绿脓杆菌的试验方法
铜绿假单胞菌检验
3. 结果报告
根据蓝色或绿色菌落的计数和确证性试验的
结果，计算每250mL水样中的铜绿假单胞菌数 量，结果以CFU/250mL计。 生融合而可能影响计数的精确度。
受到严重污染或培养时间过长时，菌落会产
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） ATCC 27853——阳性对照菌株 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） ATCC 25922——阴性对照菌株
平铺时应避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。
2.2.3 检验程序
结果观察：
所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步判定 为铜绿假单胞菌。 所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单胞菌菌落， 进行乙酰胺肉汤确证性试验。
将其它所有红褐色不发荧光的菌落进行氧化酶测试、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证性试验。
1.1 生物学特性
无特殊营养要求，该菌在普通营养琼脂上生长良 好，琼脂通常会被染成蓝绿色或黄绿色。 该菌在血琼脂平板上生长为灰绿色或蓝绿色菌落， 并形成透明溶血环。 在营养肉汤中呈混浊生长，液面可长出菌膜，菌液 上层为蓝绿色。
1.1 生物学特性
生化反应： 1）氧化酶阳性； 2）液化明胶； 3）硝酸盐还原试验阳性； 4）吲哚阴性； 5）绿脓菌素试验阳性； 6）其它生化试验（糖利用试验、脱羧酶试验等等）。
－P：呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞 菌的菌落）。 －F： 显荧光的菌落数。 －R： 呈红褐色的菌落数。 －nF：进行产氨测试的显荧光菌落数。 －CF：产氨阳性的显荧光菌落数。 －nR：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测 试的红褐色菌落数。 －CR：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均 呈阳性的红褐色菌落数。
【精品文档】绿脓杆菌
绿脓杆菌检验方法pseudomonas aeruginosa 绿脓杆菌在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在。
1 方法提要根据本菌生物学特征：革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。
此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下生长等，可与类似菌相区别。
2 培养基和试剂2.1 1.05284.0500（绿脓）培养基制法：取44.5g 于1 L水中，加温使溶解，调pH为7.2，煮沸过滤后补足液量，溶解混匀，，121℃15min灭菌后备用。
平板制法：将灭菌后培养基倾注5CM平板约3CM厚，冷却凝固后贮藏于冰箱（4℃）３仪器3.1 培养箱：37℃、42℃。
3.2 锥形烧瓶。
3.3 过滤装置。
3.4 灭菌平皿。
3.5 灭菌刻度吸管。
3.6 显微镜。
3.7 载玻片。
3.8 接种针、接种环。
3.9 电炉。
3.10 高压消毒锅。
4 操作步骤4.1 菌落的培养：取250ml样品经0.22μ无菌过滤后，将过滤后的滤膜用无菌镊子轻轻取下贴于制备好的平板上，并将气泡赶走，置37℃培养48h。
如有绿脓杆菌生长，则有呈黄绿色或蓝绿色菌落出现。
4.2 分离并提纯培养：挑取典型菌落，划线接种在普通细菌琼脂平板上，置37℃培养24h。
4.3 染色镜检：挑取单一菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。
4.4 氧化酶试验：取一张氧化酶试纸放在灭菌平皿内，用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌菌落涂在滤纸片上，在15～30s之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性。
4.5 绿脓荧光试验：取4W/366nmUV灯观察菌落，可以看到产生荧光。
4.6 42℃生长试验：挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在41～42℃培养箱中，培养24～48h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
5 检验结果报告1）经染色镜检为革兰氏阴性无芽胞杆菌，氧化酶阳性，应报告检出绿脓杆菌。
