鱼乙酰胆碱酯酶(AchE)说明书活性
乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定试剂盒说明书
货号：MS2000 规格：100管/96样乙酰胆碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。
AchE催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。
测定原理：AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。
自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。
临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。
试剂四：粉剂×1支，4℃保存。
临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。
粗酶液提取：1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心10min，取上清液待测。
2.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3.血清等液体：直接测定。
测定操作：1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于37℃水浴中预热30min。
3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20μL上清液、160 μL试剂二、10μL试剂三和10μL 试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸光值记为A2。
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书
乙酰胆碱酯酶试剂盒说明书人胆碱乙酰化酶(CHAc)ELISA试剂盒说明书本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CHAc含量。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗CHAc抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗CHAc抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的CHAc呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板:一块(96孔)2. 标准品(冻干品): 2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为10 ng/ml，做系列倍比稀释(注:不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成10 ng/ml，5 ng/ml，2.5ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，0.156 ng/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml，临用前15分钟内配制。
如配制5 ng/ml标准品:取0.5ml (不要少于0.5ml ) 10 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液:1×20ml。
4. 检测稀释液A:1×10ml。
5. 检测稀释液B:1×10ml。
6. 检测溶液A:1×120μl(1:100)临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μl/孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B:1×120μl/瓶(1:100)临用前以检测稀释液B 1:100稀释。
药品生产技术《乙酰胆碱酯酶抑制剂简介》
乙酰胆碱酯酶抑制剂乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶〔AChE〕是体内Ach迅速水解而作用消除所必需的酶，1分子乙酰胆碱酯酶每分钟水解105分子的ACh。
在AChE中，由谷氨酸-组氨酸-色氨酸〔Glu-His-Ser〕构成的AChE 催化三联体负责水解底物乙酰胆碱。
首先三联体之间的氢键作用使Ser的羟基氧的亲核性增加〔图1〕，进攻乙酰胆碱的羰基氧，形成过渡态A〔图2〕。
此过渡态不稳定，分解形成胆碱和乙酰化酶B。
AChE一旦处于酰化状态，就不能再与其他乙酰胆碱分子结合，因而是非活性的。
乙酰化酶B可迅速经水解重新产生原来的活性AChE和乙酸。
这最后一步称为酶的复活，对开发抗胆碱酯酶药具有重要意义。
如果AChE被一些特殊的酰化基团酰化，如氨基甲酰化或磷酰化，生成比羧酸酯B更稳定的氨基甲酸酯或磷酸酯，不像羧酸酯那样易于水解，那么AChE将较长时间地处于非活化的酰化状态。
如果该酰化酶虽经较长时间但仍可水解使酶复活，那么为可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂。
目前临床使用的抗胆碱酯酶药多为此类型。
胆碱酯酶抑制剂假设与胆碱酯酶成为不可逆结合，将在很长时间内造成AChE的全部抑制，如有机磷毒剂，使体内乙酰胆碱浓度长时间异常增高，引起支气管收缩、惊厥甚至导致死亡等不良后果。
因此这种不可逆胆碱酯酶抑制剂对人体是非常有害的，除个别作为眼科用药局部使用外，一般用做杀虫剂和毒剂。
乙酰胆碱酶抑制剂乙酰胆碱酶抑制剂〔AChE inhabitors〕，又称为抗胆碱酯酶药，是通过抑制乙酰胆碱酯酶活性而发挥作用的药物，它与乙酰胆碱酯酶抑制剂结合后便失去了活性，使得乙酰胆碱能神经末梢释放的Ach不能被水解而大量堆积，从而延长并增强乙酰胆碱的作用。
因其不与胆碱受体直接作用，属于间接抗胆碱酯药。
可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂在临床上主要用于治疗重症肌无力和青光眼。
新近开发上市的药物主要用于抗老年性痴呆。
临床多用可逆性乙酰胆碱酯酶抑制剂分为：生物碱类〔如毒扁豆碱〕、季铵类〔如溴新斯的明〕、叔胺类〔如盐酸多奈哌齐〕、其他类。
5种杀虫药物对金鱼的急性毒性
5种杀虫药物对金鱼的急性毒性商宝娣;张效平【摘要】为探明甲苯咪唑、敌百虫、吡喹酮、辛硫磷和狼毒大戟5种杀虫药物对金鱼的急性毒性,为金鱼寄生虫病的防治提供参考,采用96 h静态生物测试法,进行5种杀虫药物对金鱼的急性毒性试验.结果表明:甲苯咪唑、辛硫磷、敌百虫、吡喹酮和狼毒大戟乙酸乙酯提取物的96 h半数致死浓度(LC50)分别为0.29 mg/L、5.49 mg/L、27.55 mg/L、29.22 mg/L和13.65 mg/L,安全浓度(SC)分别为0.029 mg/L、0.549 mg/L、2.755 mg/L、2.922 mg/L和1.365 mg/L.根据化合物对鱼类毒性等级评价标准,甲苯咪唑对金鱼属于高毒药品,辛硫磷属于中毒药品,敌百虫、吡喹酮和狼毒大戟乙酸乙酯提取物属于低毒药品.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2015(043)009【总页数】4页(P138-141)【关键词】金鱼;急性毒性;狼毒大戟提取物;杀虫药物【作者】商宝娣;张效平【作者单位】贵州省水产研究所,贵州贵阳550025;贵州省水产研究所,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S948金鱼(Carmsim auratus)隶属鲤科鲫属，是我国饲养的主要观赏鱼之一，其色彩绚丽鲜艳，姿态优美奇异，备受人们喜爱。
金鱼具有体型较小、生命力强、饲养简便等一系列作为实验动物的优良特点，目前已广泛应用于鱼病学[1-2]、鱼类遗传学[3-4]、亲缘关系进化[5]、环境科学[6]等领域的研究。
一般金鱼的养殖密度较高，容易产生病害，每年都会因为疾病爆发造成严重的经济损失[7-8]，成为制约其产业发展的一个重要因素。
其中，指环虫病是金鱼养殖中高发、常见的疾病之一。
据福建省金鱼协会统计，每年由指环虫病引发的病害与死亡数占金鱼总病害与死亡数的37%，已成为制约金鱼养殖业发展的瓶颈。
甲苯咪唑、敌百虫、吡喹酮和辛硫磷等都是农业部渔用药品手册中登记的驱虫药物[9]，已广泛应用于水产养殖过程中寄生虫病的防治，尤其是对单殖吸虫病的防治。
AChE名词解释
AChE名词解释AChE名词解释AChE指的是乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase）是一种重要的酶类。
它是由脊椎动物和无脊椎动物体内的神经元合成的一种酯酶，主要作用是降解神经递质乙酰胆碱 (Acetylcholine，ACh)。
乙酰胆碱酯酶是一种酶，它存在于神经传递物质的基础成分——乙酰胆碱的生成、传递和代谢过程中起着关键的作用。
其主要功能是将乙酰胆碱降解为乙酰与胆碱，然后通过胆碱再生和乙酰转化为乙酰辅酶A，进一步完成神经传递。
