微生物实验(6)

• 3. 方法
弃去
TO
TH PA PB
1
2
3
4
5
6
7
1.倍比稀释血清 0.5mlNS+0.5ml 血清 2.加四种菌液 （顺序：从后往 前） 3. 37℃18-24h 观察结果
• 效价判断：以出现++的血清最高稀释度为抗体效价。 • 肥达氏反应诊断意义:
O效价
升高 不高 不wenku.baidu.com 升高
H效价
升高 不高 升高 不高
诊断意义
感染可能性大 感染可能性小 预防接种或回忆反应 早期反应或交叉反应
肠道杆菌的鉴定
河南大学医学院 娄强
qiang_lou@126.com
目的要求
• 掌握肠道杆菌的主要生物学性状
• 熟悉肠道杆菌有关的鉴定方法
脓血便、肛拭子 标本 SS平板,中国兰,EMB平板 选择/鉴别培基
克氏双糖铁培养基, 动力-靛基质-尿素 半固体琼脂培养基
血清学鉴定
生化反应
玻片凝 集试验
（一）肠道杆菌的形态、染色 及在选择培养基上的生长情况
• • • • [材料] 菌种：大肠杆菌、痢疾杆菌培养物 培养基：SS平板、EMB 标本片：大肠杆菌、痢疾杆菌
SS琼脂平板
（1）营养物质：牛肉膏、蛋白胨 （2）抑制剂：胆盐、枸椽酸盐、煌绿等，抑 制非致病菌的生长；但胆盐能同时促进病 原菌的生长。 （3）鉴别用糖：乳糖 （4）指示剂：中性红
SS琼脂培养基选择培养原理
[方法]
• 1、克氏双糖铁斜面培养基：分别取大肠杆菌、变形杆菌 的培养物，用穿刺加斜面划线接种方法接种于2支克氏双 糖斜面培养基，37℃培养18-24h以后观察结果。
• 2、生化反应管：取葡萄糖、乳糖等反应管，每种反应管 分别穿刺接种大肠杆菌、痢疾杆菌，37℃培养18-24h以后 观察结果。
• 3、动力试验：分别取大肠杆菌、痢疾杆菌的培养物，用 穿刺接种方法接种于2支半固体培养培养基，37℃培养1824h以后观察结果。
[方法]
• 1、分离培养、观察菌落特征：分别取大肠、 痢疾杆菌培养物，用分离划线方法接种SS 平板或EMB培养基37℃培养18-24h以后观察 结果（记录）。
• 2、革兰染色、观察形态学特征：取各菌培 养物少许涂片，革兰染色、镜检（画图）。
(1) SS平板
• (2) EMB 平板
大肠杆菌
致病菌
SS或EMB培养基生长现象观察
EMB菌落的 形态特征 大肠杆菌
SS菌落的 形态特征
痢疾杆菌
（二）肠道杆菌生化反应及动力试验
• [材料] • 1、菌种：大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、 培养物 • 2、培养基：克氏双糖斜面培养基、生化反 应管、半固体培养基 • 3、其他：接种环、接种针、酒精灯等。
克氏双糖斜面培养基生化反应原理
该培养基含葡萄糖与乳糖的比例为1:10，并含硫酸亚铁和指 示剂酚红。 • 大肠杆菌发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，所以培养基呈黄色， 直立段有气泡存在． • 肠道病原菌不能发酵乳糖，只能发酵葡萄糖，分解葡萄糖 产酸，使PH下降，斜面部分先呈现黄色，由于葡萄糖含量 少，所生之酸接触空气而氧化，又因细菌的生长利用含氮 物质生成碱性化合物，所以斜面部分后来又变成红色．由 于直立段(底层)呈厌氧状态，细菌发酵葡萄糖所生的酸不 被氧化，所以一直呈黄色。大肠杆菌产气，有动力(沿穿 刺线向周围扩散生长)伤寒杆菌有动力，而痢疾杆菌则没 有动力． • 某些细菌如变形杆菌，乙型副伤寒杆菌能分解培养基中含 硫氨基酸（如胱氨酸）产生硫化氢、硫化氢与硫酸亚铁中 的亚铁离子结合形成黑色的硫化铁，而痢疾杆菌不产生硫 化铁．
结果观察
克氏双糖铁
生化反应管
乳糖
葡萄糖 硫化氢 黄 色 黄 色 黄 色 黄 色
尿素
葡萄糖
乳糖
动 力
大肠杆菌 伤寒杆菌 痢疾杆菌 变形杆菌
黄 色 红 色 红 色 黄 色
-
-
+ + + +
+ -
+ + +
+ +
+
肥达氏反应
• 原理 用已知伤寒杆菌O/H抗原（TO/TH）和 甲乙型副伤寒杆菌H抗原（PA/PB）与患者 血清做定量凝集实验，以测定患者血清中 有无相应抗体，根据抗体含量多少及增长 情况可辅助诊断伤寒及副伤寒。 • 2.材料 待检患者血清，TO/TH/PA/PB菌液， 生理盐水，试管，1ml吸管等。
伊红美兰琼脂培养基(EMB)选择培养原理
• 此培养基为弱选择性培养基。以伊红美兰作指示 剂． • （１）大肠杆菌分解乳糖产酸时染上伊红，因为 伊红和美兰结合所以菌落不是红色而呈现紫黑色， 且有金属光泽(大肠杆菌)或棕色(产气杆菌)，扁 平混浊、边缘色淡的菌落。 • （２）致病菌的菌落为无色半透明、园形，中等 大小，边缘整齐的菌落，在靠近大肠杆菌的可疑 菌落往往呈现淡兰色。
• 此培养基是强选择性培养基，柠檬酸钠和煌绿对大肠杆菌 的生长，对菌体蛋白质的合成起强的抑制作用，而对肠道 致病菌则无抑制作用。柠檬酸钠能缓和胆酸盐对肠道致病 菌的有害作用，并能中和煌绿和中性红等染料的毒性。中 性红为指示剂，酸性时呈现红色，碱性时呈淡黄色。 大肠杆菌分解乳糖产酸，通过中性红显色，菌落大而混浊， 呈现红色． • 志贺氏菌属和沙门氏菌属的细菌不分解乳糖，而分解蛋白 质产生碱性物质，菌落形态为光滑微黄透明，园形、中等 大小，边缘整齐的菌落。 • 由于宋内氏痢疾杆菌有分解胆盐中的某些物质和发酵乳糖 (产酸)较慢等特点，而使菌落呈淡红或红色、较大或边缘 不整齐的扁平菌落。某些沙门氏菌属及变形杆菌因 产生硫 化氢，使菌落呈现黑色中心。