 ( T ri choderm a reesei) 被广泛地用于生产纤维素酶 [ 8- 24] 。 迄今为止, 产 纤维素 酶能 力最强 的微生 物是 里氏 木霉 [ 25] , 它也是产纤 维素酶和半 纤维素酶 的主要 工业生产菌种 [ 26] 。
重新有了兴趣, 也意识到纤维素的酶转化过程会是
阻碍其商业化的瓶颈 [ 35] 。 2 2 纤维素酶
木质纤维素降解为小分子糖是一个非常复杂的
过程, 需要几十种酶的相互协同参与, 首先破坏植物 细胞壁的复杂结构, 进而降解木质素、纤维素和半纤 维素 [ 4] 。一个完整的纤维素酶系通常由作用方式不 同的 3类酶组成 [ 36- 40] : 内切葡聚糖酶 ( endo 1, 4 D g lucanase, EC3 2 1 4, 简称 EG)或称为 Cx酶, 这类酶 作用于纤维素分子内部的非结晶区, 随机水解 1, 4糖 苷键, 产生大量的有非还原端的小分子纤维素; 外切 葡聚糖 酶 ( exo 1, 4 D g lucanase, EC3 2 1 91, 简称 CBH )或称为 C1酶, 这类酶主要作用于纤维素线状分 子的末端, 水解 1, 4糖苷键, 每次切下一个纤维二 糖分子; 葡萄糖苷酶 ( g lucosidase, EC3 2 1 21, 也 称 BG或纤维二糖酶 ), 它的作用是水解纤维二糖及 低分子量的纤维寡糖生成葡萄糖。
综 述与 专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOG Y BULLET IN
20 11 年第 5 期
里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展
覃玲灵 何钢 陈介南
( 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所, 长沙 410004 )
摘 要: 随着纤维素在能源、材料 及化工等领域的广泛开发和应用, 里氏木霉作 为一种重要 的产纤维 素酶工业用 菌种, 越来越受到人们的广 泛关注。为了提高其酶活, 人们做了大量的工作, 获得了一 些相当好 的突变株。对 里氏木霉及 其突变株 的基因组进行研究, 有助于人们理解其 高效产 酶的机 制, 同 时也有 利于构 建其基因 工程菌。 介绍里 氏木霉 T r ichoderma reesei 的背景及其部分高产 纤维素酶突变株, 并阐述近些年来对其突变株的基因 组的研究进展。
在 20世纪 70年代后期, 美国陆军 Nat ick 实验室科 学家 E lw yh Reese首次分离出 T richoderm a的特定菌 株 QM 6a, 被认为 是属于 长枝木 霉 ( T. longibrachia tum ) 的 一 种 截 然 不 同 的 类 型。为 了 纪 念 E lwyn Reese的杰出贡献, 1977年, 绿色木霉更名为里氏木 霉 ( T richod erm a reese) 。此时, 人们对微生物生产的 纤维素酶及其在生产生物燃料中可能会起到的作用
在美国 Rutgers大学, 以及美国 M assachusetts州 的陆军 Nat ick实验室和加州 大学伯克利分 校的化 学工程系, 分别使用摇瓶和大型发酵罐进行了两次 酶活测定后, 表明 T. reesei Rut NG14和 Rut C30都 是突出的纤维素酶生产菌株 [ 48 ] 。
事实证明, T. reesei RUT C30是最好的产酶菌株 之一 [ 48] 。它是通过 3步诱变得到的, 首先, 在代谢 物抑制条件下, 通过水解纤维素酶活的筛选, 进行紫 外线诱变, 得到菌株 M 7(这株菌现已不再使用 ); 其 次, 通过化学诱变 ( 亚硝基胍 ) 和一个过程与前者相
自然界中能降解和利用纤维 素的微生物种 类
很多, 许多细菌可分解纤维素, 而且产生的纤维 素 酶具有高度专一性, 但是它们生长速度 慢, 需要 厌 氧的生 长条件 [ 6] , 这些都 限制了 其应 用。真菌 所 产生的纤维素酶多是 胞外酶, 便于分离 和提取, 且
收稿日期: 2010 11 24 基金项目: 国家林业局 948 项目 ( 2006 4 123 ) 作者简介: 覃玲灵, 女, 硕士研究生, 研究方向: 生物质能源; E m ai:l canaceiling@ 163. com 通讯作者: 何钢, 男, 教授, 从事生物技术教学和科研; E m a i:l hegong262@ yahoo. com. cn
关注。此外, 一些 T richoderm a 属还具有抗性特征, 能够作为生物控制菌对抗植物病原体 [ 29- 31] 。
