Hela细胞传代培养
Hela细胞转染实验报告
Hela细胞的传代培养及生长周期观察HE染色观察高学敏生36 2013012322一、实验背景（一）关于Hela细胞Hela细胞是源自美国妇女Henrietta Lacks的子宫颈癌细胞，取于1951年，属于增殖型表皮癌细胞。
在体外培养条件下，经过筛选，目前实验使用的Hela 细胞为无限细胞系，在适宜条件下可以无限分裂，不会衰退，可以连续传代。
经过六十多年，Hela细胞已经被培养出多个细胞系，它几乎成为细胞生物学中的一种“模式生物”。
似癌细胞的特征，其核型已非二倍体型，而是非整数倍体（aneuploid）。
2013年Andrew Adey等人在Nature发表的研究表明，Hela细胞的基因组相当稳定，可将不同细胞系区分开的点突变和基因拷贝数改变相当少1，这是Hela细胞的一大特点。
（二）原代培养、传代培养、衰退进行细胞体外培养前，最初需要从活体中获得细胞。
从体内获得细胞进行的首次培养为原代培养。
当原代培养细胞增殖达到一定密度后，需要做继代培养，被称为传代培养。
细胞在体外培养过程中的群体生存状况与在完整机体内的生存与衰老死亡基本一致；本次所做的Hela细胞实验为Hela细胞传代实验，即将已长到相当密度的原培养皿中的Hela细胞转移至新培养皿中培养。
在原代培养期，细胞增殖能力弱，第一次传代后，部分细胞可以重新贴壁，此时细胞增殖能力增强；另外亦是为了获得更多的细胞，因此进行传代操作。
培养的组织细胞在体外可以反复传代十几次左右，若传代十几次后细胞进入衰退阶段并死亡，则该细胞系称为有限细胞系；若在衰退阶段，部分细胞的遗传特性发生改变，可以无限传代，则该部分细胞将发展为无限细胞系。
Hela 细胞系即为无限细胞系，已历经六十多年的传代培养。
（三）贴附型细胞与悬浮型细胞在体外培养时，根据细胞能否贴附于支持物上分为贴附型细胞和悬浮型细胞两类。
大多数细胞系属于贴附型细胞，血液中的白细胞和某些癌细胞属于悬浮型细胞。
Hela细胞属于贴附型细胞，它需要贴附于支持物上才可能存活并增殖。
细胞传代培养实验报告
一、实验目的1. 掌握细胞传代培养的基本操作流程。
2. 熟悉细胞传代培养过程中的注意事项。
3. 了解细胞传代培养在生物科学研究中的应用。
二、实验原理细胞传代培养是指将已经生长到一定阶段的细胞，通过特定的方法进行分离、洗涤、消化、计数和稀释等步骤，将细胞转移到新的培养容器中继续培养的过程。
细胞传代培养是维持细胞生长、扩大细胞数量和保持细胞特性的重要手段。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞2. 培养基：DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、10%FBS、PBS缓冲液、酒精4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、移液枪、培养瓶/皿、吸管等四、实验步骤1. 准备阶段（1）将HeLa细胞从培养瓶中取出，用PBS缓冲液轻轻洗涤一次，去除残留的培养基。
（2）准备胰蛋白酶工作液，将其置于37℃水浴中预热。
（3）准备含有10%FBS的培养基，将其置于37℃水浴中预热。
2. 分离细胞（1）用移液枪吸取适量胰蛋白酶工作液，滴加到细胞培养皿中的细胞层上。
（2）将培养皿置于37℃、5%CO2的培养箱中消化2-3分钟。
（3）倒置显微镜下观察细胞，当大部分细胞变圆且亮时，加入等体积含有10%FBS的培养基终止消化。
（4）用移液枪轻轻吹打细胞，使其成为细胞悬液。
3. 计数（1）取适量细胞悬液，使用细胞计数仪或显微镜配合琼脂滴定法计数。
（2）根据计数结果，调整细胞密度至所需的浓度，一般为每毫升105-106个细胞。
4. 传代（1）向含有预热的培养基的离心管中加入细胞悬液，并轻轻混匀。
（2）离心管离心，在1500 rpm速度下离心3-5分钟，以沉淀细胞。
（3）弃去上清液，保留沉淀的细胞。
（4）加入适量的新鲜培养基，将细胞重新悬浮。
（5）将细胞悬液转移到新的培养瓶中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
五、实验结果1. 成功完成细胞传代培养，观察到细胞在新的培养瓶中继续生长。
2. 细胞生长状态良好，细胞密度符合预期。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
《Hela细胞传代培养》课件
细胞数过低
细胞数量太少，可能是由于接 种量太少、营养不足或培养时 间太长等原因导致。可以通过 增加细胞数或更改营养物质来 解决此问题。
将细胞冻存存储，需要在恰当的时机进行复苏。
2 细胞的染色体分析技术
可以使用荧光原位杂交法、karyotyping和CGH等技术来分析细胞的染色体。
3 病毒感染实验技巧
可用于研究病毒的生物学特性、宿主针对病毒的反应等多个方面。
Hela细胞传代培养的应用领域
癌症研究
• 研究癌细胞 • 开发新的抗癌药物 • 探究癌症的发病机制
基因工程
• 研究基因功能 • 进行基因编辑实验 • 疾病的基因诊断和治疗
药物筛选
• 筛选对癌症具有杀伤 力的药物
• 筛选开发新药物的唯 一模型
• 提高药物筛选效率
总结和展望
总结
Hela细胞作为医学研究中最常见的细胞类型 之一，被广泛应用于生命科学领域。
展望
随着技术水平的不断提高，Hela细胞在人类 疾病研究、药物开发等领域的应用前景将广 阔且具有无限潜力。
《Hela细胞传代培养》 PPT课件
欢迎来听我的《Hela细胞传代培养》课程。本课程将会涵盖Hela细胞的来源 和特点，以及传代培养过程、应用领域、实验技巧和常见问题等。
Hela细胞的来源和特点
来源
Hela细胞是从美国Henrietta Lacks的宫颈癌细胞中分离出来的。这些细胞于1951年首次分 离出来，并被广泛应用于医学领域。
特点
Hela细胞具有很高的无限分裂能力和稳定的染色体组成，是许多细胞与分子生物学研究的 理想材料。
应用
这些细胞在癌症、病毒学、基因工程、药物筛选等领域都得到了广泛的应用。
