淀粉酶的分离纯化上——浸提、盐析、透析、浓缩

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。

二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。

因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。

主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。

淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。

产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。

三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。

淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。

牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。

4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。

四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。

（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。

用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。

酶的分离纯化方法介绍

酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。

关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。

这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。

这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。

生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。

因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计一、教学目标1. 知识与技能：了解淀粉酶的性质和功能。

掌握淀粉酶的分离纯化方法和原理。

学会使用常用的实验仪器和操作技术。

2. 过程与方法：通过实验操作，掌握淀粉酶的分离纯化过程。

培养学生的实验操作能力和实验观察能力。

培养学生的数据分析能力和科学思维。

3. 情感态度价值观：培养学生对生物学实验的兴趣和热情。

培养学生珍惜实验结果，严谨治学的态度。

培养学生团队合作和交流分享的意识。

二、教学内容1. 淀粉酶的性质和功能介绍淀粉酶的定义、结构和功能。

讲解淀粉酶在生物体内的作用和意义。

2. 淀粉酶的分离纯化方法介绍常用的淀粉酶分离纯化方法，如电泳、色谱法等。

讲解各种方法的原理和优缺点。

3. 实验操作步骤讲解实验操作的步骤和注意事项。

示范实验操作，引导学生进行实验。

4. 实验结果分析教授学生如何观察实验结果。

教授学生如何进行数据分析，如酶活性、酶浓度的计算等。

三、教学方法1. 讲授法：讲解淀粉酶的性质、分离纯化方法和实验操作步骤。

2. 实验操作法：学生分组进行实验操作，教师巡回指导。

3. 小组讨论法：学生分组讨论实验结果和数据分析。

四、教学评价1. 学生实验操作的准确性和规范性。

2. 学生实验报告的质量，包括实验结果的准确性、数据分析的合理性和实验讨论的深度。

3. 学生在课堂上的参与程度和提问回答的正确性。

五、教学资源1. 实验材料：淀粉酶提取液、试剂、实验仪器等。

2. 实验仪器：离心机、电泳仪、色谱仪等。

3. 教学课件和资料：淀粉酶的性质、分离纯化方法、实验步骤等。

4. 参考书籍和论文：关于淀粉酶分离纯化的相关研究。

六、教学实施1. 课前准备：教师准备好实验材料和仪器，确保实验能够顺利进行。

2. 课堂讲解：教师讲解淀粉酶的性质、分离纯化方法和实验操作步骤，引导学生理解实验原理。

3. 实验操作：学生分组进行实验操作，教师巡回指导，确保实验安全并进行解答学生的问题。

4. 实验结果分析：学生观察实验结果，进行数据分析，教师进行讲解和指导。

土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。

2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。

3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。

二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。

3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。

2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计一、教学目标1. 让学生了解淀粉酶的性质和功能。

2. 掌握淀粉酶的分离和纯化的基本方法。

3. 培养学生的实验操作能力和科学思维。

二、教学内容1. 淀粉酶的性质和功能2. 淀粉酶的分离和纯化方法a. 样品处理b. 离心分离c. 凝胶过滤d. 离子交换色谱e. 亲和色谱3. 实验操作步骤和注意事项三、教学重点与难点1. 教学重点：淀粉酶的性质和功能，淀粉酶的分离和纯化方法。

