细胞分离与培养技术

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轻轻翻转培养瓶，使培养液刚刚覆盖组织块，每隔2~3天换一次培养液
观察到有大量成纤维细胞长出后轻轻去除组织块，继续培养
待细胞快长满时用0.25%胰蛋白酶消化细胞并传代培养，
取第3~5代细胞用于实验
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培养24h
培养96h
培养120h
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举例（初步淋巴细胞分离法）：
放血处死动物，无菌取胸腺和脾组织，去除脂肪和结缔组织，放入盛 有含5%小牛血清的D-Hank’s液（不含钙镁，含青霉素200kU· -1、链 L 霉素200mg· -1）平皿的网纱中（200目） L 用注射器针芯轻轻碾碎胸腺和脾组织，使单个细胞经网进入溶液中 溶液移入离心管中， 1200 rpm离心10min，弃上清， D-Hank’s液洗涤 细胞，加入DMEM培养液计数和调节细胞浓度，进行培养
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免疫磁珠分离细胞已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T(CD3)、 B(CD19)淋巴细胞、内皮细胞(CD34)、造血祖细胞(CD34)、单核/巨噬细 胞(CD14)、胰岛细胞(胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）) 、多种肿瘤 细胞等。
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MACS技术优点：

MACS技术缺点：
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将培养液移至离心管中，1200rpm离心10min，弃上清 再加入含0.25%胰蛋白酶的D-Hank’s液4ml，培养消化30min
200目尼龙网纱过滤，1200 rpm离心10min，弃上清 将获得的细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h，弃去未黏附细胞
（如淋巴细胞，红细胞），此时的贴壁细胞即为原代滑膜细胞
包括胰蛋白酶、胶原酶和中性蛋白酶等。
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1.胰蛋白酶 (Trypsin)
在去除不需要的组织后，使用无钙镁的平衡盐溶液清洗组织块， 重复清洗2到3次。用无菌的解剖刀和剪子把组织切成 1-2mm3小块。
将盛有组织碎片的容器臵于冰上。加入0.25％溶解在无钙镁的 平衡盐溶液中的胰蛋白酶（100mg组织加入1ml 胰蛋白酶）。
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在4℃孵育6到18小时，使胰蛋白酶尽可能渗透进去 移弃组织碎片中的胰蛋白酶，在37℃孵育包含残留 胰蛋白酶的组织碎片20到30分钟 在组织碎片加入热的完全培养基，用移液管轻轻地分散组织。如果使
用无血清培养基，要加入大豆胰蛋白酶抑制剂
通过无菌不锈钢丝网（100-200目）过滤，计数和接种细胞，进行培 养
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二、从原代组织中分离细胞
组织和器官采集：
人标本：可采取无菌手术法切取少量所需的组织或器官（活检和手术）。 大量的动物组织：先麻醉或处死，浸入70%酒精中，使毛皮全部浸湿，从腹
中线剪开皮肤，注意不要剪开胸腔或腹腔。将皮肤向上、下撕开分离并向上、 下翻开，暴露胸腹部的筋膜，用生理盐水洗净黏于筋膜上的断毛，以碘酒和70% 酒精消毒后，更换一套消毒灭菌的器械，剪开胸腔或腹腔，无菌采取所需器官。
利用细胞的相对密度或大小不同而沉降速度不同的原理，以自然沉 降法结合不同速度的离心沉降法将不同的细胞分离。 抗凝血，室温或37℃下直立静臵30-60min，红细胞沉降至下层，中 间乳白色薄膜层为白细胞及血小板，上层为淡黄色血浆。也可将抗凝血 与3%明胶（经灭菌消毒）等量或3︰l量混合于离心管中，直立静臵30-

兔 耳静脉或动脉穿刺取血。
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血液抗凝方法：

肝素法：按每ml血液约用0.1-0.2mg肝素（即5%肝素溶液2-4µ l）； 草酸盐法：取草酸钾0.2g，草酸铵0.3g，加双蒸水10ml溶解后，取 0.2ml放入5ml的试管中，使其干燥。若采用5ml以下的血液可直接 注入此试管中，轻轻摇晃；

临床药理研究所
1
现代生物技术
基因工程技术
细胞工程技术
酶工程技术
发酵工程技术
细胞培养
2

从血液、体液中分离细胞
原代培养

从原代组织中分离细胞

从原培养容器中分离细胞 -- 传代培养
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采血方法：

人 静脉穿刺、耳垂或手指针刺采血； 小动物（大鼠、小鼠） 剪尾法、眼眶采血、心脏穿刺 法、断颈取血或股动脉放血。
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4.组织块培养法 举例（成纤维样滑膜细胞组织块培养法）：
无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等，用不含钙镁的D-Hank’s液（含 青霉素200kU· -1、链霉素200mg· -1）反复冲洗后剪成1~2mm3小块 L L
用吸管吸取均匀排列于培养瓶（预先用含20％胎牛血清DMEM培养液
湿润）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培养箱中培养3h，使其贴壁

先用Hanks液，再用含20%小牛血清的RPMI-1640液冲洗平衡尼龙纤 维柱，冲洗液尽量流净。
将尼龙柱预温37℃，再用配制的单个核细胞悬液2ml装入尼龙纤维 柱，不使流出，37℃温箱内静臵l小时。 取下注射针头，用预温37℃含20%小牛血清的RPM I-1640培养液冲 洗尼龙纤维柱，洗出者即为未黏附的T淋巴细胞。 从注射器内取出尼龙纤维，在4℃的RPMI-1640液内漂洗，并轻轻挤 压，将黏附的B细胞洗脱收集（B淋巴细胞中混有的单核细胞可用贴 壁法将其分离）。 收集的T、B淋巴细胞可分别用Hanks液悬浮，洗涤，离心（250g， 7min），并重复洗涤3次。计算活细胞，计数悬液中的细胞数后制 备所需浓度的T和B淋巴细胞悬液。
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注意事项：

分选细胞常用于细胞亚群进一步的功能研究，因此，整个过程均需 要严格无菌操作，流式细胞仪进行无菌冲洗。

此法分离得到的T细胞纯度可达到99%,收获率可达到90%。
由于喷嘴孔很小（约70～100μm），分选前用30～40μm孔径的滤网 过滤细胞悬液，以免堵塞喷嘴。
Βιβλιοθήκη Baidu
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优缺点：
流式细胞仪分选纯度较高、回收率高，分选一些具有比较复杂细胞标
60min，红细胞沉于管底，上层乳白色混浊液含白细胞。
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血中单个核细胞的分离： 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其相对密度在
1.050-1.077之间，采用速度沉降法原理使其分离。
淋巴细胞分离液
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血中单核细胞的分离： 利用细胞在培养过程中贴壁时间的早晚不同进行细胞分离
多将悬液放入12cm直径的培养 单 个 核 细 胞 悬 液 皿中，于37℃培养箱中静臵3060min。此时单核细胞贴壁，而 淋巴细胞尚未贴壁，倾出未贴 壁细胞，并用Hanks液轻轻冲洗 用Hanks液强 力冲洗吹打与 震荡，将贴壁 计数后
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免疫磁珠法(MACS)分离T、B淋巴细胞：
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4） 为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合 体的固相微粒，即磁性微珠。在液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性 微珠可快速沉降。以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的 特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。
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2. 胶原酶 (Collagenase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用Hanks'平衡液 （HBSS）清洗组织碎片几次
加入胶原酶（50～200单位/ml，溶解在HBSS中）
在37℃孵育4到18小时。加入3mM CaCl2增加解离效率
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通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎

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流式细胞术分离法分离T、B淋巴细胞：

密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×107 /ml； 加适量FITC-抗CD3或FITC-抗CD19，4℃孵育30min, 用RPMI-1640
培养基洗2次；

用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光 参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。

大型流式细胞仪设备且对分
选细胞纯度要求不高的分选。 只适用于简单标记的细胞 分离

分选后细胞适用于后续实验：分选后适用于细胞 培养和体内实验，分选得到的标记和未标记细胞 组分均可回收利用。
从细胞到分子分选：不仅可以分选各种细胞，还 可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、 RNA及mRNA。
稳定、高质量的分选：纯度（90-99%） 对细胞无损伤
分离效率较流式细胞仪分
选略低 且耗材相对较贵，适合无
操作简便、快速：消毒方便，手动分选30分钟内 完成，autoMACS分选2.5-10分钟之内完成。
从实验室到临床：MACS技术可以实现105-1011个 细胞分选。有autoMACS和CliniMACS。
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举例（乳鼠原代心肌细胞培养法）： 基本原理：
心肌细胞培养方法有离体心脏灌注法、酶消化法和组织块法，将心
肌组织分离成单个细胞，用培养基制成心肌细胞悬液，在体外适宜条件 下使之生长繁殖，并保留其结构与功能特性。
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评价：