《2024年HeLa细胞长期传代过程中基因组突变动态变化》范文
《HeLa细胞长期传代过程中基因组突变动态变化》篇一一、引言HeLa细胞，作为一种人类宫颈癌细胞系，因其易于培养、繁殖迅速和遗传稳定性等特点，在生物学、医学和遗传学等领域得到了广泛的应用。
然而，随着传代次数的增加，HeLa细胞的基因组会发生突变，这对其生物学特性和应用价值产生了深远的影响。
本文旨在探讨HeLa细胞在长期传代过程中基因组突变的动态变化。
二、材料与方法1. 细胞系与传代本实验采用HeLa细胞系，在标准实验室条件下进行长期传代。
每次传代均严格按照细胞培养的规范操作。
2. 基因组突变检测采用全基因组测序技术，对不同传代次数的HeLa细胞进行基因组突变检测。
3. 数据处理与分析将测序数据导入生物信息学软件，进行数据清洗、比对和突变分析。
三、结果1. 基因组突变类型与数量随着传代次数的增加，HeLa细胞的基因组突变类型和数量均有所增加。
其中，点突变、插入/删除突变和染色体结构变异是主要的突变类型。
2. 突变动态变化在长期传代过程中，HeLa细胞的基因组突变呈现出动态变化的特点。
早期传代时，突变数量较少，类型单一；随着传代次数的增加，突变数量逐渐增多，类型也变得更加复杂。
3. 关键基因突变部分关键基因在传代过程中发生了突变，如肿瘤相关基因、细胞周期调控基因和DNA修复基因等。
这些突变可能影响了HeLa细胞的生物学特性和行为。
四、讨论1. 基因组突变对HeLa细胞的影响基因组突变可能导致HeLa细胞的生物学特性发生改变，如增殖能力、侵袭性和耐药性等。
这些改变可能使HeLa细胞更适合在体外环境下生长和繁殖，从而提高了其在生物学、医学和遗传学等领域的应用价值。
2. 关键基因突变的意义关键基因的突变可能对HeLa细胞的生长、分化和功能产生重要影响。
例如，肿瘤相关基因的突变可能使HeLa细胞具有更强的增殖能力和侵袭性；细胞周期调控基因的突变可能导致细胞周期失控，从而加速细胞的增殖；DNA修复基因的突变可能影响细胞的DNA修复能力，进一步促进基因组的不稳定性。
细胞生物学实验Hela细胞培养
培养基
培养基是维持体外细胞生存和生长的溶液，包括天然培养基和合成 培养基。 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好。 缺点：来源受限，成分复杂，存在批次的差异，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，容易发生支原体污染。 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模 拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI1640、 DMEM等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其 它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。
潜伏期：
此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行 实验研究。
停止期（平台期）：
细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
细胞生物学实验Hela细胞培养
新传代的NRK细胞（大鼠肾细胞） 传代后24小时
对数生长期的NRK细胞 传代后三天
早平台期的NRK细胞 传代后7天
细胞生物学实验Hela细胞培养
贴附生长细胞的生长过程
106
细胞数/毫升
无限细胞系
105
有限细胞系
接种培养
104
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
天
潜伏期
指数增生期
平台期
细胞生物学实验Hela细胞培养
培养细胞生长的条件
细胞生物学实验Hela细胞培养
CLASS II 细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
Hela细胞的传代培养
利用Hela细胞进行药物筛选和毒性测试，评估药物对肿瘤细胞的抑 制作用和安全性。
肿瘤免疫治疗研究
利用Hela细胞研究肿瘤免疫应答机制，为肿瘤免疫治疗提供新的策 略和靶点。
基因治疗与细胞治疗
利用Hela细胞作为载体或靶细胞，开展基因治疗和细胞治疗的研究， 为遗传性疾病和肿瘤等疾病的治疗提供新途径。
Hela细胞的传代培养
目录
• 引言 • Hela细胞的传代培养过程 • Hela细胞传代培养的注意事项 • Hela细胞传代培养的应用 • 未来展望
01 引言
背景介绍
01
Hela细胞，也称为海拉细胞，是 一种源自子宫颈癌的细胞系，是 医学和生物学研究中广泛使用的 细胞模型。
02
Hela细胞的传代培养是维持其生 长和活性的重要手段，对于研究 癌症、病毒、药物筛选等领域具 有重要意义。
记录细胞生长曲线
通过绘制细胞生长曲线，了解细胞的生长规律和倍增时间。
观察异常情况
如发现细胞出现死亡、变形、颜色变化等异常情况，应及时采取 措施处理。
04 Hela细胞传代培养的应用
生物学研究
细胞生物学
Hela细胞是研究细胞增殖、分化、凋亡等基本生物学过程的良好模型，有助于深入了 解细胞生命活动的机制。
细胞培养环境的维持
温度
细胞生长需要稳定的温度环境，一般维持在37°C。
湿度
湿度过高会导致细菌滋生，湿度过低则会导致细胞干燥。
气体环境
细胞培养瓶内的气体环境需保持95%空气(细胞代谢必需的)和5% 的${CO}_{2}($维持培养基的酸碱度)。
细胞的观察与记录
观察细胞的生长状态
通过显微镜观察细胞的形态、密度和生长速度，判断细胞的生长 状态。
海拉细胞培养流程