绿脓杆菌实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习细菌分离纯化的基本方法。
2. 掌握绿脓杆菌的形态特征。
3. 熟悉绿脓杆菌的生化特性。
二、实验原理绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种革兰氏阴性杆菌，广泛存在于自然界、土壤、水和植物表面。
它是一种条件致病菌，可引起人类和动物的多种感染，如肺炎、尿路感染、烧伤感染等。
本实验通过分离纯化绿脓杆菌，观察其形态特征，进行生化实验，以鉴定绿脓杆菌。
三、实验材料与仪器1. 实验材料（1）样品：土壤、水体、植物表面等。
（2）培养基：营养肉汤、营养琼脂、伊红美蓝琼脂、葡萄糖发酵管等。
（3）试剂：无菌生理盐水、无菌接种环、无菌移液器、无菌棉签等。
2. 实验仪器（1）显微镜（2）恒温培养箱（3）高压蒸汽灭菌器（4）无菌操作台四、实验方法1. 绿脓杆菌的分离（1）将土壤、水体、植物表面等样品采集后，用无菌生理盐水进行稀释。
（2）取适量稀释液接种于营养琼脂平板，进行涂布培养。
（3）将培养皿放入恒温培养箱中，37℃培养24小时。
2. 绿脓杆菌的形态特征观察（1）观察菌落特征：菌落呈绿色，表面光滑、湿润，边缘整齐。
（2）显微镜观察：取少量菌落涂片，进行革兰氏染色，观察细菌形态。
3. 绿脓杆菌的生化实验（1）葡萄糖发酵实验：将适量菌液接种于葡萄糖发酵管，观察是否有气泡产生。
（2）伊红美蓝琼脂实验：将适量菌液接种于伊红美蓝琼脂平板，观察菌落颜色变化。
五、实验结果与分析1. 绿脓杆菌的分离在营养琼脂平板上，观察到绿色菌落生长，经涂布培养后，菌落形态一致，表明已分离得到绿脓杆菌。
2. 绿脓杆菌的形态特征观察（1）菌落特征：菌落呈绿色，表面光滑、湿润，边缘整齐。
（2）革兰氏染色：细菌呈革兰氏阴性，呈长棒形，两端钝圆。
3. 绿脓杆菌的生化实验（1）葡萄糖发酵实验：接种后，发酵管内产生气泡，表明绿脓杆菌能发酵葡萄糖。
（2）伊红美蓝琼脂实验：接种后，菌落呈黑色，周围有绿色晕圈，表明绿脓杆菌具有氧化酶活性。
雏鸡绿脓杆菌病病原菌的分离鉴定及防治试验
进。
中图 分类 号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ３ １ 文献标志码： Ａ
文章编号： １ ０ ０ ８ － ４１ ０ ４ （ ２ ０ １ ３ ） １ ２ － ０ ０ ２ ３ — ０ ２
菌 脱 脂 棉 球 均 匀 涂 布 于 普 通 琼 脂 平 板， 按一定距离加贴药敏纸片 ， 测 定 对
绿脓 杆 菌 （ Ｐ ｓ ｅ ｕ ｄ ｏ ｍｏ ｎ ａ ｓ ａ ｅ ｒ ｕ ｇ ｉ ． ｎ ｏ ｓ ａ ） 首 次 由Ｇ ｅ ｓ ｓ ａ ｒ ｄ 于１ ８ ８ ２ 年从伤 口 脓 液 中 分 离 出 来 ．在 自然 界 中 分 布 广 泛， 可 引起 多 种 动 物 的脏 器 脓 肿 。 对 动 物绿 脓 杆 菌病 调 查 结 果 表 明 ，绿 脓 杆 菌是 鹌鹑 化脓 性 肝 炎 、 水 貂 出 血 性 肺 该 养 殖 户 携 带 病 鸡 来 到 长 治 市 兽 医 院
心包膜 混浊 ； 脾脏肿 大 ， 出血 ； 卵 黄 吸
收 不 良 ．呈 黄 绿 色 ：肾 脏 肿 大 有 出血
传 播 。我 们 对 送 检 的 疑 似 绿 脓 杆 菌 病 例 进行 病 原 的分 离 鉴 定 ．并 对 分 离 菌 的 培 养 特 性 、致病 力 及 抗 菌 药 物 的 敏 感 性 进 行 了研 究 。为有 效 防 制鸡 绿 脓
生死 亡 。 当地 兽 医诊 断 为绿 脓 杆 菌 性
生 化 特性 ， 并结合临床资料 ， 确 定 本 病
为 绿 脓 杆 菌感 染 。 ３ － ２ ． ３ 药敏试 验结果 ： 结 果 高 敏 的药
血 琼脂 平板 和麦 康凯 琼脂平 板 ， ３ ７ ℃
铜绿假单胞菌检验方法标准
铜绿假单胞菌检验方法标准【原创版2篇】篇1 目录1.铜绿假单胞菌的概述2.铜绿假单胞菌的检验方法3.铜绿假单胞菌在化妆品中的卫生标准4.铜绿假单胞菌的致病性和治疗药物5.铜绿假单胞菌的防控措施篇1正文一、铜绿假单胞菌的概述铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌，是一种广泛存在于土壤中的细菌。
其菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
铜绿假单胞菌编码三种 VI 型分泌系统，即 h1-t6ss、h2-t6ss 和 h3-t6ss。
其中 h1-t6ss 被认为是一种严格的细菌靶向途径，而 h2-t6ss 和h3-t6ss 通过作为靶向宿主细胞并促进铜绿假单胞菌感染的毒力。
二、铜绿假单胞菌的检验方法铜绿假单胞菌的检验方法主要包括以下几种：1.形态学观察：通过暗视野显微镜或相差显微镜观察菌体的形态和结构。
2.培养法：将采集的样本在特定的培养基上进行培养，观察菌落的形态和特征。
3.免疫学检测：通过抗原 - 抗体反应检测样本中铜绿假单胞菌的抗原或抗体。