T richoderm a 的概念最早由 P ersoon[ 32] 引 入, 开 始概括的 T richod erm a 主要有 4 个菌种, 即 T. aure um、T. nigrescens、T. roseum 以及 T. viride, 不同分生孢 子的颜色是种间的区别, 现在人们已经认识到它们 是彼此无 关的种类。T richoderma 现在仅 用于描述 以 T. viride为代表的绿色类型的真菌 [ 34] 。 R ifa it[ 33] 依据微观特征, 界定了 T richoderm a 属。T richoderm a 属的分生孢子梗排列成规则的树状结构而且是重复
占 20% , 即 350 亿 t[ 4] 。这些生物 质大多以农业和 林业废弃物的形式存在, 并且每年都在大量积累, 这 不仅会导致环境的恶化, 而且会导致这种可利用资 源的流失 [ 1] 。因此如何充分 利用这些资源 成为迫 在眉睫的问题, 在对生物质的开发利用中, 一个重要 瓶颈就是如何高效利用微生物进行酶催化水解将生 物质降解为单糖 [ 5] 。
多次分枝; 开始形成的 分枝较长, 后续形 成的分枝 随着离基部距离的增加而逐步变短, 多数土壤以 及木材上生长的 T richoderm a 菌株, 其 有性型 还未 观察 到, T richoderm a 中 的 许 多 常 见 种 类 无 有 性 世代 [ 34] 。
绿色木霉 ( T richoderm a virid e)因其在 1944年第 二次世界大战期间一直在毁坏驻扎于东南亚所罗门 群岛上的美军的棉衣和帆布帐篷而被人们发现 [ 35 ] 。
K ey w ords: T richoderma reesei Cellu lase M u tant stra in G enom e SNV
1 背景
随着人口不断增长, 以及现有的煤、天然气和石 油存储量的减少, 发展新能源成为实现经济社会可 持续发展的必经之路。以纤维素、半纤维素和木质 素形式存在的生物质收集并且存储了大量太阳能, 是一种重要的能源和 物质资源 [ 1 ] 。地球上最主要 的生物质来自绿色植物, 每年光合作用的生物质净 产量约为 1 800亿 t[ 2] 。生物质中含量最多的是纤 维素, 其由成百上千个葡萄糖分子聚合而成, 是地球 上存在最丰富的有机大分子, 储量约为 850亿 t[ 3 ] ; 其次是半纤维素, 储量约为 500 亿 ;t 第三类是木质 素, 由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成, 约
( Institute of B io log ical and Environm ental Science& T echnology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004)
Abstrac:t A s w ide ly deve lopm ent and utilization of ce llulose in the fie ld of energy, m ate rials and chem istry industry, T r ichoderma reesei has been caught m ore and m ore attention for its be ing a k ind of im portant ce llu lase stra in for industry. Fo r enhanc ing its cellu lase product, peop le hav e done a lot of work on it, and ob tained seve ra l cons iderably good mutant strains. T o learn the genom e o fT r ichoderma reesei and its mu tant strains is he lp fu l to us understand its system o f ce llulase hype rproduction, also he lp fu l to people construct its g enet ic eng ineering stra in in the future. T h is article introduced the background o f T richoderma reesei and part of its hyperce llulase product stra ins, a lso elabo rated the research deve lopm ent of its m utan t strains genom e in the recent yea rs.