海拉细胞培养流程目的及应用：用于细胞传代试剂及设备：培养基，0.25%胰酶，75%酒精，95%酒精，细胞培养箱，超净台，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤：一．实验前准备工作超净台的操作步骤：先开紫外线再开灯光最后开吹风进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．准备实验先关闭紫外灯30min后再进行实验；75%酒精喷于纱布上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
取下用后的移液管3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL DMEM培养液终止消化。
反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。
4．离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
细胞学实验报告5_Hela细胞的传代和HE染色
细胞学实验报告五Hela细胞的传代和HE染色生96 华以超2009030049同组姓名：赵宇实验日期：2010.11.11-13一、实验原理：苏木精(hematoxylin)：为从苏木中提取。
苏木精本身不是染料，不能直接染色，必须经氧化才能染色。
可以在空气中自然氧化，但需时很长，所以一般都是加氧化剂（如碘酸钠）氧化。
同时，被染材料又须经媒染剂作用后才有着色能力，所以在配制苏木精染液时，都加有媒染剂。
苏木精液主要着染细胞核。
有数种不同配方的苏木精液。
伊红(eosin)，又分几种，如伊红Y、伊红B等。
对细胞质、肌纤维、胶原纤维具有着色性。
一般用0.5%伊红/70%乙醇液或1%伊红水溶液。
由于苏木精着染细胞核，伊红着染细胞质，所以这种方法称为双重对比染色法。
二、实验步骤：1．传代培养（操作环境：超净台）⑴镜检，观察并记录细胞状态；⑵吸弃培养基，加入1mL PBS 溶液洗去残余培养基，重复进行一次（吸管口不可以接触培养瓶口，加液时不要直接冲击细胞层）；⑶向培养皿内滴加200uL 胰酶－EDTA 消化液，37ºC 消化约1-2 min；⑷观察细胞开始脱离器壁时，加入500uL 含10％血清的DMEM培养基终止消化，反复吹吸（吹吸时不要产生气泡），冲洗细胞层（洗到每个角落），以充分悬浮细胞；⑸分盘，并补充培养基至1.5ml，进行传代培养用于以后的实验。
缓慢、柔和的摇晃培养盘，使得每盘细胞分散尽可能均匀；37ºC、5％CO2培养；2．HE染色⑴镜检，观察并记录细胞状态，选取生长相对稀疏的一盘准备HE 染色；⑵吸弃旧的培养液，用PBS（1mL）漂洗2 次；⑶用Carnoy 固定液固定15min；⑷吸弃固定液，用蒸馏水漂洗一次；⑸加入苏木精染液（1mL，可重复使用）染色十数分钟（随时镜检，以确定染色时间）；⑹用流动的自来水洗去浮色；⑺加入0.5%的盐酸酒精溶液分色数秒（至细胞质近无色）；⑻再用流动的自来水水洗；⑼ 加入适量 0.5%的氨水返蓝处理（数十秒）（作用于苏木精染剂）；⑽ 用流动的自来水洗一次，观察细胞染色效果；如效果较好，以蒸馏水漂洗；⑾ 加入伊红溶液染色数秒后立即弃去；⑿ 用蒸馏水洗涤 1‐2 次；⒀ 观察（细胞核呈紫色、细胞质呈粉红色，层次感分明）并照相记录。
hela细胞的培养传代
hela细胞的培养条件为:高糖DMEM培养基,100ml/l胎牛血清;培养液中一般血清含量为10%传代步骤: 1．倒去细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用顷倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)2．吸取适量的PBS加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去重复一次,以清于血清成分,利于胰酶消化3．加入适量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培养皿可加入1ml，15cm 培养瓶加入5-8滴）转动培养瓶，使其湿润整个细胞房，高温下消化2-3分钟。
翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可顷去消化液，如消化程度不够可延长消化时间，或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作4．加入适量培养液终止消化吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下轻轻吹打，混匀，成细胞悬液取样计数，调整细胞浓度为5′10 /ml15cm 培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好,置37°C 孵箱中培养。
传代的天数要以HELA细胞的生长密度为基础,细胞密度大了就要传,应该每天观察HELA细胞,注意其生长状态.HELA细胞的生长分5期:游离期细胞经消化分散后，由于愿生质收缩及细胞弹性，细胞成圆形，折光性强，呈悬浮状态。
吸附期接种24小时后，由于细胞的附壁特性，开始贴壁，圆形细胞变成延展状态。
繁殖期细胞快速生长、分裂，形成细胞岛直至细胞单层。
维持期细胞形成单层后生长与分裂减缓、折光性减弱，细胞内颗粒增多，由于代谢物的积累，CO2增多，培养液变黄。
衰退期如不及时换液和传代，由于营养缺乏、代谢物积累，细胞内颗粒进一步增多,立体感差，细胞皱缩、脱落、逐渐衰老死亡。
应该在其维持期和衰退期及时换液.一般而言是4天换一次液.。
Hela细胞的传代培养
教学目标
1.理解细胞传代培养的概念和原理 2.能按照操作规程进行细胞传代培养的操作
细胞传代培养的概念
概念：指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比率转移，接 种到另外的培养瓶中的培养，也叫做继代培养。
HeLa细胞是一种贴壁生长的细胞，在进行传代时通 常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代。
培养细胞一代生长过程
实验前准备
1、材料： HeLa细胞
