正常人周围血初始和记忆T细胞亚群及细胞因子表达的探讨.

正常人周围血初始和记忆T细胞亚群及细胞因子表

达的探讨

【关键词】初始和记忆T细胞;,T细胞亚群;,细胞表面标志;,细胞因子Subpopulations and cytokine expression of nave and memory T cells in normal human PBMCs [Abstract] AIM: To determine subpopulations and cytokine expression of nave and memory T cells by polychromatic flow cytometry (PFC). METHODS: PBMCs were separated from normal human peripheral blood and stimulated by superantigen (SEB). After incubation for 5 hours, the cells were fixed, permeablized and stained with multiplecolorlabeled mAbs for cell surface and intracellular cytokines. Then they were detected by polychromatic flow cytometry and the data were analyzed by Flow Jo software. RESULTS: Based on the expression of CD45RO molecules, CD4+ and CD8+ T cells were classified as nave and memory cells, which were further devided into several subsets according to the expression of CD62L and CCR7. When PBMCs were stimulated by SEB for 5 hours,

CD45RO+ and CD45RO-CD4+ or CD8+ T cells expressed IL2, IFNγ and

TNFα. Further analysis indicated that CD62LloCCR7lo and CCR7+ T

cells but not CD62Lhi and CD62LhiCCR7+ T cells expressed cytokines. In addition, the percentage of cytokine expression in CD62Llo CCR7lo subsets was markedly higher than that in CCR7+ subsets. CONCLUSION:

It is not scientific to identify nave and memory cells in human T cells only based on the expression of CD45RO. Accurate determination of nave, effector and memory cell populations can be achieved not only based on the expression of CD45RO but also according to the expression of CD62L. [Keywords]nave ＆ memory T cells; T cell subset; cell surface marker; cytokine [摘要] 目的: 利用多色流式检测技术探讨初始和记忆T细胞亚群与细胞因子表达之间的关系。方法: 自正常人静脉血中分离PBMC, 经超抗原（SEB）刺激5 h后, 加入多种抗细胞表面

标记和抗细胞因子抗体进行染色, 利用流式细胞术检测, 并利用Flow Jo软件分析结果。结果: 根据CD45RO表达与否, 将CD4+和CD8+ T细胞分为初始和记忆T细胞, 再根据归巢受体（CD62L）和趋化因子受体（CCR7）的表达与否, 将初始和记忆T细胞进一步分为不同的亚群。当T细胞受到SEB激活后, CD45RO+和CD45RO-的CD4+或CD8+ T细胞均表达IL2、 IFNγ和TNFα。进一

步分析结果表明, CD62Lhi和CD62LhiCCR7+细胞不表达细胞因子, 而

CD62LloCCR7lo和CCR7+ T细胞均表达细胞因子, 其中CD62LloCCR7lo细胞表

达细胞因子的阳性率明显高于CCR7+细胞亚群。结论: 只利用CD45RO表达与否区分初始和记忆T细胞是不够准确的, 同时检测CD62L的表达, 可明显地提高其准确性。[关键词]初始和记忆T细胞; T细胞亚群; 细胞表面标志; 细

胞因子人周围血T细胞主要是由CD4+和CD8+ T细胞所组成, 根据其表型、功能和不同的组织分布, 将T细胞分为许多亚群[1-3]。传统的鉴别初始和记忆T细胞的方法, 是根据CD45RO或CD45RA的表达与否: CD45RO-或