4.分子生物学检测：如 PCR、DNA 测序等方法，通过对特定基因进行扩增和测序，判断样本中是否存在铜绿假单胞菌。
三、铜绿假单胞菌在化妆品中的卫生标准在化妆品中，铜绿假单胞菌的检测是非常重要的，因为铜绿假单胞菌对人有致病力，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。
因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出铜绿假单胞菌。
四、铜绿假单胞菌的致病性和治疗药物铜绿假单胞菌具有较强的致病性，可引起各种感染，如皮肤感染、败血症等。
针对铜绿假单胞菌感染的治疗，可选用以下药物：1.半合成青霉素：如阿洛西林和哌拉西林，其中以哌拉西林为最常用。
2.第三代头孢菌素：如头孢他啶、头孢哌酮。
3.其他内酰胺类药物：如亚胺配能及氨曲南。
4.氨基糖苷类：如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和异帕米星。
5.氟喹酮类：如氧氟沙星、环丙沙星及氟罗沙星等。
绿脓细菌菌实验报告
一、实验目的1. 学习绿脓杆菌的分离与培养方法。
2. 掌握绿脓杆菌的形态观察和特征鉴定。
3. 了解绿脓杆菌的生物学特性。
二、实验原理绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），又称铜绿假单胞菌，是一种革兰氏阴性杆菌，具有运动性、形成芽孢和荚膜等特点。
绿脓杆菌广泛存在于自然界，如土壤、水、空气等，是一种条件致病菌，可引起多种感染。
本实验采用平板划线法和稀释涂布平板法分离绿脓杆菌，通过显微镜观察其形态和运动性，并对其进行革兰氏染色、氧化酶试验等鉴定。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：绿脓杆菌标准菌株、土壤样品、营养肉汤、营养琼脂、生理盐水、无菌棉签、无菌镊子、无菌移液器、无菌试管、酒精灯、高压蒸汽灭菌器、显微镜、接种环、接种针等。
2. 试剂：革兰氏染液、氧化酶试剂、无菌生理盐水等。
四、实验方法1. 绿脓杆菌的分离（1）取土壤样品10g，放入100ml无菌生理盐水中，振荡混匀，制成10^-1稀释液。
（2）取10^-1稀释液1ml，加入9ml无菌生理盐水中，制成10^-2稀释液。
（3）取10^-2稀释液0.1ml，涂布于营养琼脂平板上，用接种环划线。
（4）将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中培养24小时。
2. 绿脓杆菌的鉴定（1）观察分离得到的菌落，挑选典型菌落，用接种环挑取少量菌体，进行革兰氏染色。
（2）在显微镜下观察菌体形态，记录结果。
（3）进行氧化酶试验，观察菌体是否产生颜色变化。
五、实验结果与分析1. 绿脓杆菌的分离经过培养，营养琼脂平板上出现典型的绿色菌落，符合绿脓杆菌的特征。
2. 绿脓杆菌的鉴定（1）革兰氏染色：菌体呈革兰氏阴性，呈短杆状，两端钝圆，无芽孢，无荚膜。
（2）氧化酶试验：菌体产生颜色变化，说明具有氧化酶活性。
根据实验结果，分离得到的菌落符合绿脓杆菌的特征，可初步判断为绿脓杆菌。
六、实验结论通过本次实验，我们成功分离和鉴定了绿脓杆菌。
实验过程中，我们掌握了绿脓杆菌的分离、培养和鉴定方法，了解了绿脓杆菌的生物学特性，为后续研究绿脓杆菌的致病机制和防治提供了基础。
简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法
简述桶装水中铜绿假单胞菌的几种检测方法作者：马慧娟徐慧高宏来源：《食品安全导刊·中旬刊》2019年第03期引言铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），也称为绿脓杆菌，属于假单胞菌属。
广泛分布于自然界（土壤、空气、水源等）及正常人皮肤、肠道和呼吸道，大小为（1.5～3.0）μm×（0.5～0.8）μm，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。
该菌在普通培养基上生长良好，专性需氧，菌落形态不一，多数直径在 2～3 mm，边缘不整齐，扁平湿润。
在血琼脂平板上形成透明溶血环。
铜绿假单胞菌是一种重要的水源性致病菌，广泛存在于各类型水中，对消毒剂、干燥、紫外线等理化因素具有很强的抵抗力，可引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。
目前检测铜绿假单胞菌的标准中采用的主要是传统生化方法，包括分离培养、生化鉴定等，不能实现大批量水样的快速检测。
近几年，随着科技的发展，检测铜绿假单胞菌的方法多种多样，本文对近年铜绿假单胞菌检测技术进行综述，为铜绿假单胞菌的快速、准确检测研究技术提供参考。
铜绿假单胞菌检测技术国标滤膜法检测桶装水中铜绿假单胞菌的方法是GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》。