它的作用相当于把用过的乙酰胆碱清除掉，以确保神经传递的可靠性，同时也是正常身体机能的必需物质。
AChE能够清除乙酰胆碱，是因为它具有特定的化学功能，能够迅速水解乙酰胆碱，使其分解成乙酰和胆碱。
而且，乙酰胆碱酯酶在此过程中不仅能降解乙酰胆碱，同时还恢复神经纤维所需的胆碱，因此也表现了其与神经传递高度一致的特性。
AChE的检测和应用AChE是生物碳和硫的代表，含有亲匹配的结构域、多样性、自适应和适应性。
AChE的变化与运动功能的改变有关，同时也与人类某些重要疾病的发生有关。
来自胆碱能神经元的某些药物(如甲基肾上腺素)的缓解效果是通过激活AChE而达成的。
众所周知，AChE活性的降低或失调会引起多种疾病的发生，例如肌营养不良、癫痫、帕金森、自闭症、重度抑郁症、老年性痴呆症、肺部疾病等。
因此，AChE的检测对于这些疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
目前，AChE主要通过酶活性分析、免疫分析和基因检测进行检测。
除作为生理调节酶之外，AChE还常常作为反应时间、行为、认知和视知觉领域等的指标，在脑机接口的应用中也有一定的应用。
AChE在农业、环境和医药领域的应用除了作为生理调节酶、认知和视知觉领域的指标之外，AChE还有许多其他的用途。
在农业领域，AChE对昆虫的毒性标准作为一种快速而可靠的方式来评估昆虫毒性，并帮助确定农药毒性。
还可以开发出AChE抑制剂作为有机磷农药拦截剂的有力候选物。
achei作用机制
achei作用机制AChEI，即乙酰胆碱酯酶抑制剂，是目前治疗阿尔茨海默病（AD）等神经认知障碍疾病的主要药物之一。
它的作用机制相当复杂，但核心在于通过不同途径增加大脑中乙酰胆碱的浓度，从而改善认知功能。
首先，AChEI可以通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，减少乙酰胆碱的降解。
乙酰胆碱是一种重要的神经递质，在学习、记忆和认知过程中起着关键作用。
然而，乙酰胆碱酯酶会迅速降解乙酰胆碱，导致其在突触间隙中的浓度降低。
AChEI通过与乙酰胆碱酯酶结合，可逆性地抑制其活性，使乙酰胆碱在突触处积累，从而延长和增强乙酰胆碱的作用。
其次，AChEI还可以通过其他途径增加乙酰胆碱的浓度。
例如，一些药物可以直接作为乙酰胆碱前体，被神经元摄取后转化为乙酰胆碱，从而增加其在突触间隙中的浓度。
此外，一些药物还可以通过激活突触后胆碱能受体来增强乙酰胆碱的效应。
AChEI在神经认知障碍疾病中的应用已经得到了广泛的研究和验证。
多奈哌齐、艾斯能和加兰他敏等药物已被美国和欧洲批准用于轻中度AD的治疗。
这些药物不仅能够改善AD患者的认知功能，还可以改善轻中度帕金森病和路易小体痴呆患者的认知功能，并对痴呆患者伴发的行为和精神症状有一定的改善作用。
然而，需要注意的是，AChEI并非适用于所有神经认知障碍患者。
对于某些患者，如肝功能受损者，使用某些AChEI药物可能会增加不良反应的风险。
因此，在使用AChEI之前，医生需要对患者进行全面的评估，并根据患者的具体情况制定个体化的治疗方案。
AChEI通过抑制乙酰胆碱酯酶等机制增加大脑中乙酰胆碱的浓度，从而改善认知功能。
在神经认知障碍疾病的治疗中，AChEI已经成为了一种重要的治疗手段。
然而，在使用这些药物时，需要充分了解其作用机制和不良反应，并根据患者的具体情况进行个体化的治疗。
AChEI（乙酰胆碱酯酶抑制剂）的副作用通常与其作用机制有关，即增加突触间乙酰胆碱的浓度。
这些副作用可以大致分为毒蕈碱样副作用和烟碱样副作用。
星豹蛛乙酰胆碱酯酶(AChE)活性测定及药剂对其活性的抑制作用
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y乙酰胆碱酯酶染色
y乙酰胆碱酯酶染色
乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）染色是一种用
于观察神经元和突触前膜上的乙酰胆碱酯酶活性的染色方法。
乙酰
胆碱酯酶是一种重要的酶，它在神经系统中起着关键的作用，主要
负责降解神经递质乙酰胆碱，从而调节神经冲动的传递。
乙酰胆碱
酯酶染色可以通过对组织切片进行特殊处理和染色来观察乙酰胆碱
酯酶的分布和活性情况。
乙酰胆碱酯酶染色的原理是利用染色试剂与乙酰胆碱酯酶反应，形成可见的颜色变化，从而标记出乙酰胆碱酯酶的分布。
这种染色
方法通常使用乙酰胆碱酯酶的底物和染色试剂，底物在乙酰胆碱酯
酶的作用下产生可染色的产物，从而形成染色反应。
这样就可以在
显微镜下观察到乙酰胆碱酯酶的分布情况。
乙酰胆碱酯酶染色在神经科学研究中具有重要意义。
通过观察
乙酰胆碱酯酶的分布和活性，可以揭示神经元和突触前膜的结构和
功能，从而帮助科学家更好地理解神经系统的工作原理和相关疾病
的发病机制。
此外，乙酰胆碱酯酶染色也被广泛应用于临床诊断，
特别是在神经系统疾病的诊断中起着重要作用。
总的来说，乙酰胆碱酯酶染色是一种重要的实验技术，通过观察乙酰胆碱酯酶的分布和活性，可以帮助科学家深入了解神经系统的结构和功能，对神经科学研究和临床诊断都具有重要意义。
鲫鱼脑乙酰胆碱酯酶(ACHE)的活性测定及对有机磷农药的敏感性研究
※
２ ０ ， ｏ． ７Ｎｏ １ ７ ０６ Ｖ１ ， ．２ １ ２
鲫鱼脑 乙酰胆碱酯酶（ Ｈ ） ＡＣ Ｅ 的活性测定 及对有机磷农药的敏感性研究
刘 晓宇 － ，郝 强 － ，吴谋成 １ ，杨 健 ２ ，徐 盈 ３ （． １ 华中农业大学食品科技学院，湖北 武汉 ４０ ７ ： ３０ ０ ２中国水产科学研 究院淡水渔业研究 中心 ，内陆渔业环境与资源重 点开放实验室 ，江苏 无锡 ２ ４ ８ ； ． １０ １ ３中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重 点实验室 ，湖北 武汉 ． ４０ ７） ３０ ２
２ Ｋｅ ｂ ｒｔｒ ｆＥ ｏｏ ｉａ ｎ ｉ ｎ ｎ ｄＲｅ ｏ ｒｅ ｆＩｌ ｄＦ ｓ ｅ ｉｓ Ｆ ｅ ｈ ｔｒ ｉｈ ｒ ｓＲｅ ｅ ｒ ｈ ． ｙＬａ ｏ ａｏ ｙｏ ｃ ｌｇ ｃ ｌ ｖ ｒ ｍｅ ｔ Ｅ ｏ ｎ ａ ｓ ｕ ｃ ｓｏ ａ ｉｈ ｒｅ ， ｒｓ ｗａｅ ｓ ｅ ｉ ｓ ａｃ ｎｎ Ｆ ｅ
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乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解机制
乙酰胆碱酯酶催化乙酰胆碱水解机制乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，简称AChE）是一种关键的酶，催化乙酰胆碱（acetylcholine，简称ACh）的水解反应。
乙酰胆碱是一种重要的神经递质，在神经传递过程中起着重要作用。
乙酰胆碱酯酶的催化乙酰胆碱水解机制是通过两个关键步骤实现的：乙酰胆碱的酯键水解和乙酰胆碱酯酶的再生。
乙酰胆碱酯酶是一种酯酶，它的活性位点包括一个酯酶活性位点和一个酰胆碱酯酶活性位点。
乙酰胆碱酯酶的酯酶活性位点主要负责催化乙酰胆碱的酯键水解反应，将乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱。
这个过程中，乙酰胆碱的酯键被酶催化断裂，形成一个共价酯酶中间体。
乙酰胆碱酯酶的酰胆碱酯酶活性位点则负责催化酯酶中间体的再生，将酯酶中间体进一步水解为乙酸和胆碱。
乙酰胆碱酯酶的催化乙酰胆碱水解机制可以分为四个关键步骤：底物结合、酯键断裂、酯酶中间体形成和酯酶中间体再生。
在底物结合步骤中，乙酰胆碱首先与乙酰胆碱酯酶的酯酶活性位点发生非共价相互作用，形成酶底物复合物。
这个过程中，乙酰胆碱的甲基胆碱部分与酯酶活性位点的嵌入式底物结合区域相互作用，而乙酰基则与酯酶活性位点的羟基残基形成氢键。
接下来，在酯键断裂步骤中，酯酶活性位点的羟基残基作为催化剂攻击乙酰胆碱的酯键，形成一个共价酯酶中间体。
这个共价酯酶中间体具有稳定的共价键，使得乙酰胆碱紧密地与乙酰胆碱酯酶结合。
在酯酶中间体形成步骤中，共价酯酶中间体发生构象变化，使得酯酶中间体与酶的酰胆碱酯酶活性位点的结合更加稳定。
这个过程中，酯酶活性位点的羟基残基与酯酶中间体的乙酰基形成氢键，进一步增强了酯酶中间体的稳定性。
在酯酶中间体再生步骤中，酯酶中间体被另一个水分子攻击，重新断裂酯键，形成乙酸和胆碱。
这个过程中，水分子的氧原子与酯酶中间体的羟基残基形成氢键，促进酯键的断裂。
乙酰胆碱酯酶的催化乙酰胆碱水解机制是一个高度协调的过程，需要多个关键残基的配合作用。
治疗AD药物中抑制AchE活性成分的研究进展
治疗AD药物中抑制AchE活性成分的研究进展摘要：本文将对当前治疗老年痴呆症（AD）的主流方法进行简要介绍，并重点阐述治疗AD药物中所含有的抑制乙酰胆碱酯酶（AchE）的活性成分及其构效关系。
随着中药制剂工业的发展，越来越多的中草药被发现含有治疗AD的有效成分，本文也将对本类中药中所含的有效成分进行分析[1]。
关键词：老年痴呆症（AD）； AchEI；中药；构效关系21世纪是人类生命科学发生重大革命及进展的时代，人类期望在21世纪中对一些重大疾病有所突破。
由于人口急剧增加，人类面临的一个巨大挑战是老年痴呆症的发病及治疗问题。
老年痴呆症（AD）亦称阿尔茨海默病，指的是一种持续性高级神经功能活动障碍，即在没有意识障碍的状态下，记忆、思维、分析判断、视空间辨认、辨认等方面的障碍，常发生于50岁以上的老年人。