2. 教学难点：实验操作步骤和注意事项。

四、教学方法1. 讲授法：讲解淀粉酶的性质和功能，淀粉酶的分离和纯化方法。

2. 实验法：进行淀粉酶的分离和纯化实验。

3. 讨论法：引导学生探讨实验结果，分析实验问题。

五、教学准备1. 实验材料：淀粉酶溶液，凝胶，离子交换树脂，亲和树脂等。

2. 实验器材：离心机，凝胶过滤柱，离子交换色谱柱，亲和色谱柱等。

3. 教学课件：淀粉酶的性质和功能，淀粉酶的分离和纯化方法。

六、教学过程1. 引入：通过讲解淀粉酶在生物体内的作用和应用，引起学生对淀粉酶分离纯化的兴趣。

2. 讲解：详细讲解淀粉酶的性质和功能，以及分离纯化的方法和原理。

3. 实验演示：进行淀粉酶的分离纯化实验，讲解实验步骤和操作要点。

4. 学生实验：学生分组进行实验，操作离心机、色谱柱等实验器材。

5. 讨论：学生展示实验结果，讨论实验中遇到的问题和解决方法。

6. 总结：总结淀粉酶分离纯化的方法和步骤，强调实验操作的注意事项。

七、实验步骤1. 样品处理：取一定量的淀粉酶溶液，加入适量的缓冲液，调节pH值。

2. 离心分离：将处理后的样品放入离心机，进行高速离心，分离出上清液和沉淀。

3. 凝胶过滤：将上清液通过凝胶过滤柱，根据淀粉酶的分子大小分离出不同组分。

4. 离子交换色谱：将凝胶过滤后的样品通过离子交换色谱柱，根据淀粉酶的电荷性质分离出不同组分。

5. 亲和色谱：将离子交换色谱后的样品通过亲和色谱柱，根据淀粉酶的特异性结合分离出目标组分。

简述淀粉酶解法的工艺流程

淀粉酶解法工艺流程简述
一、准备阶段
1.原料准备
确保淀粉供应充足
准备水和其他添加剂
2.设备检查
检查酶解设备和配套设备状态
确保设备清洁和正常运行
3.环境准备
清洁操作场地
调节环境温湿度适宜
二、酶解过程
1.原料混合
将淀粉与适量水混合
添加调节pH值的酸碱剂
2.加酶酶解
加入淀粉酶
控制酶解温度和时间
3.反应结束
根据需要停止酶解反应
冷却淀粉酶解液至室温
三、分离与提取
1.液固分离
过滤或离心分离液体与固体淀粉残渣2.酶提取
对液体部分进行进一步酶提取
可采用浓缩、纯化等方法
四、精制与后处理
1.澄清
通过澄清剂去除淀粉酶解液中的浑浊物2.浓缩
将酶解液浓缩至所需浓度
3.灭酶
对酶解液进行加热或添加抑制剂灭活酶
五、成品处理
1.包装
根据产品性质选择合适的包装方式
2.标签贴附
贴上产品标签和相关信息
3.成品储存
存放于干燥、阴凉、通风的库房中。

α-淀粉酶的生产工艺

a-淀粉酶的发酵生产工艺扌商要：a•淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，a•淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1•菌种的选育1. 1细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10乞10-\10腐分别涂布到淀粉培养基上，27C倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1. 2紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min.4min.6min、8min.10min,每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37C培养48h,分别计•数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量（包/ml）,在一定pH值的缓冲液中30T恒温振荡处理1~4h°③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉B丫液体培养基中，30E培养36ho⑥用2#定性滤纸制成5mmdisc（小圆纸片），并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素（抑菌）。

倒入200mmx300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5mmdisc纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37C,24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc,用相对应的1ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。

高活性_淀粉酶的分离与纯化_凌家俭

SUZHOU UNIVERSITY JOURNAL OF MEDICAL SCIENCE 2009；29(5)高活性α-淀粉酶的分离与纯化凌家俭,王宁,王林涛（南京医科大学生物化学与分子生物学系，江苏南京210029）摘要：目的研究高活性α-淀粉酶分离与纯化的新方法。

方法运用吸附树脂和离子交换的方法，分离纯化α-淀粉酶。

结果吸附树脂分离纯化所得α-淀粉酶的活性约为60000U/g ，DEAE-纤维层析所得α-淀粉酶的活性在吸附树脂法的基础上提高了约1倍。

结论该方法分离纯化α-淀粉酶简便，成本低，便于工业化生产。

关键词：α-淀粉酶；离子交换法；发酵液；吸附树脂中图分类号：R34文献标识码：A 文章编号：1673-0399（2009）05-0930-03A New Preparation Method of α-Amylase with High ActivityLING Jia -jian ，WANG Ning ，WANG Lin -tao(Dept of Biochemistry and Molecular Biology,Nanjing Medical University,Jiangsu Nanjing 210029,China)Abstract:Objective To improve the purification method of α-amylase with high activity.Methods Absorbent resin method and DEAE -sephadex chromatography method was used to purify low activity of α-amylase.Results α-amylase was able to be purified up to 60000U/g with absorbent resin method.This activity was able to be doubled with DEAE -sephadex chromatography method.Conclusion This method is simple and convenient to be used in practice.Key words:α-amylase ；ion exchange ；fermentation broth ；absorbent resin基金项目：南京医科大学校基金资助项目（NY02071）收稿日期：2009-06-20作者简介：凌家俭（1974-），男，江苏常州人，理学博士，现在江苏省科学技术厅工作。

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。

二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。

因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。

主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。

淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。

产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。

三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。

淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。

牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。

4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。

四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。

（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。

用一支1mL 的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计一、实验目的1. 学习进行微生物的分离纯化技术；2. 了解产淀粉酶菌的特性及其分布情况；3. 掌握酶活性的测定方法。

二、实验原理1. 淀粉酶的作用原理：淀粉酶是一种酶，能够分解淀粉为糖类，在微生物领域中，主要用来测定产淀粉酶菌的酶活性。

2. 微生物的分离纯化：通过微生物分离鉴定方法可以筛选出产淀粉酶菌，并进行分离纯化，其中包括表面接种法、液体菌种鉴定法等。

三、实验步骤1. 采样：采取合适的方法选择样品进行采取，如土壤样品、水样、废弃物等；2. 培养：将采取的样品进行接种并培养于适宜的菌种培养基中，环境条件应符合产淀粉酶菌的生长需求；3. 分离：通过常规分离方法进行分离，如表面接种法，可将菌落形态清晰的约8-10个菌落分别转移到其它培养基上，进行单菌落质量检查，然后进行挑选；4. 鉴定：对于产淀粉酶菌的鉴定有多种方式，如细菌形态、生理生化反应等；5. 纯化：将鉴定出的产淀粉酶菌进行分离纯化，可采用多种方法，如悬浮液稀释、柠檬酸-NaOH柱层析，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

四、实验注意事项1. 实验操作要严格遵守微生物的安全操作规范；2. 实验过程中要严格控制温度、湿度等环境条件，以保证产淀粉酶菌的正常生长；3. 实验设备、试剂应做好消毒处理；4. 对实验中出现的不明菌落应及时进行鉴定和处理；5. 实验后要做好设备及消毒剂的清洗工作。