2、试剂： 0.25％胰蛋白酶、1640培养基〔含10％ 小牛血清〕、PBS
实验前准备
3.仪器设备
超净工作台
CO2培养箱
倒置显微镜
实验前准备
3.仪器设备
离心机
恒温水浴锅
实验前准备
3.仪器设备
培养瓶，移液管，酒精灯，酒精棉球， 试管架，记号笔等。
Thankyou
分装
实验操作本卷须知
1.用电安全 2.操作仪器安全 3.及时标准记录
HeLa细胞传代培养实验原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱 和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩 大，就必须进行传代〔再培养〕。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法 。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过 程。贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
消化前细胞
消化后细胞 〔适度状态〕
吸除消化液
细胞传代操作
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液。
吹打成细胞悬液
细胞传代操作
5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基， 并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻 摇匀，置于37℃ CO2培养箱培养〔如果瓶盖不带 通气孔，则需将瓶盖旋开半圈〕。24h后即可对 细胞的生长情况进行观察记录。当细胞长成单层 后即可用于接种或冻存。
海拉细胞培养流程
海拉细胞培养流程目的及应用：用于细胞传代试剂及设备：培养基，0.25%胰酶，75%酒精，95%酒精，细胞培养箱，超净台，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤：一．实验前准备工作超净台的操作步骤：先开紫外线再开灯光最后开吹风进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．准备实验先关闭紫外灯30min后再进行实验；75%酒精喷于纱布上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
取下用后的移液管3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mL DMEM培养液终止消化。
反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。
4．离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
Hela细胞传代培养
培 养 板
常用玻璃器皿清洗
浸泡（自来水）、刷洗 （洗衣粉）、酸泡（24小 时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和 冲洗、50℃烘干
清洁液的配制
HeLa 是Henrietta Lacks的简称， Henrietta Lacks 是 一位患有子宫颈癌的 美国妇女的名字，在 她死后，该细胞走被 广泛散发到各研究机 构，并无限次地繁殖 分裂下去。
酚 红 液
D-Hanks D-Hanks 100ml 896ml 4ml
三 蒸 水
0.5%
原 液 工 作 液 试 剂 配 方
三磷氯 磷氯 细 蒸酸化︶酸化 胞 水二钾 氢钠 培 氢 二 原 养 钾 钠 液 用 ︵ 试 液 剂 的 配 配 方 制
2 D-Hanks 80.0g Na HPO ·2H O 0.6g 4.0g 0.6g 1000ml
人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞 生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、 铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷 析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分
一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不 死．但支持细胞生长一般需加 10％血清． 对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复 杂成分至今尚未完全清楚． 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或 毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性 是细胞和复杂血清因子的综合反应。 在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用 无血清培养基培养细胞．
Hela细胞的传代培养
吹打成细胞悬液
细胞传代操作
5、以1：2或1：3进行分装，补充新鲜培养基， 并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻 摇匀，置于37℃ CO2培养箱培养（如果瓶盖不带 通气孔，则需将瓶盖旋开半圈）。24h后即可对 细胞的生长情况进行观察记录。当细胞长成单层 后即可用于接种或冻存。
分装
实验操作注意事项
HeLa细胞的传代培养
教学目标
细胞传代培养的概念
概念：指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比率转移Байду номын сангаас接 种到另外的培养瓶中的培养，也叫做继代培养。