CD45RA+者为初始T细胞, 反之为记忆T细胞。在记忆T细胞中, 根据归巢受体CD62L和趋化因子受体CCR7的表达与否, 又可将记忆T细胞分为中央型（TCM）和效应型（TEM）细胞[4-7]。目前, 利用多色流式细胞仪检测技术（polychromatic flow cytometry, PFC）结合多种抗体标记同时染色法, 可将周围血T细胞进一步分为几十甚至上百个亚群[2, 3]。对这些微小细胞亚群的探讨, 将进一步揭示免疫功能在生理和病理的情况下的变化。本研究中利用PFC技术同时结合多种抗体进行细胞表面标记和细胞内细胞因子的检测, 探讨了细胞亚群和细胞因子产生之间的关系, 该研究将为基础和临床研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 Cy7PE标记的抗CD3单克隆抗体（mAb）、 Q605标记的抗CD4 mAb、 Cy5.5APC标记的抗CD8 mAb、 Cy7APC标记的抗CD45RO mAb、 Cas B标记的抗CCR7 mAb、 Q705标记的抗CD62L mAb、PE标记的抗IL2 mAb、 APC标记的抗IFNγ mAb和FITC标记的抗TNFα mAb, 购自BD/Pharmingen公司或由美国国立卫生研究院惠赠。SEB及皂素（saponin）购自Sigma公司。RPMI1640培养液和H ank’s缓冲液购自GIBCO 公司。流式细胞检测仪为BD公司产品。 1.2 方法 1.2.1 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离抽取健康志愿者静脉血, 肝素抗凝, 以Hank’s 缓冲液等体积稀释后, 用Ficoll进行密度梯度离心（于22℃ 2000 r/min离心20 min）获取PBMC。充分洗涤后, 用RPMI1640 完全培养液调整PBMC的密度为2×109/L。 1.2.2 细胞染色细胞染色按照常规染色方法进行操作。（1）细胞表面分子的检测: 简言之, 取细胞悬液100 μL, 加入标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体, 于4℃避光反应30 min, 洗涤2次（1 800 r/min离心8 min）。（2）细胞内细胞因子的染色: 将待测细胞用PBS洗涤2次后, 加入细胞固定液室温固定7 min, 洗涤2次。然后加入200 μL含有通透剂（saponin）的缓冲液作用2 h, 再加入特异性的胞内标记的mAb, 于4℃避光反应30 min, 洗涤2次。以300 μL染色缓冲液重悬细胞, 应用流式细胞术检测细胞, 并用Flow Jo软件分析流式细胞术检测结果。 2 结果

2.1 初始和记忆T细胞亚群的表型特征正常人PBMC中CD3+ T细胞(图1A)是由CD4+(图1B)和CD8+(图1C)T细胞所组成。根据CD45RO的表达与否, 可将CD4+ T细胞分为CD4+CD45RO+和CD4+CD45RO-两个细胞亚群(图1B); 同样可将CD8+ T细胞分为CD8+CD45RO+和CD8+CD45RO-细胞亚群(图1C)。这些细胞亚群代表着初始T细胞（CD45RO-）和记忆T细胞（CD45RO+）。再根据归巢受体（CD62L）和趋化因子受体（CCR7）的表达与否, 可将初始CD4+ T细胞(图1E)、记忆CD4+ T细胞(图1D)、初始CD8+ T细胞(图1G)和记忆CD8+ T细胞(图1F)进一步分为4个不同的细胞亚群。从图1D、 E、 F和G中可以看出, 初始和记忆T细胞CD62L和CCR7的表达存在着明显的差异。百事通

2.2 初始和记忆T细胞细胞因子的表达为了进一步探讨初始和记忆T细胞的表型和功能之间的关系, 利用超抗原(SEB)短暂（5 h）刺激PBMC后, 观察初始(图2A、 C)和记忆(图2A、 B)CD4+ T细胞中IL2、 IFNγ和TNFα的表达以及相互之间的关系。结果表明, 记忆CD4+ T细胞(图2B)中IL2、 IFNγ和TNFα的表达明显高于初始CD4+ T细胞(图2C)。同样地, 当初始(图3A、 C)和记忆(图3A、 B)CD8+ T细胞经SEB刺激后, 其细胞因子表达的结果与CD4+ T细胞表达的结果相似。此外, 不论是初始还是记忆T细胞, 在SEB刺激后, 其中的部分细胞同时产生一种或多种细胞因子。图1 －图3 略

2.3 初始和记忆CD4+ T细胞亚群中细胞因子的表达初始CD4+ T细胞, 根