目前全世界患病人数已超过1800万。
我国患病人数约有500万，是世界上患病人数最多的国家；而在美国，AD继心、脑血管疾病、癌症之后，居成人死因的第四位，因此被称为“2l世纪病”。
目前世界上对AD有效的治疗手段有：1、基因疗法：在进一步明确遗传因素、发病机理的基础上，可使用基因疗法导入正常基因或用不同神经生长因子基因来治疗病变；2、针灸疗法：可分为体针、穴位注射以及针药并用三种方式；3、药物疗法：药物设计的作用点是对抗脑代谢异常的环节和损伤脑细胞的因素。
正在使用及试验的药物有：胆碱酯酶抑制剂、防止神经纤维微管蛋白缠结药物、抗β淀粉样蛋白沉积药、抗氧化剂、非甾体类抗炎制剂、激素替代疗法、蛋白水解酶抑制剂等[2]。
作为AD治疗的一线药物，目前临床上使用的胆碱酯酶抑制剂主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂（AchEI）。
其通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，阻止内源性胆碱的降解，从而延长乙酰胆碱对大脑中胆碱受体的作用，增强胆碱能神经递质的作用，从而提高AD患者的胆碱神经功能。
所以对AchEI及其机理的研究成为抗AD药物研究中最活跃的领域。
毒死蜱和三唑磷对斑马鱼头部AChE活性影响及在鱼体内的富集
摘
要： 采用半静态法 ， 测定了在 ９ — ｃ ６ｈ Ｌ 的 １ ０ １ ０ １ ０及 １ ０作 用剂量下慢性 暴露 ， ／ 、／ 、／ １ ２ ４ ／ ８ 毒死蜱和 ＝唑磷对斑马鱼头部 乙酰胆 ．
碱酯酶（ Ｃ Ｅ 活性 的抑制及两种农药在鱼体的富集作用 ， Ａｈ） 并研究解 除 ３ 后酶活性的恢 复。 ０ｄ 结果表明 ， 随暴露剂量增大 、 暴露时间 延长 ， 农药对 Ａ ｈ Ｃ Ｅ活性抑制越强。在 ９ — ｃ ６ｈ Ｌ 的 １１ ／０作用剂量下连续暴露 ３ ， ０ｄ 毒死蜱和ｊ唑磷处理组斑马鱼头部 Ａ ｈ Ｃ Ｅ活性
分别为对照的 ４ ．５ ２ ％和 ３ ． ％。毒死蜱不同剂量处理组酶活性在解除药剂后 ３ ２ １０ ８ ０ｄ均可恢 复到对照 的 ９ ％以上 ， ｌ ０ 而 二唑磷高剂量 处理 组（ ６ｈ Ｌ 的 １１ ９ — ｃ ，０和 １２ ） ／０ 分别 只有对 照的 ７ ．１ ４９ ％和 ７ ． ％。毒 死蜱极 容易 在鱼体 富集 ， １６ ・ ４ 慢性 暴露 ３ ０ｄ富集 系数 达
Ｉ ａ ｔ ｎｔｅ ｔ ｉ ｆ ｃｔｌｈ Ｉ ｅｔｒ ｓ（ ｈ ｉ ａ ｎ ｉｃ ｎ ｅ ｔａｉｎｉ ｅ ｒ ｆ ｈ Ｂ ａ ｈ７ ｎｏ ｍｐ ｃ ｉ ｔ ｏ ｅｙｃ ｏｉ ｓ ａｅ ＡＣ Ｅ） Ｈｅ ｄａ ｄＢ ｏ０ ｃ ｎｒｔ Ｚ ｂ ａ ｓ （ ｒｃ ） ａ ｉ ｏ ｈ Ａｃ ｖ ｙ Ａ ｎ ｅ ｎ ０ ｎ ｉ ｄ
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乙酰胆碱酯酶
乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶 - 简介乙酰胆碱酯酶 acetylcholine esterase简称AchE（也称真性胆碱酯酶）：活性高,选择性水解Ach的必需酶，能使乙酰胆碱（ACh）水解成胆碱和乙酸。
乙酰胆碱酯酶 acetylcholine esterase EC3.1.1.7。
胆碱酯酶中的I型（即true choli-neesterase）底物特异性高，因为只分解以乙酰胆碱为中心的狭窄范围的底物，故特此这样称呼。
乙酰胆碱酯酶 - 在神经肽代谢中的作用Chubbe等的研究证明，AchE具有羧肽酶和氨肽酶的活性。
在体外，AchE能水解脑啡肽（Enk）和P物质（SP），但不能水解生长抑素（Som）和血管加压素（VSP）等。
进一步的研究证明，AchE作为肽酶，其水解肽的活性部位和作为酯酶的活性部位不同。
值得注意的是，神经系统许多非胆碱能的，含大量AchE的神经元同时亦含有各种神经肽类物质。
如脊髓背根节的SP能细胞即是AchE强阳性。
最近的研究显示，高度纯化的来自电鳗电器官或牛血清的AchE具有蛋白酶样或外切酶的活生。
对于血清蛋白质，AchE能发挥C端残基的清除作用。
此外，AchE的蛋白酶样作用还得到分子生物学证据的支持，氨基酸分析显示，AchE蛋白质分子与蛋白酶样内切酶以及血清羧肽酶的氨基酸序列相似。
在它们的C端36个残基范围内，有40%氨基酸序列和蛋白酶的活性片段相同。
乙酰胆碱酯酶 - 电生理和行为效应AchE的树突或胞体释放树突/胞体释放是神经分泌的一种特殊形式。
黑质多巴胺神经元属非胆碱能，似乎很少接受胆碱能传入投射，但黑质细胞内含有大量AchE。
研究发现，脑内的AchE可以有膜结合型和非膜结合型（可溶的）两种形式，黑质多巴胺能神经元的树突或胞体能够将AchE（可溶型）分泌到细胞外液中，称为AchE树突释放现象。
显然，AchE的树突释放现象和Ach的释放无关。
因为应用胆碱能阻断剂或拮抗剂并不能影响AchE的树突释放。
基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷A的抗阿尔茨海默病活性和作用机制
山东科学ＳＨＡＮＤＯＮＧＳＣＩＥＮＣＥ第３６卷第６期２０２３年１２月出版Ｖｏｌ.３６Ｎｏ.６Ｄｅｃ.２０２３收稿日期:２０２３￣０１￣３１基金项目:济南市 新高校２０条 项目(２０２１ＧＸＲＣ１０６)ꎻ齐鲁工业大学(山东省科学院)科教产融合试点工程项目(２０２２ＰＹ０３３ꎬ２０２２ＪＢＺ０１￣０６)作者简介:时瑞碟(１９９７ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为神经药理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｉｒｕｉｄｉｅ＠１６３.ｃｏｍ∗通信作者ꎬ靳梦(１９８５ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ硕士生导师ꎬ研究方向为神经系统疾病模型建立和神经药理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｍｊｉｎ１９８５＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍ张秀军(１９６６ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为药理学㊁毒理学ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｘｉｕｊｕｎ６６＠１６３.ｃｏｍ基于斑马鱼模型研究木蝴蝶苷Ａ的抗阿尔茨海默病活性和作用机制时瑞碟１ꎬ２ꎬ高鑫２ꎬ王宝堃２ꎬ高代丽２ꎬ靳梦２∗ꎬ张秀军１∗(１.华北理工大学心理与精神卫生学院ꎬ河北唐山０６３２００ꎻ２.齐鲁工业大学(山东省科学院)生物研究所山东省科学院药物筛选技术重点实验室ꎬ山东济南２５０１０３)摘要:基于六水合氯化铝诱导的斑马鱼阿尔茨海默病模型ꎬ探究木蝴蝶苷Ａ的抗阿尔茨海默病活性及作用机制ꎮ将受精后３ｄ的野生型ＡＢ品系斑马鱼随机分为阴性对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝模型对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝与６μｍｏｌ/Ｌ多奈哌齐阳性对照组ꎬ８０μｍｏｌ/Ｌ六水合氯化铝与不同浓度(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)木蝴蝶苷Ａ受试物组ꎮ斑马鱼受精后６ｄꎬ利用明暗交替行为学实验观察不同处理组斑马鱼行为差异并分析其变化ꎻ通过硫黄素Ｓ染色测定各组斑马鱼头部Ａβ斑块沉积数ꎻ采用酶活测定试剂盒检测各组斑马鱼乙酰胆碱酯酶活性ꎻ以实时荧光定量ＰＣＲ检测自噬相关基因(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)的表达变化ꎻ借助分子对接技术验证木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)结合的可靠性ꎮ结果表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ缓解了六水合氯化铝造成的斑马鱼运动障碍ꎬ降低了Ａβ斑块沉积数和乙酰胆碱酯酶活性水平ꎬ使自噬相关基因的异常表达趋于正常ꎮ该研究初步揭示了木蝴蝶苷Ａ能够缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍ꎬ其机制可能与激活细胞自噬有关ꎬ这为木蝴蝶苷Ａ的临床应用及其治疗阿尔茨海默病的相关研究提供了理论依据ꎮ关键词:阿尔茨海默病ꎻ六水合氯化铝ꎻ自噬ꎻ斑马鱼ꎻ木蝴蝶苷Ａ中图分类号:Ｒ９６５㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００２￣４０２６(２０２３)０６￣００２８￣１０开放科学(资源服务)标志码(ＯＳＩＤ):Ａｎｔｉ￣ＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｏｒｏｘｉｎＡａｎｄｉｔｓｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌＳＨＩＲｕｉｄｉｅ１ꎬ２ꎬＧＡＯＸｉｎ２ꎬＷＡＮＧＢａｏｋｕｎ２ꎬＧＡＯＤａｉｌｉ２ꎬＪＩＮＭｅｎｇ２∗ꎬＺＨＡＮＧＸｉｕｊｕｎ１∗(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｓｙｃｈｏｌｏｇｙａｎｄＭｅｎｔａｌＨｅａｌｔｈꎬＮｏｒｔｈＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＴａｎｇｓｈａｎ０６３２００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｒｕｇＳｃｒｅｅｎｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＱｉｌｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ(ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ)ꎬＪｉｎａｎ２５０１０３ꎬＣｈｉｎａ)ＡｂｓｔｒａｃｔʒＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅａｍｅｌｉｏｒａｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ(ＡＤ)ａｎｄｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎꎬａｚｅｂｒａｆｉｓｈＡＤｍｏｄｅｌｉｎｄｕｃｅｄｂｙａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ(ＡｌＣｌ３)ｗａｓｕｓｅｄ.Ｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅｚｅｂｒａｆｉｓｈＡＢｌａｒｖａｅａｔ３ｄｐｆ(ｄａｙｓｐｏｓｔｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ)ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｓꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｍｏｄｅｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｄｏｎｅｐｅｚｉｌ(６μｍｏｌ/Ｌ)ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬａｎｄＡｌＣｌ３(８０μｍｏｌ/Ｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ(５ꎬ１０ꎬａｎｄ２０μｍｏｌ/Ｌ)ｏｆｏｒｏｘｉｎＡｔｅｓｔｇｒｏｕｐ.Ａｔ６ｄｐｆꎬｚｅｂｒａｆｉｓｈｂｅｈａｖｉｏｒｗａｓｍｏｎｉｔｏｒｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｚｅｂｒａｆｉｓｈｌｉｇｈｔ￣ｄａｒｋｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｔｅｓｔ.ＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈｈｅａｄｓｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｔｈｉｏｆｌａｖｉｎＳｓｔａｉｎｉｎｇ.Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅａｓｓａｙｋｉｔｔｅｓｔｅｄａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ(ＡｃｈＥ)ａｃｔｉｖｉｔｙ.Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２ａｎｄａｔｇ７)ｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｖａｌｉｄａｔｅｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｏｒｏｘｉｎＡａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２ａｎｄａｔｇ７).ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｏｒｏｘｉｎＡｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｌｉｅｖｅｄｔｈｅｄｙｓｋｉｎｅｓｉａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｅｄＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄＡｃｈＥａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｉｎｄｕｃｅｄｂｙＡｌＣｌ３.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｔｅｎｄｅｄｔｏｂｅｎｏｒｍａｌａｆｔｅｒｏｒｏｘｉｎＡｔｒｅａｔｍｅｎｔ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｏｒｏｘｉｎＡａｌｌｅｖｉａｔｅｄＡｌＣｌ３￣ｉｎｄｕｃｅｄＡＤｓｙｍｐｔｏｍｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈꎬｗｈｅｒｅｔｈｅｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎｉｓｐｏｓｓｉｂｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｃｔｉｖａｔｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙꎬｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｒｅａｔｉｎｇＡＤ.ＫｅｙｗｏｒｄｓʒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅꎻａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅꎻａｕｔｏｐｈａｇｙꎻｚｅｂｒａｆｉｓｈꎻｏｒｏｘｉｎＡ㊀㊀阿尔茨海默病(ＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅꎬＡＤ)是一种常见的神经退行性疾病ꎬ主要病理特征是细胞外β￣淀粉样蛋白(ａｍｙｌｏｉｄβ￣ｐｒｏｔｅｉｎꎬＡβ)斑块的沉积和细胞内神经原纤维缠结的形成[１]ꎮＡＤ的发病机制复杂多样ꎬ目前广为认可的发病机制假说包括淀粉样蛋白级联假说㊁ｔａｕ蛋白异常磷酸化假说㊁胆碱能假说等[２]ꎮ目前针对ＡＤ的治疗ꎬ主要是胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐㊁加兰他敏和卡巴拉汀)和Ｎ￣甲基￣Ｄ￣天冬氨酸受体拮抗剂(美金刚)[２]ꎮ这些药物虽然能在一定程度上改善ＡＤ患者的行为和认知障碍ꎬ但并不能治愈或者预防该疾病ꎮ自噬是细胞自我降解的过程ꎬ在去除错误折叠或聚集的蛋白质㊁清除受损细胞器等方面起着重要作用[３]ꎮ研究表明自噬的增强能够降低人神经元细胞中ｔａｕ蛋白的过度磷酸化ꎬ缓解ＡＤ小鼠模型的记忆障碍[４]ꎮ杜仲雄花通过调节自噬基因异常表达来改善ＡＤ样症状[５]ꎮ自噬与ＡＤ病理之间存在复杂的联系ꎬ这表明自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ２㊁ｕｌｋ１ｂ和ａｔｇ７)可能是ＡＤ治疗的重要靶点ꎮ中药木蝴蝶来源于紫葳科植物木蝴蝶的干燥成熟种子ꎬ具有清肺利咽㊁疏肝和胃等作用[６]ꎮ木蝴蝶苷Ａ是木蝴蝶提取而得到的一种黄酮类物质ꎮ研究表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ具有抗氧化㊁抗炎㊁抗病毒㊁抗癌等特性ꎬ但目前还缺乏关于木蝴蝶苷Ａ对神经系统疾病作用的研究[７￣８]ꎮ斑马鱼是人类疾病和药物开发的理想模型系统ꎬ常用于研究ＡＤ㊁帕金森病㊁精神分裂症等神经退行性疾病ꎮ六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型ꎬ是一种比较成熟的能够反映ＡＤ主要特征性病理变化的体内动物模型[９]ꎮ本研究中ꎬ我们使用六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型ꎬ通过观察并记录斑马鱼的行为表现ꎬ检测乙酰胆碱酯酶(ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅꎬＡｃｈＥ)的活性和Ａβ斑块沉积以及测定自噬相关基因的表达变化ꎬ从而分析木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ症状是否具有缓解作用ꎬ并对其机制进行探究ꎮ１㊀仪器与材料１.１㊀实验仪器Ｚ￣Ａ￣Ｓ５斑马鱼养殖系统(上海海圣公司)ꎻＺｅｂｒａＬａｂ３.