T richoderma reesei已经被证实能够分泌大量高 效的纤维素酶 [ 41 ] , 这种能力使它成为工业生产中最 主要的菌株, T richoderm a reesei 的胞外纤维素系统由 60% - 80% 的外切葡聚糖苷酶, 20% - 36% 的内切 葡聚糖苷酶和 1% 的 葡聚糖苷酶组成, 这些酶协 同作用将纤维素转换成葡萄糖 [ 42, 43] 。
2 1 T richoderm a属 T richoderm a 属包 括了一组有多种 代谢功能的
好氧嗜温的菌种, 在大多数气候带的土壤中都普遍 存在 [ 27] , 特别常见于潮湿的枯枝落叶中以及硬木林 中 [ 28] 。许多 T richoderm a 属是非常 好的产酶 菌, 因 此其作为生物技术中潜力巨大的微生物而受到广泛
关键词: 里氏木霉 纤维素酶 突变株 基因组 SNV
R esearch D evelopm ent of Trichoderm a reesei and Its Cellulase Hyperproduction Strains
Q in L ing ling H e G ang Chen Jienan
2011年第 5期
覃玲灵等: 里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展
45
似但更严格的酶活筛选之后, 从 M 7中分离出了菌 株 NG14, 在胞外蛋 白和纤 维素酶 活力 方面, NG14 与亲本株以及其他可用的纤维素酶突变株相比都提 高了几倍 [ 48] ; 最后, 对 NG 14经过紫外线诱变, 由于 2 脱氧 葡 萄 糖 6磷 酸 的 积 累 会很 快 导 致 生 长抑 制 [ 49] , 所以经过 2脱氧葡萄糖的抗性筛选从而消除 代谢抑制后, 再用一个与前者过程相似的纤维素水 解法, 得到菌株 RU T C30[ 50] 。 Rut C30 刚分离出来 时纤维素酶的产量能够达到 15 FP un its / ( L h) , 能产出大约 20 m g /mL 的胞 外蛋白, 与它的亲本菌
3 Tr ichoderm a reesei的高产突变株
诱变选育是提高菌株酶活的一种有效方法 [ 44] 。 为了提高酶的产量, 从 20世纪 60年代末开始, 很多 实验室都从 T richoderm a reesei野生菌株 QM 6a出发, 将重点集中在对 T richoderm a 的直 接诱变和对高产 菌株的筛选上 [ 35] 。突变株的关系图 谱 ( 截至 1994 年 ) 如图 1所示 [ 1, 35, 。 45 - 47] 3 1 T. reesei RUT C30
44
Baidu Nhomakorabea
生物技术通报 B iotechnology Bulletin
2011年第 5期
产生的纤维素酶各组分较为齐全, 所以一般用于 工业化生产的 纤维素 酶大多 来自于 真菌 [ 7] , 在这 些真菌 中, T richoderm a 属, 尤 其 是 里 氏 木 霉 ( T ri choderm a reesei) 被广泛地用于生产纤维素酶 [ 8- 24] 。 迄今为止, 产 纤维素 酶能 力最强 的微生 物是 里氏 木霉 [ 25] , 它也是产纤 维素酶和半 纤维素酶 的主要 工业生产菌种 [ 26] 。
重新有了兴趣, 也意识到纤维素的酶转化过程会是
阻碍其商业化的瓶颈 [ 35] 。 2 2 纤维素酶
木质纤维素降解为小分子糖是一个非常复杂的
过程, 需要几十种酶的相互协同参与, 首先破坏植物 细胞壁的复杂结构, 进而降解木质素、纤维素和半纤 维素 [ 4] 。一个完整的纤维素酶系通常由作用方式不 同的 3类酶组成 [ 36- 40] : 内切葡聚糖酶 ( endo 1, 4 D g lucanase, EC3 2 1 4, 简称 EG)或称为 Cx酶, 这类酶 作用于纤维素分子内部的非结晶区, 随机水解 1, 4糖 苷键, 产生大量的有非还原端的小分子纤维素; 外切 葡聚糖 酶 ( exo 1, 4 D g lucanase, EC3 2 1 91, 简称 CBH )或称为 C1酶, 这类酶主要作用于纤维素线状分 子的末端, 水解 1, 4糖苷键, 每次切下一个纤维二 糖分子; 葡萄糖苷酶 ( g lucosidase, EC3 2 1 21, 也 称 BG或纤维二糖酶 ), 它的作用是水解纤维二糖及 低分子量的纤维寡糖生成葡萄糖。
综 述与 专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOG Y BULLET IN
20 11 年第 5 期
里氏木霉及其纤维素酶高产菌株的研究进展
覃玲灵 何钢 陈介南
( 中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所, 长沙 410004 )
摘 要: 随着纤维素在能源、材料 及化工等领域的广泛开发和应用, 里氏木霉作 为一种重要 的产纤维 素酶工业用 菌种, 越来越受到人们的广 泛关注。为了提高其酶活, 人们做了大量的工作, 获得了一 些相当好 的突变株。对 里氏木霉及 其突变株 的基因组进行研究, 有助于人们理解其 高效产 酶的机 制, 同 时也有 利于构 建其基因 工程菌。 介绍里 氏木霉 T r ichoderma reesei 的背景及其部分高产 纤维素酶突变株, 并阐述近些年来对其突变株的基因 组的研究进展。
在 20世纪 70年代后期, 美国陆军 Nat ick 实验室科 学家 E lw yh Reese首次分离出 T richoderm a的特定菌 株 QM 6a, 被认为 是属于 长枝木 霉 ( T. longibrachia tum ) 的 一 种 截 然 不 同 的 类 型。为 了 纪 念 E lwyn Reese的杰出贡献, 1977年, 绿色木霉更名为里氏木 霉 ( T richod erm a reese) 。此时, 人们对微生物生产的 纤维素酶及其在生产生物燃料中可能会起到的作用
在美国 Rutgers大学, 以及美国 M assachusetts州 的陆军 Nat ick实验室和加州 大学伯克利分 校的化 学工程系, 分别使用摇瓶和大型发酵罐进行了两次 酶活测定后, 表明 T. reesei Rut NG14和 Rut C30都 是突出的纤维素酶生产菌株 [ 48 ] 。
事实证明, T. reesei RUT C30是最好的产酶菌株 之一 [ 48] 。它是通过 3步诱变得到的, 首先, 在代谢 物抑制条件下, 通过水解纤维素酶活的筛选, 进行紫 外线诱变, 得到菌株 M 7(这株菌现已不再使用 ); 其 次, 通过化学诱变 ( 亚硝基胍 ) 和一个过程与前者相
自然界中能降解和利用纤维 素的微生物种 类
很多, 许多细菌可分解纤维素, 而且产生的纤维 素 酶具有高度专一性, 但是它们生长速度 慢, 需要 厌 氧的生 长条件 [ 6] , 这些都 限制了 其应 用。真菌 所 产生的纤维素酶多是 胞外酶, 便于分离 和提取, 且
收稿日期: 2010 11 24 基金项目: 国家林业局 948 项目 ( 2006 4 123 ) 作者简介: 覃玲灵, 女, 硕士研究生, 研究方向: 生物质能源; E m ai:l canaceiling@ 163. com 通讯作者: 何钢, 男, 教授, 从事生物技术教学和科研; E m a i:l hegong262@ yahoo. com. cn
关注。此外, 一些 T richoderm a 属还具有抗性特征, 能够作为生物控制菌对抗植物病原体 [ 29- 31] 。
T richoderm a 的概念最早由 P ersoon[ 32] 引 入, 开 始概括的 T richod erm a 主要有 4 个菌种, 即 T. aure um、T. nigrescens、T. roseum 以及 T. viride, 不同分生孢 子的颜色是种间的区别, 现在人们已经认识到它们 是彼此无 关的种类。T richoderma 现在仅 用于描述 以 T. viride为代表的绿色类型的真菌 [ 34] 。 R ifa it[ 33] 依据微观特征, 界定了 T richoderm a 属。T richoderm a 属的分生孢子梗排列成规则的树状结构而且是重复
占 20% , 即 350 亿 t[ 4] 。这些生物 质大多以农业和 林业废弃物的形式存在, 并且每年都在大量积累, 这 不仅会导致环境的恶化, 而且会导致这种可利用资 源的流失 [ 1] 。因此如何充分 利用这些资源 成为迫 在眉睫的问题, 在对生物质的开发利用中, 一个重要 瓶颈就是如何高效利用微生物进行酶催化水解将生 物质降解为单糖 [ 5] 。