离体心脏灌注法对乳大鼠来说实施难度大;
酶消化法操作流程长，细胞对消化酶浓度及作用时间要求严格，但
是能得到大量单细胞；

组织块法操作简单，实验成本低，可得到具较高纯度的心肌细胞。
因此，心肌细胞原代培养常用的方法多用酶消化法和组织块法两种。
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心肌细胞的酶消化培养法：
1.心肌组织的选择：
生后1~4天的Wistar乳鼠心脏等。
2.心肌组织块的制备：
分别制
备所需 浓度的
的单核细胞冲
落或用刮刀轻 刮，收集贴壁 的单核细胞。
培养皿以尽量洗下未贴壁细胞
（淋巴细胞）。
细胞悬
液。
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黏附法分离血中单核细胞、T，B淋巴细胞
因B淋巴细胞和单核细胞能黏附于
尼龙纤维柱上（聚酰胺纤维柱），
所以可将其与T淋巴细胞分离。
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具体步骤：

单个核细胞用含20%小牛血清RPMI-1640制成（2.5-3）×107/ml的 细胞悬液。
片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的胶原酶
通过离心在HBSS中清洗悬液几次
再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养
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3.中性蛋白酶(Dispase)
用无菌解剖刀和剪子把剩余组织切成1-2mm3小块，用不含钙镁的平
衡盐溶液清洗组织碎片几次
加入Dispase（0.6～2.4单位/ml 溶解在无钙镁的平衡盐溶液）
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免疫磁性微珠用于细胞的分离和纯化的基本原理及步骤是：首先将抗
特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应
后，利用磁力的作用，使与致敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、 分离的目的。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞
混合液中分离出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞 得以分离。
在37℃孵育20分钟到几个小时。
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通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，分离分散细胞、组织碎
片和较大的碎片。如需进一步的解聚，在碎片中加入新鲜的Dispase
通过离心在平衡盐溶液中清洗悬液几次
再一次在培养基中悬浮细胞，计数和接种细胞，进行培养
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举例（滑膜细胞的胶原酶－胰蛋白酶消化分离法 ）:
动物的骨髓：可以无菌手术采取一段股骨，用灭菌注射器，将小牛血清或培
养液从断端一端加压注射以从另一断端出骨髓。
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制备细胞悬液方法：

将组织块分离（散）成细胞悬液的方法有多种，最常用 的是机械解离细胞法、酶学解离细胞法以及螯合剂解离 细胞法。

从原代组织中获得单细胞悬液的一般方法是酶解聚。细
胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以保持最大的活性。
枸橼酸钠法：先配制2%枸橼酸钠，取0.15-0.2ml加于1ml血液中即 可抗凝；

EDTA法（186.1）：每ml血液中加0.5mmol/L EDTA 2µ l。
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体液标本采集： 在局部70%酒精消毒灭菌后，用灭菌注射器穿刺入体腔 （如胸腔，腹腔，关节腔等）抽取液体样品。
膝关节腔穿刺
胸腔穿刺
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血样中红细胞和白细胞的分离：
无菌取滑膜组织，去除脂肪、纤维等
用D-Hank’s液（无Ca2+、Mg2+，含青霉素200kU· -1、链霉素 L
200mg· -1）反复冲洗后剪成1~2mm3小块，离心洗涤2 次 L
臵于加入2ml含10%胎牛血清、0.4%Ⅱ型胶原酶的DMEM培养液的培 养瓶中，在37℃、5%CO2培养箱中消化2h，每隔10min吹打1 次。
记的细胞时相当有用的，例如要分选出白血病人骨髓中某些
CD34+CD13-CD45dim的幼稚细胞，只需要在流式上简单地逻辑设门就
可以了，而且流式可以双通道分选，也就是同一时间分选出两种细胞， 流式分选成本比磁珠低。
流式分选最致命的缺点就是污染，且设备昂贵，技术复杂，需专业技
术人员操作，操作费时，适合对细胞纯度和回收率要求较高的分选。