五、实验结果分析1. 产淀粉酶菌分离纯化后可进行酶活性测定，得出具体的酶活性值；2. 酶活性值与产淀粉酶菌的菌种、产生淀粉酶的量等因素相关；3. 实验结果可反映出产淀粉酶菌的分布情况及其产酶的峰值期等信息。

六、实验拓展1. 可通过实验数据，筛选产酶量高的淀粉酶菌进行进一步研究开发；2. 可实验条件、测定方法等进行改进，提高产淀粉酶菌的分离纯化效率及酶活性测定准确度。

七、实验结论通过对产淀粉酶菌的分离纯化和酶活性测定，可以研究淀粉酶的特性及其在工业、农业等方面的应用，为淀粉酶的开发应用提供物质基础。

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。

二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。

因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。

主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。

淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。

产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。

三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。

淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。

牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。

4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。

四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。

（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。

用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。

土壤中产淀粉酶菌株的分离纯化及鉴定

土壤中产淀粉酶菌株的分离、纯化与鉴定及高活力淀粉酶菌株的筛选一实验目的1．掌握土壤中分离产淀粉酶菌株的方法。

2．进一步掌握和熟练无菌操作技术。

3．掌握分离纯化微生物的方法。

4．学习和掌握高活力淀粉酶具菌株的筛选方法及原理。

二实验原理在土壤中从在多种可产淀粉酶的菌种，并且芽孢杆菌是不错的菌种，因此，采集土样，对土壤中的芽孢杆菌进行分离纯化，就可得到理想菌株。

在菌株的初选过程中采用涂布平板法，把配好的培养基灭菌后倒成平板，再把稀释好的土样涂布到平板上，置于适宜的条件下进行培养。

24h后对其进行鉴定，鉴定的方法是在培养好的菌株上滴加碘液，周围出现透明圈的为产淀粉酶的菌株，并且透明圈与菌落直径的比值越大，说明菌种越纯或菌株的生产性能越高。

然后再进行复选，复选时采用平板划线法或斜面划线法，挑取的菌落为透明圈与菌落直径比值较大的，进行多步筛选就可得到较纯的菌株。

枯草芽孢杆菌能产生淀粉酶，因此昆仑生化公司淀粉酶生产车间周围采集的土壤稀释，再用涂布平板法对菌株进行初步培养，在培养出的菌落周围滴淀粉溶液，对周围出现透明圈的菌落在进行平板划线培养，在地如淀粉溶液鉴定，对周围出现透明圈的菌落进行斜面划线培养，就可得到较纯的产淀粉酶的菌株。

三实验器材与材料3.1 实验仪器：培养皿20个（8个做菌株的培养，其余的做筛选及分离纯化）、三角瓶（250ml 3个，100ml 6个）、试管14支（8支稀释时用，6支做斜面）、移液管14支（稀释样液）、100ml量筒、吸耳球、涂布棒、玻璃棒、酒精灯、接种环、烧杯等。

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、无菌操作台、恒温水浴锅、摇床、电炉、天平等。

3.2 实验材料：1.固体培养基配制：可溶性淀粉2%、蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、琼脂条20g、水1000ml。

2.液体培养基配制：蛋白胨10g、氯化钠5g、牛肉膏3g、水1000ml3.3 ：其它棉花、棉绳、纱布等3.4土壤采集：采土样地点选好后，用小铲子去除5厘米表土，取离地面5-15厘米的土样10-25g，盛于预先灭菌的牛皮纸袋中扎紧，并标注时间及地点土样采集时间：2012年5月12日土样采集地点：甘肃省张掖市昆仑生化公司淀粉生产车间周围四实验步骤4.1 实验流程：配制培养基→土样采集→制备菌悬液→菌株的初选（涂布平板）→鉴定→平板划线纯化→选育→筛选高产淀粉酶菌株4.2初选：4.2.1 淀粉培养基的配制分别称取可溶性淀粉12g、蛋白胨6g、氯化钠3g、牛肉膏1.2g、琼脂条12g，放入烧杯中，用自来水定容至600ml，加热使之全部溶解（琼脂条用剪刀剪碎后加入）后装入三角瓶中。

《产淀粉酶菌的分离纯化》实验方案设计

产淀粉酶菌株的分离纯化一、实验目的1. 掌握产淀粉酶菌种的分离纯化的原理和方法技术；2. 巩固十倍稀释法。

二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物主要的菌源。

因此本实验选择从土壤中分离出产淀粉酶菌种，再进行纯培养。

主要运用富集培养技术，稀释涂布平板法和平板划线分离法及无菌操作技术获得我们所需要的产淀粉酶菌种。

淀粉酶作用于淀粉时，打开了淀粉分子的糖苷键，从而使淀粉失去粘性，同时使其失去了与碘的显色反应能力，不再与碘结合，从而形成透明圈。

产淀粉酶菌株在选择培养基上培养后，会水解淀粉形成水解圈，加碘液染色后，水解圈尤为明显。

三、实验材料1. 菌种：从自然界筛选获得的淀粉酶产生菌种2. 土壤样品：从栽种土豆的菜园中采集土壤样品3. 培养基：淀粉液体培养基（50mL）：蛋白胨0.5g，NaCl 0.25g，牛肉膏0.25g，可溶性淀粉0.1g，蒸溜水50mL。