铜绿假单胞菌产色素分为三种：产绿脓菌素，产青脓素，产红脓素;铜绿假单胞菌在4℃不生长而在42℃可以生长;具有氧化酶，可以使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物：可以产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加纳氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色络合物;根据这些生化特性，通过滤膜过滤将铜绿假单胞菌富集到CN琼脂上，再用生化试剂管进行生化鉴定。
也可以用VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定系统用于微生物鉴定，准确率高，可用于微生物实验室的日常检测工作。
实时荧光定量PCR检测外毒素 A 基因在铜绿假单胞菌中高度保守，根据 GenBank 中铜绿假单胞菌外毒素A基因片段序列，设计特异性引物及TaqMan探针，并利用实时荧光 PCR技术，对目标靶序列进行特异性扩增，建立了一套检测食品中铜绿假单胞菌的方法，特异性试验和灵敏性试验良好，该检测方法具有特异、快速的特点，能够满足检测要求，为食品中铜绿假单胞菌的快速检测奠定了基础。
绿脓杆菌数量检测标准值
绿脓杆菌数量检测标准值
绿脓杆菌是一种广泛存在于环境中的革兰氏阴性菌，它可以通过接触污染的物体、水或土壤而传播给人类。
通常情况下，绿脓杆菌对健康个体无害，但对于免疫力低下者或患有慢性疾病者，则可能引起严重的感染。
检测标准值
绿脓杆菌数量检测主要用于评估个体是否存在感染或携带绿脓杆菌的情况。
不同检测方法具有不同的标准值：
痰液培养：
无绿脓杆菌检出：无感染迹象
≥10^5 CFU/mL：存在绿脓杆菌感染
尿液培养：
无绿脓杆菌检出：无感染迹象
≥10^4 CFU/mL：存在绿脓杆菌感染
血液培养：
无绿脓杆菌检出：无感染迹象
任何数量：存在绿脓杆菌感染
影响因素
检测结果可能受以下因素影响：
采样方法：不同采样方法（如痰液、尿液或血液）可能影响菌株数量。
样本处理：样本处理不当会导致菌株死亡或生长，从而影响检测结果。
实验室技术：不同实验室使用的检测方法和技术差异可能会导致结果差异。
临床意义
绿脓杆菌数量检测有助于诊断和监测绿脓杆菌感染。
检测结果有助于：
确定感染的存在和严重程度
指导抗生素治疗的选择
监测治疗的疗效
评估感染控制措施的有效性
注意事项
检测结果仅作为诊断和监测的辅助手段，应结合患者的临床表现和病史综合评估。
标准值可能因不同实验室或检测方法而异，应咨询具体检测机构。
绿脓杆菌携带者并不一定表现出感染症状，但仍可能将绿脓杆
菌传播给免疫力低下者。
对于免疫力低下者，应进行定期绿脓杆菌筛查，以早期发现和治疗感染。
化妆品中绿脓杆菌的检验与鉴定1
化妆品铜绿假单胞菌检验与鉴定若干问题的探讨摘要依照GB/T 7918.4—87标准对化妆品进行绿脓杆菌的检验，近期从不同类别的化妆品中检出四株铜绿假单胞菌及多株恶臭假单胞菌等假单胞菌。
本文对铜绿假单胞菌检验与鉴定过程中应用十六烷三甲基溴化铵和乙酰胺作为选择性分离培养基，采用微量管手工鉴定与API 20NE、VITEK生化鉴定仪器鉴定进行比较，对不同鉴定方法出现的情况进行了分析和讨论。
关键词铜绿假单胞鉴定分析Discussion of Detection and Identification of Paeudomonasaeruginosa in ComesticsAbstact According to Standards GB/T7918.4-87, we recently detected 4 Paeudomonas aeruginosa and several Pseudomonas putida in varied comestics. This article analysed the adoption of Cetrimide Agar and Acetamide Agar, comparing Synchron artificial identification and API 20NE as well as VITEK.Key words Paeudomonas aeruginosa Identification Analyisis1材料、仪器与方法1.1 材料、仪器样品来源：汕头口岸进出境的化妆品。
主要试剂：SCDLP液体培养基、十六烷三甲基溴化铵、乙酰胺等培养基，革兰氏染液等购自北京陆桥公司、绿脓杆菌微量生化鉴定管，购自广东环凯公司；氧化酶试剂、API 20NE 测试条、VITEK GN/GNI测试卡购自法国生物梅里埃公司。
仪器：VITEK-32型、VITEK2为法国生物梅里埃公司产品。
绿脓杆菌体外抗生素敏感试验的研究及应用
１ ３为 无 效 。 ／
６ ． ｄ（ 短 ２ ｄ 最 长 ２ ５ 其 余 各 组 除 ５ Ｕ ３５ 最 ７， ２ ｄ） ０／
（． １ 吉林 大 学 中 日联谊 医院 ， 林 长春 １０ ３ ； ． 吉 ３０ １ ２ 吉林 大 学南 岭 校 区医 院 ；． ３ 吉林 油 田职工 医院 ）