３Ｚｅｂｒａｂｏｘ斑马鱼行为分析仪(法国Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ公司)ꎻＨＰＧ￣２８０ＢＸ光照培养箱(东联电子技术开发有限公司)ꎻ１３７２０实时荧光定量ＰＣＲ仪器(瑞士Ｒｏｃｈｅ诊断产品有限公司)ꎻＣ１０００Ｔｏｕｃｈ梯度ＰＣＲ仪(美国Ｂｉｏ￣Ｒａｄ公司)ꎻＦＶ１２００激光扫描共聚焦显微镜(日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司)ꎻＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ超微量分光光度计(上海基因生物技术国际贸易有限公司)ꎻＳｐｅｃｔｒａＭＲ全波长酶标仪(美国Ｄｙｎｅｘ公司)ꎮ１.２㊀实验材料木蝴蝶苷Ａ(批号ＤＭ００２８ꎬ纯度ȡ９６％ꎬ成都乐美天医药科技有限公司)ꎻ六水合氯化铝(批号Ａ１１２５１１ꎬ纯度９９.９９％ꎬ上海阿拉丁生化科技股份有限公司)ꎻ盐酸多奈哌齐(批号Ｄ１２９９４８ꎬ纯度ȡ９８％ꎬ上海阿拉丁生化科技股份有限公司)ꎻＲＮＡ快速提取试剂盒(批号３１２４２３ＡＸꎬ北京艾德莱生物科技有限公司)ꎻ逆转录试剂盒(批号Ｅ０４７￣０１Ｂꎬ苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)ꎻＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒(批号************ꎬ上海碧云天生物技术有限公司)ꎻ实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒(批号Ｅ０９６￣０１Ｂꎬ苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)ꎻ硫磺素Ｓ(批号ＭＫＣＨ４１０８ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻＡｃｈＥ活性检测试剂盒(批号２０２００８２９ꎬ南京建成生物工程研究所)ꎻＮ￣苯基硫脲(批号Ｐ７６２９ꎬ美国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻ０.３％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００(批号３４６６８５０ꎬ上海生工生物工程有限公司)ꎻ柠檬酸钠抗原修复液(１ˑ)(批号２０１９０３２２ꎬ北京索莱宝科技有限公司)ꎻ４％多聚甲醛(批号７１０４１８００ꎬ北京兰杰柯科技有限公司)ꎮ１.３㊀斑马鱼品系野生型ＡＢ品系斑马鱼由山东省科学院生物研究所提供ꎮ将成年斑马鱼饲养在恒温２８ħ的养殖系统中ꎬ每天同一时间段给与１４ｈ/１０ｈ的光照循环ꎬ定点喂食两次丰年虾ꎮ将成年斑马鱼按照２:２的雌雄比例于前一天分别放置于鱼缸中ꎬ用挡板将雌雄鱼分开ꎬ并于第二天早上８:３０抽取挡板ꎬ大概２ｈ后ꎬ将鱼缸中的鱼卵转移到玻璃缸中ꎬ并加入５ｇ/Ｌ的亚甲基蓝ꎬ之后放置在恒温２８ħ的光照培养箱中培养ꎮ２㊀方法２.１㊀实验分组及处理将受精后３ｄ的斑马鱼随机转移到６孔细胞培养板中ꎬ之后将斑马鱼随机分为６个组:阴性对照组ꎬ六水合氯化铝(８０μｍｏｌ/Ｌ)模型对照组ꎬ六水合氯化铝和不同浓度(５㊁１０和２０μｍｏｌ/Ｌ)木蝴蝶苷Ａ受试物共处理组ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐(６μｍｏｌ/Ｌ)阳性对照组ꎮ每天给药一次ꎬ之后放置在光照培养箱中培养ꎮ在斑马鱼受精后６ｄ进行明暗交替行为学观察ꎬＡｃｈＥ活性检测ꎬ斑马鱼头部Ａβ斑块数检测和实时荧光定量ＰＣＲ分析自噬相关基因的表达ꎮ２.２㊀明暗交替行为学观察将受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝３２)分别吸入到４８孔板中ꎬ每孔加入１ｍＬ的养鱼水ꎮ将斑马鱼置于行为学观测箱中在１００％光照环境中适应１０ｍｉｎꎬ之后进行６０ｍｉｎ包括３组明暗交替循环(１０ｍｉｎ黑暗ꎬ１０ｍｉｎ光照)的行为学测试ꎮ实验结束后利用Ｚｅｂｒａｂｏｘ斑马鱼行为分析仪对斑马鱼的游动轨迹㊁游动速度和游动距离进行分析ꎮ２.３㊀ＡｃｈＥ活性检测将药物处理结束的受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝１００)收集在１.５ｍＬ的离心管中ꎬ每管加入２００μＬ的生理盐水ꎬ之后用破碎机进行破碎匀浆ꎮ以１１０００ｒ/ｍｉｎ的转速在４ħ离心１０ｍｉｎ后取上清液ꎬ之后按照ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作ꎬ用全波长酶标仪测定５６２ｎｍ处的光密度值(ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙꎬＯＤ)并计算样品的蛋白浓度ꎮ之后根据ＡｃｈＥ活性检测试剂盒的说明书ꎬ稍作修改后进行实验ꎮ具体操作为分别吸取双蒸水㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置空白管所需溶液ꎻ分别吸取标准液㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置标准管所需溶液ꎻ分别吸取各组斑马鱼样品蛋白上清液㊁底物缓冲液和显色应用液各５㊁５０㊁５０μＬ配置不同处理组的测定溶液ꎮ之后将各组配置好的溶液振荡混匀后加入到９６孔板中ꎬ每个处理组５次重复ꎮ在３７ħ恒温培养箱中孵育２０ｍｉｎ后ꎬ每孔加入１０μＬ的透明剂和３μＬ的抑制剂ꎮ在室温下放置１５ｍｉｎ后ꎬ使用酶标仪在４１２ｎｍ波长和０.５ｃｍ光径处测定ＯＤ值ꎬ之后根据各样品组的ＯＤ值和浓度ꎬ计算得出各处理组的ＡｃｈＥ活力ꎮ２.４㊀斑马鱼头部Ａβ斑块数检测将受精后的斑马鱼卵收到养鱼缸之后ꎬ加入１ｍｇ/ｍＬ的Ｎ￣苯基硫脲以抑制黑色素的形成ꎮ每天同一时间换一次液ꎬ其他药物处理方法同２.１节所述ꎮ将４％多聚甲醛处理后的受精后６ｄ的斑马鱼放入４ħ冰箱中过夜ꎮ第二天使用磷酸缓冲盐缓冲液(ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅꎬＰＢＳ)将斑马鱼清洗３次ꎬ每次１０ｍｉｎꎮ将清洗完的斑马鱼使用１％的琼脂凝胶固定后ꎬ进行酒精梯度脱水ꎬ二甲苯透明ꎬ石蜡浸润ꎮ之后将处理完的蜡块ꎬ以７μｍ间距进行横切切片ꎮ脱蜡之后在室温下用ＰＢＳ洗涤切片５ｍｉｎꎬ重复３次ꎮ吸干水分ꎬ用免疫组化笔将载玻片上的组织框起来ꎮ然后按照３μＬ:１ｍＬ比例配制０.３％ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００和柠檬酸钠抗原修复液(１ˑ)ꎬ混匀后加到框起来的组织上ꎬ在４ħ冰箱孵育２０ｍｉｎ后ꎬ用ＰＢＳ清洗２次ꎬ每次５ｍｉｎꎮ用滤纸将载玻片上的ＰＢＳ完全吸干后ꎬ在免疫组化笔圈住的部分加入０.３％硫黄素Ｓꎬ并放入４ħ冰箱避光过夜ꎮ第二天用ＰＢＳ在避光环境下洗涤切片１０ｍｉｎꎬ重复３次ꎬ之后用激光扫描共聚焦显微镜观察斑马鱼头部Ａβ斑块沉积状况并进行拍照ꎮ使用Ｉｍａｇｅ￣ＰｒｏＰｌｕｓ５.１分析图像ꎬ并计数斑马鱼头部Ａβ斑块沉积数ꎮ２.５㊀实时荧光定量ＰＣＲ分析自噬相关基因的表达将药物处理结束的受精后６ｄ的斑马鱼(ｎ＝３０)收集在１.５ｍＬ的离心管中ꎬ每管加入５００μＬ的裂解液ꎬ之后用破碎机进行破碎匀浆ꎮ按照ＲＮＡ快速提取试剂盒的说明书进行ＲＮＡ提取后ꎬ利用超微量分光光度计检测不同组别斑马鱼的ＲＮＡ浓度ꎮ之后立即使用Ｃ１０００Ｔｏｕｃｈ梯度ＰＣＲ仪将ＲＮＡ进行逆转录ꎬ将逆转录得到的ｃＤＮＡ进行稀释ꎬ之后根据实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒说明书ꎬ加入相应的引物ꎮ用实时荧光定量ＰＣＲ仪对基因进行扩增ꎬ扩增结束后ꎬ用Ｃｑ值计算各组样品基因的差异表达ꎬ选用ｒｐｌ１３ａ为内参ꎬ目的基因与内参基因的Ｃｑ差值用ΔＣｑ表示ꎬΔΔＣｑ值为各样品的ΔＣｑ值与Ｃｔｌ组ΔＣｑ值平均数的差值ꎬｍＲＮＡ的相对表达量根据２－ΔΔＣｑ相对定量法计算ꎬ每组设置３个重复组ꎮ引物序列见表１ꎮ表１㊀实时荧光定量ＰＣＲ所需引物序列信息ＴａｂｌｅＰＣＲｒｐｌ１３ａ上游:ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＣＴＧＴＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＣ下游:ＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＧＡＧＡＧＣＡＧｂｅｃｌｉｎ１上游:ＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＧＣＧＴＴＴＴ下游:ＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＧＴＣＡｕｌｋ１ｂ上游:ＡＧＧＣＣＧＡＡＡＧＴＣＴＣＡＣＴＴＣＡ下游:ＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＧＧＡＧＡＣＣｕｌｋ２上游:ＡＣＣＴＣＴＧＡＴＴＧＧＣＴＧＡＣＡＡＡＡＴ下游:ＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＴＧＡＧＴＴａｔｇ７上游:ＡＧＡＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＴＧＴＣ下游:ＡＧＡＡＧＴＡＡＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＧ２.