淀粉琼脂培养基(200mL)：蛋白胨2g，NaCl 1g，牛肉膏1g，可溶性淀粉0.4g，蒸溜水200mL，琼脂3-4g。

牛肉膏蛋白胨培养基(200mL)：蛋白胨2g，牛肉膏0.6g，NaCl 1g，琼脂3-4g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2。

4.其他用品：酒精灯、移液枪（20-200uL）、接种环、试管架、三角涂布棒（各一个），电子天平、三角烧瓶（5个）、试管（10支）、培养皿（15个）、1mL移液管（10支）、10mL移液管(1支)、无菌水（200mL）、微波炉、卢戈氏碘液。

四、试验方法1．样品采集用无菌报纸，在栽有土豆的菜园里，从不同的采样点采取土样约15g。

（注意应采取距地表2-3cm以下的土样）2．富集培养取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振动20min，使土样与水充分混合，使微生物分散开。

用一支1mL的移液管移取1mL土样液，加入到盛有50mL淀粉液体培养基的三角瓶中进行富集培养，摇床110r/min，37℃，培养24h。

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计作为一名专为他人授业解惑的人民教师，通常需要用到教案来辅助教学，借助教案可以有效提升自己的教学能力。

来参考自己需要的教案吧！下面是小编整理的生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计，欢迎大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。

一、目的和要求1.掌握盐析法初步分离纯化蛋白质的原理和方法；2.掌握透析脱盐浓缩蛋白质的原理和方法。

3.掌握膜分离原理和方法二、基本原理1.蛋白质的盐析蛋白质是亲水胶体，借水化膜和同性电荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白质带负电荷）维持胶体的稳定性。

由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当向蛋白质溶液中加入少量碱金属或碱土金属的中性盐类[如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等]时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大，因此蛋白质、酶等在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加，此时称为盐溶；当盐浓度不断上升并达到一定浓度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。

由盐析所得的蛋白质沉淀，经过透析或用水稀释以减低或除去盐后，能再溶解并恢复其分子原有结构及生物活性，因此由盐析生成的沉淀是可逆性沉淀。

盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

盐析法对于许多非电解质的`分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。

2.透析脱盐的原理蛋白质的分子很大，其颗粒在胶体颗粒范围（直径1～100nm）内，不能透过半透膜。

选用孔径合宜的半透膜，使小分子物质能够透过，而蛋白质颗粒不能透过，这样就可使蛋白质和小分子物质分开。

把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的两端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计一、教学目标：1. 理解淀粉酶的概念及其在生物体内的作用。

2. 掌握淀粉酶的分离和纯化方法。

3. 能够运用实验技能独立完成淀粉酶的分离纯化过程。

4. 培养学生的实验操作能力和团队协作能力。

二、教学内容：1. 淀粉酶的概念及其作用2. 淀粉酶的分离纯化方法a. 样品处理b. 离心分离c. 凝胶过滤d. 离子交换色谱e. 高效液相色谱3. 实验操作步骤及注意事项4. 结果分析与评价三、教学方法：1. 讲授法：讲解淀粉酶的概念、作用以及分离纯化方法。

2. 实验法：学生分组进行实验，实践淀粉酶的分离纯化过程。

3. 讨论法：学生之间交流实验结果，探讨实验中遇到的问题。

四、教学准备：1. 实验材料：淀粉酶样品、缓冲溶液、凝胶、色谱柱等。

2. 实验仪器：离心机、凝胶过滤柱、离子交换色谱仪、高效液相色谱仪等。

3. 教学课件：淀粉酶分离纯化过程的演示文稿。

五、教学过程：1. 引入新课：讲解淀粉酶的概念及其在生物体内的作用。

2. 讲解分离纯化方法：介绍淀粉酶的分离纯化方法，包括样品处理、离心分离、凝胶过滤、离子交换色谱和高效液相色谱。

3. 演示实验操作：展示淀粉酶分离纯化实验的操作步骤，讲解注意事项。

4. 学生分组实验：学生分组进行实验，实践淀粉酶的分离纯化过程。

5. 结果分析与评价：学生交流实验结果，讨论实验中遇到的问题，教师进行点评和指导。

注意：本教案仅供参考，具体实验操作步骤和教学内容可根据实际情况进行调整。

在教学过程中，要注意学生的安全操作，避免实验事故的发生。

六、实验原理：1. 淀粉酶是一种酶类，能够催化淀粉分解为糊精和葡萄糖。

2. 通过对淀粉酶的分离纯化，可以得到较纯的淀粉酶样品，从而研究其性质和功能。

七、实验步骤：1. 样品处理：取一定量的淀粉酶样品，加入适量的缓冲溶液，搅拌均匀。

3. 凝胶过滤：将上清液通过凝胶过滤柱，根据淀粉酶的分子量大小，选择合适的凝胶和柱尺寸。

4. 离子交换色谱：将凝胶过滤后的样品通过离子交换色谱柱，根据淀粉酶的电荷性质，选择合适的树脂和缓冲溶液。

生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计

一、教案基本信息生物材料中分离纯化淀粉酶教案设计课时安排：2课时（90分钟）教学目标：1. 了解淀粉酶的性质和作用；2. 掌握淀粉酶的分离纯化方法和步骤；3. 培养学生的实验操作能力和科学思维。