HeLa细胞是一种贴壁生长的细胞，在进行传代时通 常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代。
培养细胞一代生长过程
实验前准备
实验前准备
超净工作台
CO2培养箱
倒置显微镜
实验前准备
（1）细胞培养用的器材和试剂灭菌； （2）超净工作台准备（75%酒精擦拭台面，紫外灯 照射30min）； （3） 试剂预热（37℃水浴锅）； （4）操作人员准备 （75%酒精擦拭双手等）。
细胞生存环境：无菌、无毒
细胞传代操作
1、倒去培养瓶中的旧培养液，加入2-3mL预热的 PBS液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞 表面的碎片。
吸除培养液
细胞传代操作
加消化液
细胞传代操作
3、盖紧瓶盖，放在倒置镜下观察细胞。随着时 间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未 漂起时将消化液弃去，加入适量预热后的培养液 终止消化。（一般消化时间约为2-3分钟）。
消化前细胞
消化后细胞 （适度状态）
吸除消化液
细胞传代操作
4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液。
HeLa细胞传代培养实验原理
《2024年HeLa细胞长期传代过程中基因组突变动态变化》范文
《HeLa细胞长期传代过程中基因组突变动态变化》篇一一、引言HeLa细胞，由美国细胞生物学家乔治·盖伊·盖特福雷斯特·海因德尔于1951年从一位宫颈癌患者身上分离出来，因其具有独特的生长特性和稳定性，成为生物学和医学研究中广泛使用的细胞模型。
然而，随着传代次数的增加，HeLa细胞的基因组会发生突变，这对其遗传稳定性和生物学特性产生深远影响。
本文旨在探讨HeLa细胞在长期传代过程中基因组突变的动态变化。
二、研究方法本研究采用全基因组测序技术，对HeLa细胞进行长期传代过程中的基因组突变进行检测和分析。
具体方法包括：1. 细胞培养与传代：在实验室条件下，对HeLa细胞进行长期传代培养。
2. 基因组测序：采用全基因组测序技术，对不同传代次数的HeLa细胞进行基因组测序。
3. 数据处理与分析：对测序数据进行处理和分析，包括突变检测、突变类型分析、突变位点分布等。
三、结果通过对HeLa细胞长期传代过程中的基因组突变进行检测和分析，我们发现了以下动态变化：1. 突变类型与数量：随着传代次数的增加，HeLa细胞的基因组突变数量逐渐增多。
突变类型主要包括点突变、插入突变、删除突变等。
其中，点突变是主要的突变类型。
2. 突变位点分布：基因组突变的位点主要分布在编码区和非编码区。
在编码区，突变可能导致基因功能的改变或蛋白质结构的改变；在非编码区，突变可能影响基因的表达调控。
3. 基因功能与表达：某些关键基因的突变可能导致HeLa细胞的生物学特性和功能发生改变，如细胞增殖、凋亡、侵袭等。
此外，基因表达水平的改变也可能影响细胞的生长和分化。
4. 染色体稳定性：随着传代次数的增加，HeLa细胞的染色体稳定性逐渐降低，可能导致染色体数目和结构的异常。
四、讨论HeLa细胞的基因组突变对其生物学特性和功能产生深远影响。
首先，基因组突变的积累可能导致细胞遗传不稳定性的增加，从而影响细胞的生长和分化。
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合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、 无机盐和其它一些辅助物质。
4ml
D-Hanks工作液试剂配方
D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml
消化液：
胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞
间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。
胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细
胞。
胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配
原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
培养细胞的特性
贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生 长。见于各种实体瘤细胞。
悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持
物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
液后再混匀传代。
直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／ 2一2／3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。
2.悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接 吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。
3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。
胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
用含血清培养液终止其对细胞的消化作用
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和 合成培养基。
天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。
1 细胞的营养需要
2 细胞的生存环境
温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染
