第十章 植物种质的超低温保存讲解
(种子学课件)种子超低温贮藏
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
4.添加冷冻保护剂 常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG等，也有报道脯氨酸的效果很好。 使用冷冻保护剂的量应是足够起到冷冻保护作用，但 又不超过渗透能力和中毒的界限。 （渗透性冷冻保护剂主要包括二甲基亚砜、甘油、聚乙二 醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其保护机制是在细胞 冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外 产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电 解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤， 同时细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱 水皱缩。在使用渗透性冷冻保护剂时，需要一定时间 进行预冷，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作 用。)
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
植物细胞组织和器官超低温保存
低温保存是种质资源短期和中期保存常用的方法。
主要适用再生植株、分生组织培养物的保存
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2. 干燥保存
将愈伤组织或体细胞胚等培养物，适当干燥失水，移入适 宜的低温下，可成功保存种质。 （1）预处理：将蔗糖浓度增至0.15mol/L或更高，预处理 12-20d。 （2）干燥：包括胶囊化处理（encapasulation treatment） 和脱水处理（desiccation treatment）等方法。 （3）储藏：通常选用0℃以上低温，或室温储藏。
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当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰 晶损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则 可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻 保护剂容易同溶液中的水分子结合，从而降低冰 点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度降低 未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质损 伤，细胞得以在超低温条件下保存。
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一、限制生长保存
限制生长保存（restricting conservation）是指改 变培养物生长的外界环境条件，限制离体保存材料 的生长速度，使细胞生长降至最小限度，但不死亡， 从而达到延长继代培养时间的目的。
目前使用较多的限制细胞生长的措施有改变培养 环境（如降低培养温度、减少培养瓶内氧气含量、 减少光照等）、提高培养基渗透压、加入生长抑制 剂、饥饿法、失水干燥保存等。
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(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大的 液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来，不 适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在的 条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的降 温速度(一般1~2℃／分较好)。降到-70℃左右，随 即浸入液氮，或者以此种速度连续降到-196℃。在 这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的时 间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少 到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内结 冰。该方法适用于成熟含有大液泡和含水量高的细 胞。
植物种质的超低温保存
在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。
a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差 异 b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达到抑制 作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不 同。 c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则 可能无效。
实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃 薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二 甲基氨基琥珀酰胺酸（B9）、矮壮素（CCC）可以使葡萄试 管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与 一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。
d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻 存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切 取时对材料的伤害。 e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬 季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬 季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以 动机去才有较高的存活率
10.2.2材料的预处理