绿 脓 杆 菌 在 抗 原 构造 上 具 有 菌 体 抗 原 ［ ０抗 原 ］
８Ｏ 雕 生 素 Ｂ２５０ ｇ ￣ ， 别 滴 加 于 纸 片 上 ， ｏｕ １ ０ｍ ／ 分 烘
１２ ２ 培 养 基 的制 备 无 菌 配 制 Ｍ —Ｈ 酪 蛋 白 水 ．．
解酶 ， 置厚度为 ４ ｍ的平板培养基 。 铺 ｍ
１２ ３ 药 敏 实 验 ．．
将 大肠 杆 菌 ， 葡 菌 和 绿 脓 杆 菌 金
采 用 不 同 剂 量 的 复 方 庆 大 霉 素 制 剂 ［ 酸 庆 大 霉 素／ 硫 维 生 素 Ｂ２对 绿 脓 杆 菌 进 行 了 Ｋ—Ｂ法 药 物 敏 感 试 ］ 验 ， 以相 同 剂 量 的 单 方 庆 大 霉 素 作 对 照 。 并
ｎ
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大肠 杆菌
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１． ５１
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鸡绿脓杆菌病的流行病学实验室诊断及防控
鸡绿脓杆菌病的流行病学实验室诊断及防控鸡绿脓杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种常见的致病菌，可以引起人和动物的感染。
鸡绿脓杆菌病是一种严重的感染性疾病，对动物健康和养殖业产生严重影响。
本文将介绍鸡绿脓杆菌病的流行病学特点、实验室诊断方法以及防控措施。
一、流行病学特点鸡绿脓杆菌是一种广泛存在于自然环境中的细菌，在土壤、水体、动植物体内都有分布。
鸡绿脓杆菌感染的传播途径主要包括接触感染和空气传播两种。
鸡绿脓杆菌感染的易感宿主包括家禽、家畜等动物，以及人类。
在养殖场和养殖环境中，鸡绿脓杆菌感染可以通过粪便、生物膜、饲料和饮水等途径传播，引起鸡、鸭、猪等动物的感染。
鸡绿脓杆菌也可以通过空气传播引起疾病的扩散，病原菌在尘埃和粪便的载体上得到传播。
鸡绿脓杆菌病在养殖场和养殖环境中易于流行。
二、实验室诊断1. 细菌培养鸡绿脓杆菌的实验室诊断主要依靠细菌培养和鉴定。
将样品（如分泌物、组织样本、环境样本）接种到含有适当选择性抑菌剂的培养基上，然后在适当的温度和湿度条件下进行培养。
培养菌落经过纯化和鉴定后，可以进行进一步的生化鉴定和分子生物学鉴定，以确定其属于鸡绿脓杆菌。
2. 药敏试验对分离得到的鸡绿脓杆菌菌株进行药敏试验，确定其对常用抗菌药物的敏感性和耐药性。
根据药敏试验结果，可以选择合适的抗菌药物进行治疗。
三、防控措施1. 养殖环境清洁保持养殖环境的清洁卫生是预防鸡绿脓杆菌病的关键措施。
定期清洁和消毒饮水设施、饲料槽、粪便处理设施等，减少病原菌的传播途径。
2. 动物管理加强对养殖动物的管理，提高个体免疫力。
定期对动物进行健康检查，发现疾病早期症状及时隔离和治疗，减少病原菌扩散。
3. 合理用药4. 个人防护在接触感染患者和潜在感染源的情况下，应加强个人防护，使用口罩、手套、防护服等防护用品，减少感染的风险。
鸡绿脓杆菌病是一种严重的感染性疾病，在养殖业中易于流行。
通过实验室诊断和防控措施的综合应用，可以有效预防和控制鸡绿脓杆菌病的发生和传播，为动物健康和养殖业的发展提供保障。
绿脓杆菌检测方法
绿脓杆菌检测方法
一、基本原理
绿脓杆菌是革兰氏阴性杆菌，具有产生绿色色素和氧化酶等生化实验特征，因此，可利用选择性培养基培养、菌体检验和生化试验进行鉴定。
二、主要设备和材料
恒温培养箱、显微镜
三、培养基和试剂
NAC液体培养基、NAC琼脂平皿、普通营养琼脂平皿、糖发酵培养基、尿素培养基、西蒙氏柠檬酸盐培养基、硝酸盐培养基、营养明胶、氧化酶试剂。
四、检测程序
五、操作步骤
1. 采样
采取回盲部内容物、粪便或病灶组织、分泌物。
2. 分离培养
将已接种的NAC液体培养基置37℃恒温培养箱中培养24h后观察生长情况，对未产生绿色色素者转种于NAC琼脂平皿，37℃恒温培养24h。
3. 鉴定
3.1 生长特性及菌落特征
绿浓杆菌在NAC液体培养基中均匀浑浊生长、有菌膜、大部分菌株可在培养液上半部形成绿色色素；在NAC琼脂平皿上形成扁平，边缘不齐呈锯齿状，2～3mm的菌落，大部分菌落可产生绿色色素而致使培养基呈绿色，部分菌株需延长培养时间方可产生色素。
3.2 菌体特征
革兰阴性杆菌，菌体长短不一。
3.3氧化酶试验阳性
被检菌为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性及产生绿色色素，可报告检出绿脓杆菌。
3.4 生化试验
对不产生绿色色素的菌应做如下鉴定，见表1。
表1 绿脓杆菌的主要生化特性
3.5 半固体动力试验阳性
3.6 42℃生长试验阳性
4. 结果报告
凡符合上述各项检测结果者做出阳性报告，不符合者做出阴性报告。
绿脓杆菌检测的方法及注意事项
绿脓杆菌检测的方法及注意事项绿脓杆菌又被称为铜绿假单胞菌，是一种革兰氏阴性菌，形状呈长方形，喜好氧气，只进行单向的运动。