4 无毒
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5 ％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意 的问题：
Hela细胞传代培养
实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理 和方法。
实验用具：离心管（2支），移液枪（每个 台面一把），枪头（每个台面一盒），吸 管（4根），培养皿（每组2个）
实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640 培养基
培养板Biblioteka 常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干
配配 方制
剂的
细 胞 培 养 用 液
2
原 液 试
D-Hanks
蒸三酸磷化氯）酸磷化氯 水二钾 氢钠
氢二 钾钠
（
80.0g Na HPO ·2H
O 0.6g 4.0g 0.6g 1000ml
配 方
剂
工 作 液 试
D-Hanks
三 蒸 液红酚 水 液 原
D-Hanks 100ml
896ml
0.5%
一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清．
对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的 复杂成分至今尚未完全清楚．
血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子 或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学 特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。
在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要 用无血清培养基培养细胞．
无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因 子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。
无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。
1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近 20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和 增殖。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶 盖微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
（90 ℃ ，14 h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水 槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸 发。
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种 1悬浮生长细胞传代
离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏 期一般为6～24小时。
对数生长期：
细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。
停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性
培养细胞生长的条件
游离期
细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球 形。
10分钟一4小时
贴壁期
细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分 钟一4小时贴壁。
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原 等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促 贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴 壁因子的附着。
清洁液的配制
HeLa 是Henrietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名 字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各 研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。
细胞培养的甚本概念
传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分 开接种到新的培养器皿中。
优点：标准化生产，组分和含量相对固定。 成本低
缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要。
人工合成培养基只能维持细胞生存， 要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量 的天然培养基（如血清）。
血清中含有：
①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素； ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 ⑤各种生长因子 ⑥转移蛋白 ⑦不明成分