预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是 减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼， 以有效提高组织活细胞的抗冻能力。 •在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些 可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱 落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（DMSO）等，最 常用的方法是增加培培养基中蔗糖的浓度。
• （1）种子保存 目前常用的种质保存方法有以下几类： 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长期保存是防止良种衰变的一条重 要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降， 而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。
•
10.2.3.2保护剂预处理
配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里， 或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细 胞的渗透冲击，保护剂应在30~60min内逐 渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于 DMSO有一定毒性，所以预处理应该在0℃ 左右的低温下进行。处理时间也不能过长， 一般不宜超过1h。
种子超低温贮藏
超低温贮藏的应用
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极大地延长储藏种子的寿命， 而不产生遗传变异
从而有效地、 安全地长期保存那些珍贵稀有的种质资源,，起到了保存和抢救濒危物 种的作用。（例如红豆杉）
安全地保存许多植物的花粉、分生组织、芽、愈伤组织和细
胞等。 利用液氮超低温保存花粉
已经在作物、蔬菜( 包括西甜瓜) 、果树 、花卉苗木、茶树、药材等植物上取得了
不同种类种子对液氮低温反应的差异
2、外在因素对种子对液氮反应的影响
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1.根据种子对液氮低温的反应，种子分为： ①种子含水量对种子对液氮反应的影响 ⑴耐干燥又耐液氮的种子(desiccation-tolerant LN2-tolerant seed)： 种子含水量过高在冷冻和解冻过程中死亡，含水量过低又会导致种子
同种子含水量有关，假如种子含水量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对
多数种子的成活率没有明显影响。
种子超低温贮藏的技术关键
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1.寻找适合液氮保存的种子含水量：只有在合适的含水
量范围内，种子才能在液氮内存活。
2.冷冻和解冻技术：不同种子的冷冻和解冻特性有差异，需
分别探讨，以掌握合适的降温和升温速度。
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液氮罐
低温储藏柜
超低温冷冻储藏箱
超低温贮藏的特点
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不需要机械空调设备及其他管理，冷源是液氮， 容器是液氮罐，设备简单，保存费用只相当于种 质库保存的1／4。
液氮保存的种子不需要特别干燥，能省去种子的
活力监测和繁殖更新，是一种省事、省工、省费
用的种子低温保存新技术。
适合于长期保存珍贵稀有种质
种子的超低温贮藏
种子贮藏的重要性
优良种子是健壮植株的首要条件。一般来说，作物的种子从 收获到播种都要经过一段贮藏时间。在这个时期内, 贮藏条件与 管理水平将直接影响种子的生活力及萌发情况。 科学的贮藏方法可以使种子寿命延长、生活力旺盛, 并且能保证 作物出苗早、整齐、健壮; 但是如果贮藏方法不合理, 则种子易 霉烂、变质, 生活力降低, 播种后易造成缺苗、断垄, 给农户带 来惨重的损失。
植物种质资源的超低温保存
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｇ ｅ ｒ ｍｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｉ ｓ ｏ ｕ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｍｏ ｓ ｔ ｉ ｍｐ ｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｗ ｏ ｒ ｌ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｆ ｏ ｒ ｅ ，ｉ ｔ ｈ ａ ｓ ａ ｎ
Ｓ ｏ ｎ ｇ Ｙ ｏ ｕ ｙ ｕ ａ ｎ ， Ｈ ｕ ａ ｎ ｇ Ｊ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ａ ｎ ， Ｚ ｈ ａ ｎ Ｚ ｈ ｉ ｙ ｏ ｎ ｇ
（ １ ． Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ｓ ｈ ａ ｎ ｈ ｅ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｏ ｎ ｓ ｕ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｆ ｉ ｒ ｍ Ｃ ｏ ， Ｌ ｔ ｄ ， Ｎ ａ ｎ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ ３ ３ ０ ０ ３ ８ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ； ２ ． Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｙ ， Ｎａ ｎ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｘ ｉ ３ ３ ０ ０ １ ３ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
２ ０世 纪 ９ Ｏ年 代 ， 植 物种 质 资源 （ ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｇ ｅ ｒ ｍｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｒ ｅ Ｓ Ｏ Ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ） 就 已 成 为全 球性 共 同关 注 的课 题 。 是 研 究