绿脓杆菌是一种机会性感染细菌，对植物也具有机会性感染，因为被感染后渗出液呈绿色，因此而命名。
绿脓杆菌在大自然中广泛分布，是临床上比较常见的条件致病菌之一。
正常人的肠道、皮肤以及呼吸道中也存在绿脓杆菌。
绿脓杆菌分解蛋白质的能力较强且能产生多种与毒力有关的物质，例如：胰肽酶、外毒素a、胶原酶等等。
人体的任何部位及组织都可能发生绿脓杆菌感染。
常见感染部位有呼吸道、角膜、尿道。
绿脓杆菌会使人体免疫受损，虽然并不常见，但绿脓杆菌可能会造成肺炎，若隐形眼镜清洁不当也有机会引起眼角膜绿脓杆菌感染。
那么这种细菌该如何检测呢：下面我们一起来了解绿脓杆菌的检测以及注意事项。
一、绿脓杆菌检测方法由于绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌，它的实验特征为产生绿色色素和氧化酶，因此利用这一特征可以采取选择性培养基进行培养。
然后进行生化实验和菌体检验，检测的主要设备和材料为显微镜及恒温培养箱，选择的培养基和试剂为NAC琼脂平皿、NAC液体培养基糖发酵培养基、尿素培养基、营养明胶、氧化酶试剂等。
检测程序如下：首先制作培养液，将样液放入培养基中，室温控制在37℃静置24小时。
将已经接种的NAC液体培养基放置在恒温37摄氏度的培养箱中培养24小时，然后观察其生长情况。
将并未产生绿色色素的样本转种于NAC琼脂平皿?，同样在37度恒温的环境下培养24小时。
绿脓杆菌在NAC液体培养基中会呈现出均匀浑浊状态，并带有菌膜，大部分菌株能够在培养液上半部分形成绿色色素，在NAC琼脂平皿上会形成边缘不齐且扁平的锯齿状菌落，菌落的直径为2~3毫米。
大部分菌落可以产生绿色色素，从而导致培养基呈现绿色，部分菌落需要延长培养时间才能产生绿色色素。
氧化酶试验若呈现阳性那么可以报告检测出绿脓杆菌，42摄氏度生长试验、生化实验及半固体动力实验均呈阳性，则说明检测出绿脓杆菌。
化妆品中绿脓杆菌的检测
化妆品中绿脓杆菌的检测1．检测绿脓杆菌的意义绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)为革兰氏阴性细菌，属假单胞菌属。
它在自然界分布甚广，空气、水、土壤中均有存在，在潮湿处可长期生存，对外环境的抵抗力比其他细菌强，抗干燥的能力也强。
含水分较多的原料、化妆品易受其污染，绿脓杆菌对人类有致病力，常引起人体的眼、皮肤等处感染，特别是烧伤、烫伤及外伤患者感染上绿脓杆菌常使病情恶化，严重时可引起败血症，眼睛受伤感染后可使角膜溃疡并穿孑L，严重可致失明。
目前，该菌已是防止医院感染和药品、化妆品及水等必须严加控制的重要病原菌之一。
我国化妆品卫生标准规定：在化妆品中不得检出绿脓杆菌，因此，在化妆品中检测绿脓杆菌具有重要意义。
2．绿脓杆菌的生化特性绿脓杆菌是革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，能在普通培养基上生长繁殖，为需氧及兼性厌氧类细菌。
绿脓杆菌能代谢产生一种绿色的水溶性色素，使培养基变成绿色，受它而引起的化脓感染，脓液就常带绿色，因此而定名为绿脓杆菌。
绿脓杆菌可分解葡萄糖；对明胶具有液化、溶解作用；能还原硝酸，盐成为亚硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氢气；绿脓杆菌具有氧化酶(靛基氧化酶)能将试剂(盐酸二甲基对苯二胺或四甲基对苯二胺)氧化成红色的醌类化合物；还可在42℃的温度下生长繁殖。
绿脓杆菌的这些生化特性常用来作为分离和鉴别它的方法。
3．检验操作及结果报告(1)检验操作步骤增菌培养：将试样液稀释无菌操作加入SCDLP液体培养基中，置37'E进行24h分离培养。
该类培养基选择性强，大肠杆菌不能生长，革兰氏阳性菌生长完全受到抑制。
观察培养基上所形成的菌落，典型绿脓杆菌菌落特征是菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩张有水溶性色素。
证实试验：①染色镜检：取上述可疑为绿脓杆菌的菌落，进行革兰氏染色、镜检试验。
②氧化酶试验：挑取可疑菌落(同上)置于滤纸片上，滴加一滴新配制的5％二甲基对苯二胺试剂，15~30min内，出现红色至紫红色，为氧化酶试验呈阳性；若不变色，为氧化酶试验阴性。
绿脓杆菌检验技术讲解
革兰氏染色阳性（Gram Positive）:革兰氏阳性菌由于细胞壁厚、
肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧 密，故在用乙醇洗脱时，肽聚糖网 孔会因脱水而明显收缩，再加上它基本不含类脂，故用乙醇处理不能在 壁上溶出缝隙，因此结晶紫与
碘复合物仍牢牢阻留下其细胞壁内，使其呈现蓝紫色。
硝酸盐还原产气实验：可疑菌落→硝酸 盐蛋白胨水→ 37℃ 24h →小倒管内有 气体产生为阳性，否则阴性。
明胶液化实验：可疑菌落→穿刺接种于 明胶培养基→ 37℃ 24h →取出放冰箱 10~30min