６㊀分子对接的准备过程木蝴蝶苷Ａ的３Ｄ结构从ＰｕｂＣｈｅｍ(ｈｔｔｐｓ://ｐｕｂｃｈｅｍ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)数据库中下载ꎬ自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)的３Ｄ结构从ＰｒｏｔｅｉｎＤａｔａＢａｎｋ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｒｃｓｂ.ｏｒｇ/)数据库下载ꎮ使用薛定谔分子对接软件对自噬相关蛋白进行加氢㊁去水等处理ꎬ之后将自噬相关蛋白和木蝴蝶苷Ａ进行对接ꎬ以对接分数作为分子对接的结果ꎬ最后借助Ｐｙｍｏｌ进行可视化分析ꎮ２.７㊀统计分析使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７.０通过单向方差分析和双向方差分析进行统计分析ꎬ结果用ｘʃｓ表示ꎬＰ<０.０５表示差异有统计学意义ꎮ３㊀结果３.１㊀木蝴蝶苷Ａ具有缓解六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍作用如图１(ａ)和１(ｂ)所示ꎬ与空白对照组的斑马鱼相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组中斑马鱼的游动总距离明显变短(Ｐ<０.００１)ꎬ游动速度减缓ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ不同浓度的木蝴蝶苷Ａ受试物(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)与六水合氯化铝共同处理时ꎬ斑马鱼的游动总距离(Ｐ＝０.００９ꎬＰ＝０.００２ꎬＰ<０.００１)和速度均显著增加ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组的速度和总距离有所增加ꎬ其结果(Ｐ＝０.２３)不具有统计学意义ꎮ如图１(ａ)所示ꎬ在黑暗环境下ꎬ不同药物处理组斑马鱼的游动距离变化与总游动距离变化具有一致性ꎮ以上结果表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有一定的缓解作用ꎮ注:∗∗Ｐ<０.０１ｖｓ.空白对照组ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃＃Ｐ<０.００１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝３２ꎻ红色线为快速游动轨迹ꎬ绿色线为中速游动轨迹ꎬ黑色线为慢速游动轨迹ꎮ图１㊀木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍的影响Ｆｉｇ.１㊀ＥｆｆｅｃｔｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎａｌｕｍｉｎｕｍｃｈｌｏｒｉｄｅｈｅｘａｈｙｄｒａｔｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｓｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.２㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼头部Ａβ斑块沉积的抑制作用如图２(ａ)和２(ｂ)所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组的斑马鱼大脑中Ａβ斑块的数明显增多(Ｐ<０.００１)ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中Ａβ斑块沉积数减少(Ｐ＝０.０６)ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组的Ａβ斑块沉积数显著降低(Ｐ＝０.０３ꎬＰ＝０.００２)ꎮ注:∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃Ｐ<０.０５ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝８ꎮ图２㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼头部Ａβ斑块沉积的抑制Ｆｉｇ.２㊀ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎＡβｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.３㊀木蝴蝶苷Ａ对ＡｃｈＥ活性的抑制作用抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ可以提高脑中的乙酰胆碱水平ꎬ从而改善ＡＤ患者的学习记忆障碍[１０]ꎮ在本实验中ꎬ研究探讨了木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝处理的斑马鱼ＡｃｈＥ活性的影响ꎮ如图３所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组斑马鱼的ＡｃｈＥ活性显著增加(Ｐ<０.００１)ꎮ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝和多奈哌齐阳性对照组中斑马鱼的ＡｃｈＥ活性显著降低(Ｐ＝０.００８)ꎬ在六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组中斑马鱼的ＡｃｈＥ活性也显著降低(Ｐ<０.００１)ꎬ且剂量与效应呈正相关ꎮ注:∗∗Ｐ<０.０１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎬ＃＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.模型对照组ꎻｎ＝５ꎮ图３㊀木蝴蝶苷Ａ对斑马鱼ＡｃｈＥ活性的抑制Ｆｉｇ.３㊀ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎｔｈｅＡｃｈＥａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ３.４㊀木蝴蝶苷Ａ对自噬相关基因表达的影响如图４所示ꎬ与空白对照组相比ꎬ六水合氯化铝模型对照组中ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２㊁和ａｔｇ７的表达明显下调(Ｐ＝０.０２ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎮ如图４(ａ)所示ꎬ与六水合氯化铝模型对照组相比ꎬ六水合氯化铝与５㊁２０μｍｏｌ/Ｌ木蝴蝶苷Ａ受试物组ｂｅｃｌｉｎ１表达明显上调(Ｐ＝０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｂ)所示ꎬ六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷Ａ(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)受试物组中ｕｌｋ１ｂ的表达明显上调(Ｐ<０.００１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｃ)所示ꎬ六水合氯化铝与５㊁２０μｍｏｌ/Ｌ木蝴蝶苷Ａ受试物组ｕｌｋ２表达明显上调(Ｐ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎻ如图４(ｄ)所示ꎬ六水合氯化铝与不同浓度木蝴蝶苷Ａ(５㊁１０㊁２０μｍｏｌ/Ｌ)受试物ａｔｇ７的表达也明显上调(Ｐ＝０.０１ꎬＰ<０.００１ꎬＰ<０.００１)ꎮ注:∗Ｐ<０.０５ｖｓ.空白对照组ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ｖｓ.空白对照组ꎻ＃Ｐ<０.０５ｖｓ.六水合氯化铝ꎬ＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.六水合氯化铝ꎬ＃＃＃Ｐ<０.０１ｖｓ.六水合氯化铝ꎻｎ＝４０ꎮ图４㊀木蝴蝶苷Ａ对自噬相关基因表达的影响Ｆｉｇ.４㊀ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒｏｘｉｎＡｏｎａｕｔｏｐｈａｇｙｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ３.５㊀分子对接结果通过２.６方法对木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)进行分子对接ꎬ得出图５ꎬ即ｂｅｌｃｌｉｎ１(ＰＤＢＩＤ:４ＺＷ１)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ｕｌｋ１ｂ(ＰＤＢＩＤ:６ＹＩＤ)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ｕｌｋ２(ＰＤＢＩＤ:６ＱＡＴ)与木蝴蝶苷Ａ的对接㊁ａｔｇ７(ＰＤＢＩＤ:４ＰＨ４)与木蝴蝶苷Ａ的对接ꎮ木蝴蝶苷Ａ与ｂｅｌｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７的对接分数分别为－６.