ｇ ｅ ｒ ｍｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｌ ￣ ｅ ｓ ．
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ：ｐ ｌ ａ ｎ ｔ ｇ ｅ ｒ ｍｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｒ ｅ ｓ ｏ ｕ ｒ ｃ ｅ ｓ ； ｃ ｒ ｙ ｏ ｐ ｒ ｅ ｓ ｅ ｒ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ； ｉ ｎ ｌ ｆ ｕ ｅ ｎ ｃ ｅ￣ｃ ｔ ｏ ｓ ｒ
(种子学课件)种子超低温贮藏
物种，目前还只能无性保存。如果建立了超低
温冷冻保存技术，可改进这类植物种质长期保 存的方法从而改良育种和繁殖技术。
3.对干燥和液氮均敏感的种子 这类种子就是顽拗型种子，它们的
寿命很短，难以保存。
三、种子超低温贮藏的技术关键
1.寻找适合液氮保存的种子含水量 只有 在合适的含水量范围内，种子才能在液 氮内存活。
表2 几种作物种子冷冻时含水量பைடு நூலகம்临界值
较多的研究报道认为，冷冻和解冻速率对多数
植物种子冷冻到液氮温度影响不大。然而莴苣 和芝麻种子却不一样。Roos(1981)用莴苣种子 做试验，其含水量接近于HMFL值即19％，发 现用200℃／min的速率冷冻几乎百分之百的成 活，若用22．2℃／min或更低的速度冷冻，生 活力明显下降。水分非常低的芝麻种子以1～ 30℃／min缓慢冷却时，几乎100％存活而不受 水分的影响。但以200℃／min冷冻时，种子生
活力随含水量下降而下降。冷冻速率对种子生
活力的影响同种子含水量有关，假如种子含水
量在适宜范围内，则慢速或快速冷冻对多数种 子的成活率没有明显影响。
在冷冻和解冻过程中，由于温度的剧烈变 化，种子要经受极大的物理压力。如果 种子的细胞间质承受不了这种压力，就 会产生物理损伤。当种子在回升到室温 之前在液氮蒸汽上停留一段时间可减少 损伤，因此损伤产生在冷冻和解冻过程 中。当种子只暴露在液氮气相中（约150 ℃），种子没有损伤，小部分损伤发 生在-150 ℃~-196 ℃之间。
2.冷冻和解冻技术 不同种子的冷冻和解 冻特性有差异，需分别探讨，以掌握合 适的降温和升温速度。
3.包装材料的选择 根据报道，包装材料 有牛皮纸袋，铝箔复合袋等。有的包装 材料能使种子与液氮隔绝，如种子与液 氮直接接触，有些种子会发生爆裂现象， 而影响种子的寿命。
种子学吕世琦种子的超低温贮藏
种子超低温贮藏的优点
1. 超低温贮藏保存植物种子，选择适当的 冷冻容器后， 除了 30～60天补充一次液氮外， 不需要机械空调设备 及其它管理，节省了大量 的人力和物力 ，是一种省时、省工 、省费用的 种质保存新技术 2.可保持被保存种子的遗传稳定性 ，适合 于长期保存珍贵稀有种质
种子超低温贮藏的技术关键
不同的包装材料对种子的发芽率和生长势有不同的影响，有试验表 明，液氮保存种子使用聚乙烯塑料袋和铝箔包装材料好于牛皮纸包装。
包装材料 聚乙烯塑料袋 牛皮纸 铝箔
发芽率% 94.00a 78.00b 95.33a
生长势 76.69a 78.56a 77.53a
不同包装材料对超低温保存红小豆种子发芽率和生长势的影响
种子超低温贮藏的技术关键
3.适宜的种子含水量
植物种子液氮保存时都有一个适宜的含水量范围液 氮保存并非含水量越低越好 ，含水量降到一定极限则产 生脱水损伤 ，导致种子发芽能力伤失。有实验表明低含 水量 (7％ 一9％)的种子保存 在液氮 中的 发芽率低于自然 风干种子(12％ ～14％)的发芽率 。
2. 可以避免种质保存过程中的自然变异，保证种
质的遗传稳定性，同时有利于种质在国际间的交
换。
参考文献 1、张玉凤，董经纬，，蒋菊生，黄绵佳. 种子贮藏 的研究进展. 安徽农业科学，2007,35（19）： 5855-5856. 2、赵跃平，燕平梅，邢勇，张小冰，王小丽. 作物 种子超低温保存方法的构建. 种子科技， 2012,09:27-30 3、文彬，种子贮藏生理学发展史概略.自然辨证法 通讯，2008,30（177）：69-74 4、T. L. Malkin, A. Goddard, D. E. Heardetal.. Measurements of OH and HO2 yields from the gas phase ozonolysis of isoprene[J]. Atmospheric Chemistry and Physics, 2010, 10(3).
种质资源超低温冷冻保存
种质资源超低温冷冻保存
晏月明
【期刊名称】《世界农业》
【年(卷),期】1990(000)010
【摘要】超低温冷冻保存是70年代发展起来的一项现代保存技术,随着研究的不断深入和完善,近年来已取得了显著进展。
超低温保存是将植物种质(包括种子、花粉、胚原、生质体、细胞组织和器官等)贮存在-196℃的液态氮中。
由于在此温度下几乎所有的新陈代谢活动都处于暂停状态,因此从理论上讲,液氮保存可使植物种质得到无限期保存。
此外,液氮保存系统稳定可靠。
【总页数】3页(P25-27)
【作者】晏月明
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】S325
【相关文献】
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3.超低温冷冻保存对西伯利亚鲟精子酶活性的影响 [J], 周洲; 李世凯; 赵飞; 陈飞雄; 孔杰
4.棘皮动物精子超低温冷冻保存技术研究进展 [J], 许帅;孙景春;刘石林;林承刚;张立斌;孙丽娜;杨红生
5.兰州鲇精液超低温冷冻保存技术研究及细胞损伤检测 [J], 邢露梅;肖伟;李兰兰;张利平;赛清云;俞兆曦;吴旭东;连总强
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第十章植物细胞组织与器官超低温保存
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
2 . 基本程序 (1) 材料的准备与选择。 (2) 预处理。 (3) 将材料装入试管，并随即插入冰浴中。 (4) 加入0℃预冷的冰保护剂，在0℃(冰浴中)放置30一
45分钟。
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
四、超低温保存的基本设备和程序 1. 主要仪器设备
(1) 用于组织和细胞培养的全套设备； (2) 普通电冰箱； (3)-70 ℃- -80℃的低温冰箱； (4) 程序降温器；
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
(5) 玻璃或塑料试管（5ml 或10 m1），封盖严密， 不进液氮； (6) 液氮; (7) 光学显微镜和紫外荧光显微镜； (8) 分光光度计.