呈溶解状为阳性，不溶解则为阴性。
42℃生长实验 ：可疑菌落→普通琼脂 斜面→42℃ 24h→铜绿假单胞菌生长， 而近似的荧光假单胞菌不能生长 。
细菌的分离培养
原理： 通过划线，将混杂的细菌在平板表面逐一分散，经培养 后，各自形成菌落(colony)。根据菌落形态、特征挑选 单个菌落，移种培养后，即得到纯种细菌。
方法： 平板划线法有几种，可根据不同情况选用其中一种。 (1)平行划线法 此法适用于含菌不多的液体标本，
如脑脊液(CSF)、腹水、分泌物、脓汁以及稀薄 的菌液等。 ①左手斜持平板底，右手持接种环。接种环在火焰 上灭菌，冷却后，沾取一接种环标本，先在平板 的一端涂开，并从此处开始向下划密集的平行线， 约占平板面积的一半。 ②将平板转180°角，从平板另一端开始也划密集 的平行线，直到划满平板的剩余部分。 将平板底放入盖内，接种环火焰灭菌后放下，将平 板倒置，37℃培养。
操作步骤
检样前化妆品的处理 接样于营养肉汤增菌，37℃， 12h，140rpm培养 分离培养，挑取培养物接于十 六烷基三甲基溴化铵平 板， 37℃，18-24h
染色镜检
绿脓杆菌检验技术
注意事项：
酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如脱色过度，
则革兰氏阳性菌可能被误染为革兰氏阴性菌，如脱色
不够，则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰氏阳性菌，
所以脱色时间要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片
厚薄的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均匀为
好。
精品课件
被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的不同等原因 会影响染色结果，如革兰氏阳性菌的陈旧培养物也有 出现革兰氏阴性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好 在18~24h之内。
加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面
2.明胶培养基300ml
加热溶解 调pH 分装试管 高压 直立制成高层
3.硝酸盐蛋白胨水培养基300ml
精品课件
加热溶解 调pH 分装有小倒管的试管 高压 直立制 成高层
4.普通琼脂斜面培养基300ml
加热溶解 调pH 分装试管 高压 制成斜面
注意事项
1. 培养基溶解时，加有琼脂的培养基易 沸，应注意看守。
微生物生长繁殖所需要的营养物质，用人工方法配制而成的
营养基质。
精品课件
除营养条件以外，微生物必须在最适酸碱度范围内才表现
出最大生命力，因此，应针对不同的微生物将培养基的pH
值调节到适当范围。
操作步骤
按培养基 配方称量
加水加
调节
热熔化 → pH值
分装 包装
精品课件
灭 备用
操作步骤
1.绿脓菌素测定用培养基300ml
不变色（-） 不变色（-） 无气体（-） 未溶解（-）
不生长（-）
实验一 培养基的制备及精品课细件 菌的 分离培养
实验目的
掌握培养基制备的原理和方法 精品课件
掌握细菌的分离培养 了解灭菌方法
浅析基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法
浅析基于PCR技术的绿脓杆菌快速检测方法发表时间：2016-11-23T13:52:27.617Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2016年7月第14期作者：黄晓光[导读] 研究表明PCR技术的应用能够快速简便的检测出绿脓杆菌的存在及鉴定。
河南省许昌县疾病预防控制中心河南许昌 461000【摘要】聚合酶链式反应（PCR技术）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
本文采用该反应设计研究绿脓杆菌的快速检测方法，设计绿脓杆菌特异性的PCR扩增ETA 基因序列设计的，同时考察该PCR方法的特异性和敏感性。
另外，一种不提取基因组DNA而直接制备简易模板的直接PCR方法。
研究表明PCR技术的应用能够快速简便的检测出绿脓杆菌的存在及鉴定。
【关键词】绿脓杆菌；PCRETE1；决速检测1、前言绿脓杆菌是一种非常常见的治病细菌，在空气、水、土壤中都有分布，会导致人们的皮肤化脓感染，如果有烧烫伤和眼部疾病的患者感染了这种细菌，会让加剧病人的病情，严重者还会导致败血症。
绿脓杆菌的检测，大多是建立在这种细菌的生物学特征的基础之上：绿脓杆菌属于革兰氏阴性杆菌，其氧化酶呈阳性，会有其独特的绿脓菌素产生[1-3]。
另外，绿脓杆菌的生存条件是在42℃，并且有还原性，可以把硝酸盐还原成亚硝酸盐。
这种检测方法在实际操作中需要耗费大量的时间与精力，如果样品量比较多，这种方法的缺点就暴露无疑，效率低下，并且在临床上还有可能延误诊断和治疗。