教学重点：1. 淀粉酶的性质和作用；2. 淀粉酶的分离纯化方法和步骤。

教学难点：1. 淀粉酶的分离纯化方法的选择和操作；2. 实验结果的分析和解释。

二、教学内容和过程第一课时1. 导入（10分钟）教师通过介绍淀粉酶的性质和作用，引发学生对淀粉酶分离纯化的兴趣。

2. 理论讲解（15分钟）教师讲解淀粉酶的分离纯化方法和步骤，包括样品处理、酶提取、酶纯化等。

3. 实验操作演示（20分钟）教师演示淀粉酶分离纯化的实验操作，包括样品处理、酶提取、酶纯化等。

第二课时1. 实验操作（30分钟）学生按照实验步骤进行淀粉酶分离纯化实验操作，教师巡回指导。

2. 实验结果分析（20分钟）学生展示实验结果，教师引导学生分析和解释实验结果，巩固所学知识。

三、教学评价2. 课堂表现：观察学生在课堂上的参与程度、提问回答等情况，了解学生的学习状态。

3. 实验操作：评价学生在实验操作中的规范性和准确性，提高学生的实验能力。

四、教学资源1. 实验材料：淀粉酶样品、试剂、仪器等。

2. 教学课件：淀粉酶分离纯化方法的讲解和实验操作演示。

3. 参考书籍：生物材料中分离纯化酶的相关书籍。

五、教学建议1. 提前准备实验材料和仪器，确保实验顺利进行；2. 在实验操作过程中，注意安全事项，避免意外发生；3. 针对不同学生的学习程度，给予适当的指导和帮助，提高教学效果。

六、教学反思1. 学生参与度：评估学生在课堂上的参与程度，了解学生的学习兴趣和积极性。

2. 教学内容：分析教学内容的难易程度，是否符合学生的认知水平。

3. 教学方法：评价所采用的教学方法是否有效，是否需要调整或尝试新的教学策略。

5. 教学评价：分析教学评价的方法和效果，是否能够全面、准确地反映学生的学习情况。

淀粉酶的提取要点

α-淀粉酶的提取、分离及测定（生化试验小组-2019.4）试验全程安排：试验一、色谱分离淀粉酶1.1 试剂及设备离子交换树脂-20℃冰箱样品管（5-10ml试管）1.5ml离心管紫外分光光度计α-淀粉酶样品秒表胶头吸管（进样用）平衡缓冲液（pH8.0，0.01M磷酸盐缓冲液）洗脱缓冲液（平衡缓冲液+0.1M，0.3M，0.5M，1.0M的氯化钠）试剂瓶1.2 离子交换色谱原理与方法色谱(chromatography)是一种分离的技术,随着现代化学技术的发展应运而生。

20世纪初在俄国的波兰植物化学家茨维特(Twseet)首先将植物提取物放入装有碳酸钙的玻璃管中，植物提取液由于在碳酸钙中的流速不同分布不同因此在玻璃管中呈现出不同的颜色，这样就可以对各种不同的植物提取液进行有效的成分分离。

到1907年茨维特的论文用俄文公开发表，他把这种方法命名为chromatography, 即中文的色谱，这就是现代色谱这一名词的来源。

但由于茨维特当时没有知名度，而且能看懂俄文的人也不多，加之很快爆发了第一次世界大战，茨维特的分离方法一直被束之高阁。

20世纪20年代，许多植物化学家开始采用色谱方法对植物提取物进行分离，色谱方法才被广泛地应用。

自20世纪40年代以来以Martin为首的化学家建立了一整套色谱的基础理论使色谱分析方法从传统的经验方法总结归纳为一种理论方法，马丁等人还建立了气相色谱仪器使色谱技术从分离方法转化为分析方法。