3．冰冻保护剂 迄今，已经报道了多种类型的冰冻保护剂。
常用的是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、糖和 糖醇类物质、氨基酸、多肽及聚乙二醇等。 但作为冰冻保护剂的物质应该具备以下特性： （1）易溶于水； （2）在适当浓度下对细胞无毒； （3）化冻后容易从组织细胞中去除。
第十章植物细胞组织和器官超低温 保存
(5) 降温冰冻：
a 直接投入液氮； b 程序慢速(0. 5- 5 ℃／分)降温到液氮； c 慢速降温到预冻温度 (-30 - 0℃)，停留一段时间(1-3小时) 后投入液氮， d 逐级降温后投入液氮， 如：0 －-10℃，5分； -15 ℃, 5分； -23℃, 5分；-30℃，5分；-40℃，5分； -196℃(液氮）
(2)预培养，增加培养基中的糖浓度，提高渗 透压；或在预培养基中加入诱导抗寒力的物质 或冰冻保护剂，如脱落酸(ABA)，山梨糖醇、 脯氨酸及二甲基亚砜(DMSO)等。
细胞生物学课程论：植物种质的超低温保存研究
细胞生物学课程论文植物种质的超低温保存研究摘要：植物超低温保存技术在濒危植物资源的保存中发挥着巨大的作用，并正处于快速的发展中，已经能够较为有效、安全地长期保存一些珍贵稀有的种质。
本文先介绍了超低温保存的意义，之后详细叙述了超低温保存的步骤与不同的方法，阐述了当下此技术的研究进展与问题，并对今后此技术的研究作出了展望。
关键词：超低温保存；意义；方法；进展；展望1.珍稀植物种质的深低温保存意义我国是一个植物资源较为丰富的国家, 约有高等植物3万多种,占世界第三位,并且特有程度高, 生物区系起源古老, 是世界上屈指可数的植物遗传资源起源中心之一。
但是近年来, 随着人们对自然资源需求的增加与地球气候变化,植物种质资源的多样性急剧下降，物种流失的态势不容乐观。
“全球植物保护策略”讨论了中国植物濒危状况,估计我国受威胁的物种比例达20-25%，甚至更高。
[1]世界自然保护联盟(IUCN) 在《植物红皮书》中指出: 在全世界分布的约25万种维管束植物中,估计约有2万～2.5万种处于很稀少或受严重威胁的状况，这意味着人类赖以生存的植物资源陷入了生存危机。
[2]因此，如何保存现有的植物种质不再受到破坏，保护植物种质资源的多样性已成为全球关注的话题。
植物育种技术的发展,高产品种单一化日益明显, 植物遗传基础越来越窄。
[3]常规的植物种质资源保存以田间种植、室内贮藏等形式为主,需要大量的人力、物力等,使之难以广泛应用。
近年来, 在离体培养技术基础上发展起来的超低温保存技术,以其无菌培养、保存稳定、占用空间少等优点在植物种质资源的长期保存中受到了人们的重视, 得到了广泛的应用。
植物种质超低温保存是指在低于-80℃的低温条件下对植物器官、组织或细胞进行保存[6]，一般以液氮为冷源。
植物材料在这样的低温下，活细胞内的代谢和生长活动几乎完全停止，能够有效保持植物材料的遗传稳定性, 同时又不会丧失细胞活力和形态发生的潜能。
这就有可能极大地延长储存材料的寿命，避免细胞和组织的染色体数目因长期继代而发生的变化和离体材料在长期无性繁殖过程中可能造成的退化和病虫侵害，从而有效、安全地长期保存那些珍贵稀有的种质。
第10章 超低温植物种质保存
第10章超低温植物种质保存——离体植物器官、组织和细胞的超低温冰冻保存技术.种质保存的常见形式:种子保存;种植保存;离体培养保存;超低温冷冻保存。
第1节抑制外植体生长的离体保存方法1 降温2 降氧3 使用生长延缓剂4 其他第2节超低温冰冻保存技术1 原理在液氮(-196o C)的超低温条件下,细胞的整个代谢和生长活动完全停止.在组织和细胞的超低温储存过程中, 不会发生遗传性状的变异,也不会丧失形态发生的潜能.主要仪器设备用于组织和细胞培养的全套设备；普通电冰箱；低温冰箱；程序降温器；液氮罐；装材料用的玻璃或塑料试管；显微镜；分光光度计；……2 材料的准备和预处理2.1材料的选择生理状态；大小；培养阶段；取材季节；……2.2 预培养和预低温处理预培养：培养基中加入一些能使抗寒力提高的物质,可以提高培养细胞的抗冰冻能力.低温预处理：将选好的细胞等材料放在低温下锻炼数天，可能大大提高液氮保存的存活率.2.3 冰冻保护剂预处理1）冰冻保护剂（冷冻保护剂，抗冻剂）常用：甘油、二甲基亚砜(DMSO)、糖类(山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖、葡萄糖等)、脯氨酸等.冷冻保护剂使用的浓度和种类因植物种类不同而异.对许多植物来说,DMSO最佳.DMSO对于培养细胞的适宜浓度是5~8%.2) 保护剂预处理：保护剂配制：可以溶解在培养基里,也可溶解在有糖或无糖的水中使用：为避免对细胞的渗透冲击，加保护剂应慢。