所以急需一种能够高效率的绿脓杆菌检测方法。
分子生物学的发展，为细菌、病毒基因的检测带来了新的契机，并且可以大大提高检测和鉴定效率。
Saint-Onge等和Mayer 分别提出了利用PCR技术检测绿脓杆菌。
本文在此基础上，也提出一种绿脓杆菌的PCR检测技术，这种技术主要是利用绿脓杆菌外毒素A（ETA）基因。
2、材料与方法2.1材料2.1.1菌株绿脓杆菌ATCC15442由湖北省疾病预防控制中心赠；其它实验菌株均为本实验室从环境样品中采集分离所得。
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氧化酶试验：取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1％二甲基对苯二胺试液，30 s内出现粉红色或紫红色，为氧化酶试验阳性，不变色者为阴性。
绿脓菌素试验：取2～3个可疑菌落，分别接种在绿脓菌素测定培用养基斜面，35℃±2℃培养24 h，加入三氯甲烷3～5 mL，充分振荡使培养物中可能存在的绿
有限公司
文件编号
WI-03-33
版号
A.0
绿脓杆菌的测定方法
页次
生效日期
2020/01/02
脓菌素溶解，待三氯甲烷呈蓝色时，用吸管移到另一试管中并加入1 mol/L的盐酸1 mL，振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性，表示有绿脓菌素存在。
硝酸盐还原产气试验：挑取被检菌纯培养物接种硝在酸盐胨水培养基中，置35℃±2℃培养24 h，培养基小倒管中有气者即为阳性。
5．记录保存：
5.1．质检保管5年。
6．相关操作规程
6.1．电热鼓风干燥箱操作规程
6.2．HWS-12型电热恒温水浴锅操作规程
6.3．生化培养箱操作规程
6.4．YX手提式压力蒸汽消毒器操作规程
6.5．净化工作台操作规程
7．相关记录
7.1. 生物性能检测记录。
编制：
日期：
审核：
日期：
批准：
日期：
4.2 器具
烧杯（250ml）、量筒（100ml）、三角烧瓶（250ml）、试管、硅胶塞、白金耳、酒精灯、培养皿（φ90mm）、刻度吸管（1ml,5ml，20ml）
4.3 培养基、菌种：
SCDLP培养液、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基、染色液（革兰氏染色用）、绿脓菌素测定用培养基、酸盐胨水培养基、明胶培养基、琼脂培养基、乙酰胺培养基、普通琼脂斜面培养基。
明胶液化试验：取可疑菌落纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置35℃±2℃培养24h，取出放于4～10℃，如仍呈液态为阳性，凝固者为阴性。
42℃生长试验：挑取可疑培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，置42℃培养24～48 h，有绿脓杆菌生长为阳性。
4.6结果报告
被检样品经增菌分离培养后，证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓杆菌试验均为阳性者，即可报告被检样品中检出绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中检出绿脓杆菌。
4.4 器具灭菌：
与样液接触的所有器具（刻度吸管、培养皿等）应按下述方法灭菌：包好后置手提式压力蒸汽消毒器内121℃20分钟高压灭菌，或置于电热恒温鼓风干燥箱内160℃2小时干热灭菌。
4.5 操作步骤
取样液5 mL，加入到50 mL SCDLP培养液中，充分混匀，置35℃±2℃培养18～24 h。如有绿脓杆菌生长，培养液表面呈现一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板，置35℃±2℃培养18～24 h，观察菌落特征。绿脓杆菌在此培养基上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不长。
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WI-03-33
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A.0
绿脓杆菌的测定方法
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2020/01/02
1．目的
制订绿脓杆菌的测ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ方法，对从事检测的操作人员进行培训指导，按测定方法操作。
2．适用范围:
本方法适用于绿脓杆菌的测定。
3. 职责
质检部对本测定方法实施负责。
4.程序
4.1 仪器
电子天平、电热恒温鼓风干燥箱、净化工作台、手提式压力蒸汽消毒器、电热恒温水浴锅、生化培养箱 、显微镜