20世纪50年代以后由于战后重建和经济发展的需要，化学工业特别是石油化工得到广泛的发展，亟需建立快速方便有效的石化成分分析。

而石化成分十分复杂，结构十分相似，且多数成分熔点又比较低，气相色谱正好吻合石化成分分析的要求，效果十分明显、有效。

同样，石化工业的发展也使色谱技术特别是气相色谱得到广泛的应用。

气相色谱的仪器也不断得到改进和完善，气相色谱逐渐成为一种工业分析必不可少的手段和工具。

20世纪80年代以后我国也大规模采用气相色谱和高效液相色谱。

酱油成曲淀粉酶组分的鉴定及单组分的分离纯化

酱油成曲淀粉酶组分的鉴定及单组分的分离纯化2010年第8期总第35卷中目调味品CHlNACONDIMENT试验研究酱油成曲淀粉酶组分的鉴定及单组分的分离纯化武金霞,朱秀燕,张贺迎.(1.河北大学生命科学学院,河北保定071002;2.河北大学生物工程技术研究中心,河北保定071002)摘要:淀粉酶是酱油成曲中的主要酶系之一,对成曲淀粉质原料的分解和酱油色,香,味,体的形成起到了关键作用.研究采用PAGE,Starch-PAGE及SDS-Starch-PAGE分析了酱油成曲中的淀粉酶组分,结果表明:酱油成曲中至少有4种不同分子量的淀粉酶组分,分子量分别是88000,71000,60000,52000Da,以制备电泳方法纯化回收了活性最高的组分2,获得了高纯度的单一淀粉酶组分,并测得该酶分子量是52000Da.采用薄层层析法分析检测回收组分2是a一淀粉酶,酶促反应最适pH6.2,最适温度为5O℃.关键词:酱油I成曲;淀粉酶;电泳;分离中图分类号:TS264.21文献标识码:B文章编号:1000--9973(2010)08--0047--04 ldentificationandpurificationofamylasecomponentsinmaturekojiofsoysauceWuJin-xia,ZHUXiu-yan,ZHANGHe-yingz(1.CollegeofLifeSciences,HebeiUniversity,Baoding071002,China;2.KeyResearchCenterofBioengineeringHebeiProvince,HebeiUniversity,Baoding0710 02,China)Abstract=Amylaseisoneofthemostimportantenzymesinmaturekojiofsoysauce,itplayeda key roleinthedecompositionofrawstarchmaterialandtheformationofthesoysaucecolor,aroma ,tasteandshape.TheamylasecomponentsinthematurekojiwereanalyzedbythePAGE,Starch—PAGEandSDS-Starch—PAGE.Theresultsindicatedthattherewerefourkindsofamylasecomponentsin士hekoji ofsoysauceatleastwithmolecularweight88000,71000,60000,52000Da,respectively.The highestactiveAmylase-2waspurifiedbythepreparedPAGEmethodandwasobtainedreachinghigh purity.ThemolecularweightoftheAmylase-2was52000DacalculatedbySDPAGE.ThepurifiedA myl-ase-2wasidentifiedasa-amylasebyThinlayerchromatogram.TheoptimumreactionpHand tempera-turewere6.2and50℃,respectively.Keywords:soysauce;koji;amylase;electr0phoresis;detach酱油是我国传统复合调味料,是在多种微生物不同酶系的共同作用下,物料经过一系列复杂的生物,化学反应,最终形成具有明显香味特征的产品.米曲霉(Aspergillusoryzae)是酿造酱油制曲中的主体微生物,自身分泌多种分解酶和相关合成酶.尽管衡量酱油酿造质量和产量的重要指标为氨基氮,常以米曲霉蛋白酶活力跟踪酱油酿造过程,但淀粉酶作为米曲霉的主要酶系之一,对成曲淀粉质原料的分解和酱油色,香,味,体的形成起着重要作用,而目前对酱油成曲淀粉酶尚无较深入的研究.本文旨在通过改良的电泳收稿日期:2OlO～O4一O2基金项目:河北省生物学强势特色学科资助.作者简介:武金霞(1966一),女,理学博士,河北大学教授,主要从事生物化学药物,食品生物化学研究.一472010年第8期总第35卷中目调味品CHINACoNDnENT试验研究法【1]对酱油成曲淀粉酶组分进行分析鉴定,并通过制备电泳方法纯化出成曲中活性最高的淀粉酶组分2,为进一步研究淀粉酶在酱油酿造中的作用打下基础.1材料与方法1.1材料及试剂米曲霉(Aspergillusoryzae)沪酿3042;豆粕麸皮固体培养基;Tris,可溶性淀粉,SDS,TritonX-100,丙烯酰胺及N,N一甲叉双丙烯酰胺等.1.2主要仪器和设备BG-Power600电泳仪(BAYGENE);电泳槽北京六一仪器厂,24D;凝胶成像仪Bio-Best300M(SIMINTERNATION);水浴锅;SH-5磁力搅拌器(Bei—De);微量加样器等.1.3方法1.3.1酱油成曲浸提液的制备参考文献[2]制备成曲浸提液.1.3.2Folin一酚法测定蛋白质质量浓度参考文献[3]方法测定蛋白质浓度.1.3.3淀粉酶括性测定参考文献[4],采用DNS显色法测定淀粉酶活性,酶活力单位定义为:在pH5.6柠檬酸缓冲液,温度为4O℃的条件下,5min内水解20mg淀粉产生1mg 麦芽糖的酶量为一个酶活力单位,以U/mL表示. 1.3.4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测成曲浸提液蛋白质组成参考文献[53,采用4.5浓缩胶浓度和1O分离胶浓度不连续系统进行PAGE电泳,样品在浓缩胶时,恒压120V,进入分离胶后恒压150V.1.3.5Starch-PAGE检测浸提液淀粉酶组分数量及活性比例分析参考文献[5]作相应的改进,按1.3.4方法配制分离胶时,加1O淀粉溶液至终浓度为3.0,4℃低温电泳,结束后用冰乙酸固定胶板1min,置于pH4.6 的乙酸一乙酸钠缓冲液中,5O℃恒温水浴3h,0.05mol/L碘液染色30S,水洗至条带清晰.使用凝胶成像分析软件QuantityOne—v4.4.0.36分析胶中各条带组分的活性比例.1.3.6SDS-Starch-PAGE电泳检测淀粉酶各组分分子量在1.3.5基础上,使胶内SDS终浓度为0.5,低一48一温电泳结束后,用冰乙酸固定胶板1min,在脱色摇床上用2.5%Triton-X-100慢速洗脱胶板1h以去除SDS,温育,染色,脱色同前.1.3.7制备电泳回收目的淀粉酶组分按1.3.4方法电泳,胶板改成1.5mm,不插样品梳上样;电泳结束后,切下最两边的胶带,放到淀粉培养基平皿上,按1.3.5方法温育,染色,脱色,透明条带即为淀粉酶位置.冲去浮色,按原位置拼成完整胶.根据透明条带显出的淀粉酶位置,对应切下完整胶上淀粉酶组分.将切下的胶切碎,装入小透析带,4℃下回收电泳过夜.次日,反插电极电泳15min,取出透析袋,透析脱盐,冷冻干燥,即得目的组分,PAGE和Starch-PAGE检测是否为纯淀粉酶组分.1.3.8SDPAGE测定纯化组分分子量参考文献[63的方法进行,分离胶浓度12,浓缩胶浓度5.1.3.9薄层层析法测定纯化组分酶解产物类型参考文献[73的方法进行,准确移取纯化组分酶解液,标准麦芽糖溶液,标准葡萄糖溶液各5L点于同一块硅胶板上,各点间距为1.5cm.