由于DMSO等有毒，冰冻保护剂预处理时必须在0o C下进行，时间一般不超过1h。
许多情况下,几种保护剂混合使用可以减低药剂的毒性,提高细胞的存活率。
可能原因：A、彼此减小甚至消除单一成分的毒害作用;B、使各种成分的保护作用得到综合协调的发展。
3 降温冰冻基本操作3.1 慢冻法在有冰冻保护剂存在的条件下,慢速降温。
通过细胞外结冰,使细胞脱水,直到细胞质的冷冻点.然后转到液氮中.适于不抗寒的植物，及悬浮培养的细胞等。
3.2 快冻法一般是将材料经低温预处理后直接投入液氮.利用超速冷冻使细胞内的水迅速通过冰晶生长的危险温度区。
超低温冷冻保存种质
植物种质的超低温保存
超低温冷冻保存种质
• 是指利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有 的遗传物质保持其完整性，有高的 活力，能通过繁殖将其遗传特性传 递下去。
按保存类型分类
按保存类型分类可分为两种类型
非原生境保存
原生境保存
超低温冷冻保存种质
超低温冷冻保存种质
• FDA、TTC等染色的方法进行快速检测， 只能作为生活力的预测指标
超低温保存技术的发展
1973年科学家首次成功地超低温保存 了 胡萝卜悬浮细胞。
1993年，英国国家种质库采用超低温保存 离体的苹果种质进行再培养成功。
超低温冷冻保存种质
• 悬浮细胞和愈伤组织的保存 • 生长点冷冻保存 • 胚状体（体细胞胚、花粉胚）冷冻保存 • 原生质体冷冻保存
超低温冷冻保存种质
a、快速解冻法 指将液氮中保存的材料直接投入到37—40℃
温水浴中进行解冻的方法。解冻的升温速度 为500—750℃/min。 b、慢速解冻法 将液氮中保存的材料先置于0℃低温下解冻， 再逐渐升至室温下进行解冻的方法。
超低温冷冻保存种质
• 检验化冻后材料的生活力和存活率的最 根本方法是再培养。
费用高，易受到自然灾害的影响
超低温冷冻保存种质
优点：占用空间少，无病虫害以及自然灾害 的影响，不受季节限制。短时间可实现大量 植物的增殖，无病毒。
缺点：连续不断的继代培养可能会引起染色 体和基因型的变异。
种质资源超低温保存是将植
物的细胞或组织经过Байду номын сангаас冻处 理后, 在液氮超低温- 196℃ 下保存的方法。
所使用的冷冻保护剂 应具有以下特性：
◆分子质量较小 ◆易于与溶剂混合 ◆快速渗入细胞 ◆无毒或毒性小 ◆易洗脱
种质离体保存
种质资源保存方法
按材料和方式
就地保存(自然保护区) 迁地保存(种)
常温限制生长保存 中低温调控生长保存 低温干燥保存 减压保存 低温保存(低于-80 ℃) 超低温保存(-196 ℃)
难以长期保持种质寿 命,对种质保存得作 用不就是很大。
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3、分步冰冻法:就是慢冻法和快冻法得结合,先用较慢得速 度(0、5 ～ 4℃/min)降至-30～-40 ℃,停留0、5～1h,然后 直接投入液氮中保存。停留得目得就是诱导细胞外水分 结冰,对细胞进行保护性脱水,避免细胞内产生非均一性 冰晶。
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4、 干冻法:将样品在高浓度(0、5-1、5M)渗透性化合物培养 基上培养数小时至数天,再经过硅胶、无菌空气干燥脱水 数小时(使含水量降至17～40％)或用藻酸盐包埋后投入液 氮保存。该法特别适合于愈伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、 茎尖、生根苗保存,但不适用于脱水敏感得材料。
止次生结冰对组织细胞造成伤害。
35
五、培养及再生
1、 冷冻保存后细胞和器官活力得检测
再培养法
测定存活率
存活细胞(或器官)数目 存活率= 解冻(或器官)数目
×100%
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2、 培养及再生
经冻存得材料,不可避免地受到一些伤害,需要小心维 护: ➢培养:一般将材料培养在黑暗或弱光下培养1-2周,再转入正常光
➢依据渗透性得有无,可将CPA分为两类:
渗透型
非渗透型
&
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渗透型冰冻保护剂