７０７㊁－７.７０８㊁－７.８８８㊁－７.２４９ꎬ这说明木蝴蝶苷Ａ对自噬相关蛋白发挥调控作用ꎮ图５㊀木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白的对接结果Ｆｉｇ.５㊀Ｄｏｃｋｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙ￣ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｏｒｏｘｉｎＡｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇ４㊀讨论与结论ＡＤ是一种进行性神经退行性疾病ꎬ可导致神经元丧失㊁脑萎缩和死亡ꎮ研究表明ꎬ木蝴蝶能够改善ＡＤ小鼠的学习记忆能力ꎬ但具体哪些化学成分起作用还未见报道ꎬ所以我们利用六水合氯化铝诱导的斑马鱼ＡＤ模型去探讨木蝴蝶苷Ａ的抗ＡＤ活性ꎮ正常斑马鱼在面对突然的刺激时ꎬ会表现出快速的保护反应ꎮ研究表明斑马鱼幼鱼在受精后４ｄ后暴露于明暗交替的刺激时ꎬ在光亮中运动活动会突然增加[１１]ꎮ斑马鱼明暗交替行为学测试常被用来识别测定药物的神经保护活性ꎬ通过评估斑马鱼的游动轨迹㊁游动距离和速度ꎬ可以了解其神经行为效应[１０]ꎮ在本研究中ꎬ明暗交替行为学测试表明ꎬ与空白对照组相比六水合氯化铝模型组的斑马鱼游动速度减慢ꎬ游动距离变短ꎬ表明斑马鱼的认知能力受损ꎬ反应迟缓ꎬ不能对外界刺激做出及时的反应ꎮ而经过木蝴蝶苷Ａ的处理ꎬ这种表现有所改变ꎬ这提示木蝴蝶苷Ａ对六水合氯化铝诱导的斑马鱼运动障碍具有缓解作用ꎮＡＤ的特征在于海马和新皮层中ＡｃｈＥ活性升高ꎬ使ＡＤ患者脑内乙酰胆碱水平降低ꎬ影响神经信号的传递ꎬ从而损伤学习记忆能力[１２]ꎮ抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ可以提高脑中的乙酰胆碱水平ꎬ改善ＡＤ患者的学习记忆障碍[１３]ꎮ有研究表明暴露于六水合氯化铝的斑马鱼在５０~２５０μｍｏｌ/Ｌ的浓度范围内显示出ＡｃｈＥ活性增加ꎬ运动活性缺乏[１４]ꎮ我们的研究结果表明ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组的斑马鱼ＡｃｈＥ的活性水平降低ꎬ这说明木蝴蝶苷Ａ能够抑制ＡｃｈＥ活性ꎬ减少乙酰胆碱的水解ꎮＡβ的细胞毒性已在众多体内和体外研究中得到证实ꎬ脑实质中Ａβ斑块的沉积在ＡＤ发病机制中起着核心作用[１５]ꎮＡβ沉积会引发一系列相关反应ꎬ导致ｔａｕ蛋白的错误折叠和组装ꎬ进而将病变扩散到整个神经回路和皮层ꎬ最终损害神经系统ꎬ导致认知能力下降[１６]ꎮ我们的研究表明ꎬ木蝴蝶苷Ａ明显降低了ＡＤ模型中斑马鱼头部的Ａβ斑块计数ꎮ以上表明木蝴蝶苷Ａ能够缓解六水合氯化铝诱导的ＡＤ样症状ꎮ为了进一步探究木蝴蝶苷Ａ是如何发挥抗ＡＤ活性的ꎬ我们进行了机制探究ꎮ自噬在Ａβ的生成和代谢中起重要作用ꎬ与ＡＤ发病进展密切相关[１７]ꎮｂｅｃｌｉｎ１是酵母自噬蛋白ａｔｇ６和ａｐｇ６的同系物ꎬ被认为是自噬体形成的标记蛋白ꎮ研究表明抑制ｂｅｃｌｉｎ１的表达会增加ＡＤ中Ａβ的聚集ꎬ从而加速神经病变[１８]ꎮ还有研究表明ＡＤ患者神经元ｂｅｃｌｉｎ１表达明显下降[１９]ꎮ在本研究中ꎬ六水合氯化铝模型组ꎬｂｅｃｌｉｎ１的基因表达量明显下调ꎬ六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ｂｅｃｌｉｎ１的表达量上调ꎬ说明木蝴蝶苷Ａ能够促进Ａβ在细胞内部降解ꎮｕｌｋ１ｂ具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性ꎬｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ在自噬的起始阶段发挥着重要的调控作用[２０]ꎮ六水合氯化铝模型组ｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ的表达明显下调ꎬ而六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ｕｌｋ２和ｕｌｋ１ｂ的表达明显上调ꎬ说明木蝴蝶苷Ａ能够激活自噬的表达ꎮａｔｇ７是与自噬相关的细胞降解和再循环的必需蛋白质ꎬ主要参与自噬小体的形成ꎬ是调节自噬偶联系统的关键基因[２１]ꎮ研究发现ＡＤ小鼠模型大脑皮层和海马体中ａｔｇ７蛋白水平降低[２２]ꎮ六水合氯化铝模型组ꎬａｔｇ７的表达明显降低ꎬ抑制了自噬的过程ꎬ而六水合氯化铝和木蝴蝶苷Ａ受试物组ａｔｇ７的表达明显上调ꎬ说明ａｔｇ７激活了自噬ꎬ可能促进自噬性溶酶体的形成ꎬ恢复细胞内稳态ꎮ基于分子对接初步模拟木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)之间的分子作用机制ꎬ对接分数的大小直接反应预测结果的可靠性ꎬ对接分数越小表示结合活性越高ꎮ其对接分数均为负数ꎬ表明木蝴蝶苷Ａ与自噬相关蛋白(ｂｅｃｌｉｎ１㊁ｕｌｋ１ｂ㊁ｕｌｋ２和ａｔｇ７)具有良好的结合能力ꎮ这进一步验证了木蝴蝶苷Ａ能对自噬相关蛋白发挥调控作用ꎬ但后续仍需进一步的生物实验验证ꎮ本研究通过对六水合氯化铝诱导的斑马鱼行为的观察㊁ＡｃｈＥ活性的检测以及Ａβ斑块的沉积情况ꎬ预测了木蝴蝶苷Ａ对ＡＤ的潜在治疗作用ꎮ实时荧光定量ＰＣＲ以及分子对接的结果提示木蝴蝶苷Ａ可能通过激活自噬ꎬ从而发挥抗ＡＤ活性ꎮ本研究为治疗ＡＤ药物研发拓展了新思路ꎬ但还需要采取哺乳动物实验及临床试验等方法做进一步的验证ꎮ参考文献:[１]ＴＡＴＵＬＩＡＮＳＡ.ＣｈａｌｌｅｎｇｅｓａｎｄｈｏｐｅｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙＴｏｄａｙꎬ２０２２ꎬ２７(４):１０２７￣１０４３.ＤＯＩ:１０.１０１６/ｊ.ｄｒｕｄｉｓ.２０２２.０１.０１６.[２]ＴＡＭＫꎬＪＵＹＪ.ＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＮｅｕｒａｌＲｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０２２ꎬ１７(３):５４３.ＤＯＩ:１０.４１０３/１６７３￣５３７４.３２０９７０.[３]ＳＲＩＲＡＭＮꎬＳＡＨＭＫ.ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙｉｎｓｉｇｈｔｓｉｎｔｏｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｎｃｅｒａｎｄＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｏｒｄｅｒｆｒｏｍａｕｔｏｐｈａｇｙｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２１ꎬ４８(１２):８２２７￣８２３２.ＤＯＩ:１０.１００７/ｓ１１０３３￣０２１￣０６８３８￣４.[４]ＦＡＮＧＥＦꎬＨＯＵＹＪꎬＰＡＬＩＫＡＲＡＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍｉｔｏｐｈａｇｙｉｎｈｉｂｉｔｓａｍｙｌｏｉｄ￣βａｎｄｔａｕｐａｔｈｏｌｏｇｙａｎｄｒｅｖｅｒｓｅｓｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｅｆｉｃｉｔｓｉｎｍｏｄｅｌｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒᶄｓｄｉｓｅａｓｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０１９ꎬ２２(３):４０１￣４１２.ＤＯＩ:１０.１０３８/ｓ４１５９３￣０１８￣０３３２￣９. 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乙酰胆碱酯酶 通读亚型
乙酰胆碱酯酶通读亚型乙酰胆碱酯酶亚型乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种重要的神经肌肉连接处酶，负责降解乙酰胆碱，一种神经递质，在肌肉收缩中起着至关重要的作用。
AChE 有多种亚型，每种亚型都具有独特的特征和组织分布。
G1 型 AChE- 最常见的亚型，分布广泛- 由单个基因编码，位于第 7 号染色体上- 分泌到神经肌肉接头处的突触间隙中- 与肌肉收缩的关键步骤有关G2 型 AChE- 分布于红细胞膜和某些神经元上- 由与 G1 型不同的基因编码，位于第 3 号染色体上 - 参与血液-脑屏障的维护和神经元功能G4 型 AChE- 仅在某些类型的神经元中表达- 参与神经可塑性和学习记忆R 型 AChE- 主要存在于神经胶质细胞中- 参与神经元之间的信号传导T 型 AChE- 从 G1 型 AChE 通过剪接产生- 分泌到神经肌肉接头处的突触间隙中- 与神经肌肉传导的速度有关H 型 AChE- 存在于心脏，大脑和肌肉中- 参与心脏和肌肉收缩的调节不同的 AChE 亚型具有不同的生理作用不同的 AChE 亚型在乙酰胆碱水解速率、组织分布和对抑制剂的敏感性方面表现出差异。