展开剂系统为V正丁尊:V异丙醇:Vt:V水为7:5:2:4;喷洒苯胺一二苯胺一磷酸显色剂.2结果2.1成曲浸提液的蛋白质浓度,淀粉酶活力及比活力本研究得到的成曲浸提液的蛋白质浓度36.01mg/mL,淀粉酶活力为29.47U/mL,比活力为0.82U/mg.2.2成曲浸提液的蛋白质组成与淀粉酶组分l23456789田1成曲浸提液的蛋白质组成与淀粉馥组分电泳圈谱Fig.1PAGEandStarch-PAGEofthe crudeextractsofmaturekoji注:l～6为成曲浸提液PAGE(考马斯亮蓝染色);7～9为成曲浸提液Starch-PAGE(~液染色);4---9分离胶中有底物淀粉. 2010年第8期总第35卷中目调味品CHINACoNDIMENT试验研究由图1(左)可知,成曲浸提液含有丰富的蛋白质成分,这些是米曲霉生长过程中分泌的各种酶组分,在酱油发酵时分别起不同作用.为了较清晰地观察到淀粉酶组分的活性区带,将浸提液进行适当稀释后进行PAGE与Starch-PAGE对比,在含底物淀粉的凝胶上可显示4个透明区带,是浸提液中的不同淀粉酶组分经电泳分离后,水解各自所达位置的胶内淀粉形成,按迁移率由小到大的顺序命名为Amylase-1,Amylase-2,Amylase-3和Amylase一4.其中Amylase-2组分的活性最强,其次是3组分,而组分1,4的活性最低.经凝胶成像分析各组分活力占总活力的比例分别是42.2,36.3,12.8和8.7.2.3SDS-Starch-PAGE电泳检测成曲淀粉酶各组分分子量1'一2'一3'''.'..一I'一圈2SDS-Starch-PAGE检测成曲中淀粉蕾组分分子量Fig.2IdentificationofamylasecomponentsofthekojibySDS-Starch-PAGE注:1为成曲浸提液;2为标准蛋白Marker.由图2可知,成曲浸提液经SDS-Starch—PAGE后依然显示4个活性区带,分别对应于成曲中的四个淀粉酶组分,但迁移率的顺序与图1(右)不同,是以相对分子质量大小的顺序排列的,参照标准蛋白Marker, 四个淀粉酶组分的相对分子质量分别约为88000, 71000,60000,52000Da.同时判断相对分子质量为52000Da的组分为活性最高组分,即Amylase-2.2.4制备电泳回收目的组分Amylase-2图3显示,经制备电泳回收的目的组分基本达电泳纯,迁移率与成曲浸提液中的该组分一致.同时对纯化的组分和成曲浸提液进行Starch-PAGE,从透明区带看,同样可以认为得到了较纯的目的组分Amyl—ase-2,见图4.目的组分l2345圈3纯化的目的组分与成曲浸提液蛋白电泳图谱Fig.3PAGEofpur~iedtargetcomponentandthe crudeextractsofmaturekoji注:1,2泳道是目的组分;3,4.5泳道是成曲浸提液.目的组分l234图4纯化目的组分与成曲浸提液活性电泳图谱Fig.4Starch-PAGEofpurifiedtargetcomponentandthe crudeextractsofmaturekoji注:1,2泳道是目的组分}3,4泳道是成曲浸提液.2.5SDPAGE测定目的组分Amylase-2的相对分子质量纯化回收目的组分的SDPAGE电泳.目的组分97400662oo43Ooo3lO00201oo14400图5纯化回收目的组分的SDS-PAGE电泳Fig.5SDS-PAGEofpurifiedtargetcomponent注;1.目的组份;2.标准蛋白.制备电泳得到的目的组分Amylase-2,进行SDS—PAGE,依据Marker所做标准曲线计算其相对分子质量约为52000Da,该结果与图2一致,进一步说明在酱油成曲浸提液中,组分Amylase-2的活性最高,相对一49一一●—叠■●枷瑚栅咖哪姗舢姗彻96432010年第8期总第35卷中目调味品CHINACOND玎ENT试验研究分子质量约为52000Da.2.6薄层层析法测定回收组分Amylase-2酶解产物图6回收组分Amylase-2薄层层析图谱Fig.6ThinlayerchromatogramofpurifiedAmylase-2 degradationproduct注:1为标准麦芽糖;2为标准葡萄糖;3为Amylase-2酶解产物.米曲霉分泌的淀粉酶主要有淀粉酶和糖化酶两种[8],淀粉酶(EC3.2.1.1)水解产物主要是小分子糊精,麦芽糖和葡萄糖.糖化酶(EC3.2.1.3)一般能将淀粉百分之百地水解成葡萄糖.麦芽糖和葡萄糖都是还原性糖,用常规酶活测定方法很难区别.采用薄层层析法分析测定, 结果如图6显示,回收组分Amylase-2分解淀粉后产物主要有麦芽糖和葡萄糖,分析认为回收组分Amylase-2应属于旷淀粉酶,该结果与文献[5]报导的相一致.2.7回收组分Amylase-2的部分性质2^52o喜l5藿IO襄soIO203040506070(℃)图7沮度对组分Amylase-2活力的影响Fig.7Theeffectoftemperatureontheamylase-2activity圈8pH对组分Amylase-2活力的影响Fig.8TheeffectofpHOntheamylases-2activity一5O一分别测定组分Amylase-2在不同温度和pH条件下的活力,结果见图7和图8.由图7和图8可以看出,组分Amylase-2的最适反应温度是5O℃,最适反应pH是6.2.3讨论淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称m],包括a一淀粉酶,f}-淀粉酶,糖化酶和异淀粉酶.在分解淀粉质原料过程中,这些淀粉酶组分既单独作用,又协同作用,最终将大分子淀粉水解为葡萄糖,麦芽糖,极限糊精等小分子,这些小分子又参与多种合成反应,对形成酱油的色,香,味起重要作用.由于蛋白酶是将大豆蛋白分解为氨基酸的关键酶,致使人们多注重米曲霉蛋白酶研究,而忽略了其他酶系的研究.事实上,酱油发酵过程是一个气,液,固多相条件下,多种酶促,非酶促反应协同进行的复杂工程,淀粉酶,果胶酶,纤维素酶等在此过程中均起重要作用.本研究首次对酱油酿造菌株米曲霉(Aspergillusoryzae)沪酿3.042的淀粉酶组分构成做了鉴定,同时纯化了活性最高组分Amylase-2,分析测定Amylase一2是a一淀粉酶,最适反应温度是5O℃,最适反应pH是6.2.对回收组分Amylase-2的其它酶学性质,需要进一步分析研究.参考文献:E13武金霞,赵晓瑜.纤维蛋白酶谱检测蚯蚓蛋白酶组分[J]. 中国药学杂志,2005,11(4O):21.[23武金霞,张贺迎,张瑞英,等.一种快速检测糖化酶活力的电泳活性染色方法[J].中国酿造,2001(1):130.E33赵亚华,高向阳.生物化学实验技术教程[M].广州:华南理工大学出版社,2000.42.[4]赵亚华.生物化学实验技术教程[M].广州:华南理工大学出版社,2000:8.[5]武金霞,同博,张贺迎,等.活性染色电泳鉴定酱油成曲中的淀粉酶组分[J].中国调味品,2010,35(1):74—77.[6]周德庆.微生物实验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986:65—70,178?180.[7]杨雅螺.王建华,张帆,等.薄层层析法分离菊芋汁中低聚糖[J].理化检验一化学分册,2007.[8]张秀嫒,袁永俊.糖化酶的研究概况[J].食品开发与研究, 2006.27(9):l63—166.。