特点:多为中性低分子物质,在溶液中易与水分子结合发生水合作用, 增加溶液得粘稠度,降低溶液得冰点,从而弱化了水结晶得过程,达到 保护材料得目得。 ➢种类:常用得有甘油、二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、乙酰胺、 丙二醇(PG)。 ➢不同渗透型冰冻保护剂渗入细胞得能力及其对水分子活性得影响 也有不同,如甘油适用于慢速冷却,DMSO容易渗入细胞,但有轻微毒 性。
植物材料超低温保存方法
植物材料超低温保存方法摘要：一、引言二、超低温保存方法的原理1.细胞膜的稳定性2.细胞内生物大分子的稳定性3.细胞器的稳定性三、超低温保存方法的步骤1.样本处理2.低温预处理3.快速冷冻4.低温储存四、超低温保存方法的优点1.保存时间长2.保存条件简单3.保存材料活性高五、超低温保存方法的适用范围1.植物组织2.动物组织3.微生物六、注意事项1.低温设备的选用2.冷冻速度的控制3.储存条件的维持七、结论正文：一、引言随着科学技术的不断发展，植物材料超低温保存方法在生物学、农业科学等领域具有重要意义。
这种方法可以长时间保存植物材料，保留其生物活性，为科学研究和农业生产提供了有力保障。
二、超低温保存方法的原理1.细胞膜的稳定性：超低温保存方法可以保持细胞膜的完整性，避免细胞内容物泄漏。
2.细胞内生物大分子的稳定性：低温条件下，生物大分子如DNA、蛋白质等结构稳定，功能完好。
3.细胞器的稳定性：超低温保存方法有利于细胞器的结构和功能保持不变。
三、超低温保存方法的步骤1.样本处理：首先对植物材料进行切片、涂片或粉末处理，以便于后续操作。
2.低温预处理：将处理好的样本放置在4℃条件下，进行低温适应。
3.快速冷冻：将预处理好的样本迅速置于液氮中，快速降低温度。
4.低温储存：将冷冻后的样本放入-196℃的液氮中，长期储存。
四、超低温保存方法的优点1.保存时间长：超低温保存方法可以延长植物材料的保存时间，有利于长期研究。
2.保存条件简单：只需低温设备和液氮，无需复杂设备和技术。
3.保存材料活性高：低温条件下，细胞器和生物大分子保持活性，有利于后续实验研究。
五、超低温保存方法的适用范围1.植物组织：适用于各种植物组织的超低温保存，如叶片、茎尖等。
2.动物组织：适用于动物组织样本的超低温保存，如胚胎、肌肉等。
3.微生物：可用于微生物菌株的超低温保存。
六、注意事项1.低温设备的选用：选择合适的低温设备，确保样本在低温条件下得到有效保存。
植物细胞组织和器官超低温保存
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超低温保存的作用及意义
1. 保持细胞培养物的遗传稳定性； 2. 长期保存植物的种质资源; 3. 长期保存农作物的优良品种及其育种亲本材料的种质； 4. 建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无病毒的原种； 5 . 保存实验材料，防止再培养中遗传变异。
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3. 生长抑制保存
采用生长抑制剂或生长延缓剂延缓培养物的生长，延长保 存时间。
如采用3mg/L的ABA使草莓试管苗在25±1℃的常温下保存 12个月，存活率62.5%；延长5个月保存时间。在6±2℃保存 15个月，存活率100%。
常用生长延缓剂有ABA、多效唑（PP333）、矮壮素（CCC） 和比久(B9)和生长抑制剂三碘苯甲酸（TIBA）、烯效唑（S3307）和青鲜素（MH. 高渗透压保存 提高培养基渗透压可以一直培养材料的生长。如在
培养基中添加渗透化合物，如高浓度蔗糖、甘露醇、 山梨醇等。
蔗糖浓度由3%提高到10%左右，可明显抑制培养 物的生长。
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二、超低温保存
超低温保存是指在-80℃至-196℃甚至更低温度下进行 生物材料的保存。在超低温环境下，植物活细胞的代谢和 生长几乎完全停止，植物处于相对稳定的状态，但能保持 正常的活性和形态发生能力，从而达到长期保存的目的， 在适宜的条件下可迅速繁殖，再生出新的植株，并保持原 来的遗传特性。
冷冻保存是将体外培养物或生物活性材料悬浮 在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻 速率降至零下某一温度（一般是低于-800C的超低 温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。
而复苏是以一定的复温速率将冻存的体外培养 物或生物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生 物、动物细胞、植物细胞还是体外培养的器官都可 以进行冻存，并在适当条件下复苏。