多次分枝; 开始形成的 分枝较长, 后续形 成的分枝 随着离基部距离的增加而逐步变短, 多数土壤以 及木材上生长的 T richoderm a 菌株, 其 有性型 还未 观察 到, T richoderm a 中 的 许 多 常 见 种 类 无 有 性 世代 [ 34] 。
绿色木霉 ( T richoderm a virid e)因其在 1944年第 二次世界大战期间一直在毁坏驻扎于东南亚所罗门 群岛上的美军的棉衣和帆布帐篷而被人们发现 [ 35 ] 。
K ey w ords: T richoderma reesei Cellu lase M u tant stra in G enom e SNV
1 背景
随着人口不断增长, 以及现有的煤、天然气和石 油存储量的减少, 发展新能源成为实现经济社会可 持续发展的必经之路。以纤维素、半纤维素和木质 素形式存在的生物质收集并且存储了大量太阳能, 是一种重要的能源和 物质资源 [ 1 ] 。地球上最主要 的生物质来自绿色植物, 每年光合作用的生物质净 产量约为 1 800亿 t[ 2] 。生物质中含量最多的是纤 维素, 其由成百上千个葡萄糖分子聚合而成, 是地球 上存在最丰富的有机大分子, 储量约为 850亿 t[ 3 ] ; 其次是半纤维素, 储量约为 500 亿 ;t 第三类是木质 素, 由结构复杂的含芳香环的有机分子聚合而成, 约
( Institute of B io log ical and Environm ental Science& T echnology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004)
Abstrac:t A s w ide ly deve lopm ent and utilization of ce llulose in the fie ld of energy, m ate rials and chem istry industry, T r ichoderma reesei has been caught m ore and m ore attention for its be ing a k ind of im portant ce llu lase stra in for industry. Fo r enhanc ing its cellu lase product, peop le hav e done a lot of work on it, and ob tained seve ra l cons iderably good mutant strains. T o learn the genom e o fT r ichoderma reesei and its mu tant strains is he lp fu l to us understand its system o f ce llulase hype rproduction, also he lp fu l to people construct its g enet ic eng ineering stra in in the future. T h is article introduced the background o f T richoderma reesei and part of its hyperce llulase product stra ins, a lso elabo rated the research deve lopm ent of its m utan t strains genom e in the recent yea rs.
T richoderma reesei已经被证实能够分泌大量高 效的纤维素酶 [ 41 ] , 这种能力使它成为工业生产中最 主要的菌株, T richoderm a reesei 的胞外纤维素系统由 60% - 80% 的外切葡聚糖苷酶, 20% - 36% 的内切 葡聚糖苷酶和 1% 的 葡聚糖苷酶组成, 这些酶协 同作用将纤维素转换成葡萄糖 [ 42, 43] 。