例如，G1 型 AChE 对抑制剂的新斯的明高度敏感，而 G2 型 AChE 则不敏感。
此外，AChE 亚型在某些神经系统疾病中的作用正在受到研究。
例如，阿尔茨海默病患者海马中的 G1 型 AChE 活性降低，这表明AChE 亚型在认知功能中可能发挥作用。
对 AChE 亚型的研究具有重要意义对 AChE 亚型的研究对于了解神经肌肉连接处功能、神经系统疾病的病理生理学以及开发新药物来治疗神经系统疾病至关重要。
通过靶向特定的 AChE 亚型，可以开发出治疗神经肌肉疾病、认知障碍和疼痛的新疗法。
乙酰胆碱酯酶和神经毒素的反应化学式
乙酰胆碱酯酶和神经毒素的反应化学式乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种重要的酶类蛋白质，它在神经信号传导过程中起着关键的作用。
在神经系统中，乙酰胆碱是一种重要的神经递质，它通过神经元之间的突触传递神经信号。
AChE的主要功能是降解乙酰胆碱，防止神经信号持续传导而导致神经兴奋过度。
然而，在一些情况下，AChE可能会与神经毒素作用，引起神经系统毒性效应。
首先我们来看一下乙酰胆碱酯酶和神经毒素的反应化学式。
在一般情况下，乙酰胆碱被乙酰胆碱酯酶催化水解产生乙酸和胆碱。
而神经毒素如有机磷农药和神经气体昔里多烷等都可以与AChE结合形成稳定的复合物，导致AChE活性丧失，从而影响神经递质的正常传导，最终导致神经系统功能障碍。
乙酰胆碱酯酶和神经毒素的反应是一个重要的研究领域，因为它涉及到神经系统的健康和疾病。
神经毒素是一类具有潜在危险的化合物，它们可能通过不同的途径进入人体，如接触、吸入或摄入，造成神经系统损伤。
因此，了解AChE和神经毒素之间的相互作用机制对于预防和治疗神经系统相关疾病具有重要意义。
乙酰胆碱酯酶的结构和功能是研究AChE和神经毒素反应的基础。
AChE是一种酶类蛋白质，它主要存在于神经系统中的突触间隙和肌肉组织中。
AChE的活性位点含有一个酰胆碱底物结合点和一个酶活性中心，它与乙酰胆碱结合并催化水解。
神经毒素作为AChE的抑制剂，一般与AChE的活性位点结合形成一个稳定的复合物，从而抑制AChE的活性。
这种抑制作用可能是可逆的，也可能是不可逆的，取决于神经毒素的结构和机制。
在研究AChE和神经毒素的相互作用时，化学式和分子结构确定了它们之间的相互作用机制。
乙酰胆碱酯酶活性中心含有酯键和酸碱基残基，这些基团是神经毒素结合的关键。
一些神经毒素如毒气、有机磷农药和植物毒素，它们通过和AChE的活性位点发生共价键结合，抑制AChE活性。
而另一些神经毒素如神经气体，它们通过与AChE的非共价作用，如氢键、离子键和范德华力等，来影响AChE的结构和功能。
乙酰胆碱酯酶标准值
乙酰胆碱酯酶标准值
乙酰胆碱酯酶（AChE）是一种重要的酶，它在神经系统中起着
关键的作用。
在临床实验室中，AChE的测定通常是通过血清或血浆
样本进行。
然而，AChE的标准值可能会因实验室方法和设备的不同
而有所变化。
一般来说，成年人的AChE标准值在血清中约为0.5-
1.5 U/mL。
这些数值可能会因不同的实验室和测定方法而有所不同，因此在进行AChE测定时，应该参考具体的实验室报告或医生的建议。
此外，AChE的标准值还可能受到个体健康状况、年龄、性别和
其他因素的影响。
例如，某些疾病状态或药物使用可能会影响AChE
的水平。
因此，对于特定个体而言，正常范围可能会有所偏离，医
生会根据具体情况进行综合分析。
总之，AChE的标准值在血清中大约为0.5-1.5 U/mL，但具体数
值可能因实验室方法、个体差异以及健康状况而有所不同。
因此，
在进行AChE测定时，应该结合具体情况进行综合分析。
微量电鳐乙酰胆碱酯酶抑制法测定低剂量梭曼浓度
微量电鳐乙酰胆碱酯酶抑制法测定低剂量梭曼浓度
刘星;陈起展
【期刊名称】《卫生毒理学杂志》
【年(卷),期】1995(009)001
【摘要】微量电鳐乙酰胆碱酯酶抑制法测定低剂量梭曼浓度刘星，陈起展梭曼是一种能对机体内乙酰胆碱酯酶（ＡＣｈＥ）强烈抑制而产生毒性的有机磷化合物。
我们在Ｈａｍ－ｍｏｎｄ［１］等建立的微量ＡＣｈＥ抑制法测定微量有机磷毒剂浓度基础上改进，建立了一种新型的测定方法，其...
【总页数】3页(P41-43)
【作者】刘星;陈起展
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R991
【相关文献】
1.电鳐乙酰胆碱酯酶单链抗体基因的克隆及表达 [J], 王玉霞;武军华;滕霞;郭崇志;孙曼霁
2.抗电鳐乙酰胆碱酯酶单克隆抗体3F3的单链抗体高级结构的计算机模拟及其抑制酶活性机理探讨 [J], 郭崇志;王玉霞;等
3.血浆中游离梭曼的电鳐乙酰胆碱酯酶抑制测定法 [J], 应翔宇;阮金秀
4.六甲铵等对梭曼膦酰化电鳐AChE老化的影响 [J], 钟玉绪;周文霞;赵德禄;阮金秀
5.梭曼和沙林对电鳐电器官乙酰胆碱酯酶抑制作用动力学 [J], 陈久祯;王惠芳;李艳军;刘威;温巨芳
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释。
200IU/L
5 号标准品
150µl 的原倍标准品加入 150µl 标准品稀释液
100IU/L
4 号标准品
150µl 的 5 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
50IU/L
3 号标准品
150µl 的 4 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
25IU/L
2 号标准品
150µl 的 3 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
活性浓度。
试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液
20ml×1 瓶
7 终止液
6ml×1标准品（400IU/L） 0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板
12 孔×8 条
9 标准品稀释液
1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液
6ml×1 瓶
10 说明书
1份
5 显色剂 A 液
6ml×1 瓶
11 封板膜
用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数， 即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
2张
6 显色剂 B 液
6ml×1/瓶
12 密封袋
1个
标本要求
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2．不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀
保存条件及有效期 1．试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6 个月
大于标准品孔第一孔的 OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计 算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准 . 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。
鱼乙酰胆碱酯酶（AchE)酶联免疫分析
试剂盒使用说明书
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围： 6 IU/L - 220IU/L
96T
使用目的：
本试剂盒用于测定鱼血清、血浆及相关液体样本中乙酰胆碱酯酶（AchE)活性。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鱼乙酰胆碱酯酶（AchE)水平。用纯化的鱼乙酰
胆碱酯酶（AchE)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入乙酰胆碱
12.5IU/L
1 号标准品
150µl 的 2 号标准品加入 150µl 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl， 然后再加待测样品 10µl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结：
酯酶（AchE)，再与 HRP 标记的乙酰胆碱酯酶（AchE)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体
复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸
的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙酰胆碱酯酶（AchE)呈正相关。用酶
标仪在 450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中鱼乙酰胆碱酯酶（AchE)