工业淀粉酶的纯化与分析试验报告

工业淀粉酶的纯化与分析一．实验目的1．掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法2．掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术3．掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法4．学习Folin-酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法二．实验原理工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心，利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。

利用葡糖糖凝胶G-25对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。

酶活力是以酶在最适条件下，催化一定化学反应的初速度来表示的。

在本实验中，是以一定量的淀粉酶在37摄氏度，PH=6.8的条件下，每分钟水解淀粉酶生成1mg还原糖的量为一个酶活力单位，其中还原糖的量用DNS法测定。

蛋白质在Folin-酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在500nm波长下的吸光度，从而求得样品中蛋白质的含量。

三．实验材料及仪器设备1．材料：工业淀粉酶2．仪器：电子天平；离心机；UV9100型分光光度计恒温水域；沸水浴3．器材：刻度试管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；烧杯：250ml*2、50ml*1;研钵：一套；移液枪：一套；离心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1；层析装置：1套；量筒：100ml*1；洗耳球：2个；胶头滴管：2个；移液管架；玻璃棒四．实验试剂BaCl2 溶液（1%）考马斯亮蓝G-2501%NaCl溶液淀粉溶液（0.5%）磷酸缓冲液（0.2molr/L,pH 6.8） NaOH溶液（2.5mol/L）牛血清蛋白（BSA）标准液（250ug/ml）Folin-酚试剂甲 Folin-酚试剂乙葡萄糖标准液（1mg/ml） DNS试剂五．实验步骤1.浸提称取0.317g淀粉酶制剂，经浸提离心后转移上清液1.2ml于离心管中，标记为“粗酶液”备用。

记录剩余体积为18.2ml并转移到50ml烧杯里，置于冰浴中。