植物种质资源的超低温保存
植物种质资源的超低温保存
陈志林;李开绵
【期刊名称】《南方农业学报》
【年(卷),期】2007(038)003
【摘要】超低温保存是目前植物种质资源长期稳定保存的理想方法.超低温保存成功的关键在于避免降温及化冻过程中的细胞内结冰, 材料特性、冷冻前的预培养、冷冻保护剂、降温冰冻方法和化冻及再培养等因素共同决定了超低温保存的效果.近年来随着科学研究的不断深入,超低温保存取得了一些令人鼓舞的进展,如被成功保存的植物材料日益增多,发现了新型冷冻保护剂抗冻蛋白,玻璃化、包埋玻璃化等新的冰冻保存方法相继建立,生活力测定、恢复培养活力测定以及保存后遗传性状的分析和检测等技术得到了更新与发展.但作为低温生物学中比较新的领域,超低温保存还有许多问题需要进一步研究探讨.
【总页数】7页(P231-237)
【作者】陈志林;李开绵
【作者单位】中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南儋州,571737;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,海南儋州,571737
【正文语种】中文
【中图分类】S5-024
【相关文献】
1.植物种质资源包埋脱水法超低温保存研究进展 [J], 徐海龙;刘华英
2.药用植物种质资源超低温保存及遗传变异特性研究进展 [J], 王晗;雷秀娟;宋娟;尹红新;王英平
3.植物种质资源的超低温保存 [J], 宋友远;黄建建;占志勇
4.植物种质资源的超低温保存 [J], 宋友远;黄建建;占志勇;
5.植物种质资源超低温保存的研究进展 [J], 俞晓凤;曾晓健;封昀;刘霞霞;陈晓恬;刘洁;尹明华
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（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 – 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 • 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
液氮
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。
玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； 植物材料的脱水温度和脱水时间。
繁殖； • 避免自然灾害引起的种质丢失。
二、超低温冰冻保存技术
（一）原理
• 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。
• 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的 长期保存方法。
（二）关键问题及解决措施
• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
（三）基本程序
• 1、材料的选择：
– 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织；
– 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高）
– 大小：适宜
（三）基本程序
• 2、材料的预处理
– 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
（三）基本程序
• 4、化冻操作 • 快速化冻：适用于大多数材料 • 慢速化冻法：适用于含水量较低的材料 • （5、去除冰冻保护剂） • 6、化冻材料的活力检测： • 根本方法：再培养
THE END
第十章 植物种质的超低温保存
种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
技术。应用前景广阔。
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
离体种质保存的优点
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
转移温度
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等）
• 程序降温仪
分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
玻璃化法