第十章 植物种质的超低温保存讲解

致培养物的染色体和基因型的变异；费用较高 • 超低温冷冻保存：在液氮超低温下保存种质的
Fra Baidu bibliotek技术。应用前景广阔。
一、离体保存方法
• 使保存种质处于缓慢生长或无生长状态， 需要时可迅速恢复生长。
• 抑制生长的方式：
– 降低温度 – 降低环境中的氧含量 – 使用生长延缓剂 – 其它方法
离体种质保存的优点
• 占用空间少，节省人力 、物力和土地； • 便于种质资源的交流利用； • 需要时，可以利用离体培养方法很快大量
繁殖； • 避免自然灾害引起的种质丢失。
二、超低温冰冻保存技术
（一）原理
• 原理：液氮中几乎所有的细胞代谢活动、 生长都停止了，因而排除了遗传性状变异 的可能性，达到长期保存植物种质的目的 。
• 在超低温储藏中，植物材料不仅能长期保 持形态发育的潜能，还能保持遗传性状的 稳定，是迄今唯一不需要继代的、可靠的 长期保存方法。
（三）基本程序
• 4、化冻操作 • 快速化冻：适用于大多数材料 • 慢速化冻法：适用于含水量较低的材料 • （5、去除冰冻保护剂） • 6、化冻材料的活力检测： • 根本方法：再培养
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、蔗糖）
（三）基本程序
• 冰冻保护剂0℃预处理 • 如何选择冰冻保护剂：易溶于水；适当浓
度下对细胞无毒害；化冻后容易从组织细 胞中清除。 • 常用的冰冻保护剂：DMSO、甘油、糖、 PEG等。
（三）基本程序
• 3、降温冰冻操作
– 1）直接快速冷冻 – 2）分级冰冻法 – 3）玻璃化法
– 4）干燥冷冻法 – 5）包埋冻存法
第十章 植物种质的超低温保存
种质保存的概念
• 种质保存：利用天然或人工创造的适宜环 境保存种质资源，使个体中所含有的遗传 物质保持其完整性，有高的活力，能通过 繁殖将其遗传特性传递下去。
种质保存的途径
• 种子保存：种子生活力逐渐下降；易受病虫鼠 害侵扰。
• 种植保存：占地多，管理费用高。 • 离体（组织培养）保存：不断继代培养可能导
（二）关键问题及解决措施
• 关键问题：在超低温条件下，冰冻过程中避免细 胞内水分结冰，解冻过程中防止细胞内水分次生 结冰。
• 解决措施：
– 选取细胞内自由水少、抗冻力强的植物材料； – 采取预处理措施，提高植物的抗冻力； – 在冷冻和解冻过程中尽量减少冰晶的形成；
（三）基本程序
• 1、材料的选择：
– 组织、细胞特征：细胞分裂旺盛、体积小、原 生质浓厚的分生细胞或组织；
– 培养时期：旺盛的对数生长期（抗冻力和存活 率高）
– 大小：适宜
（三）基本程序
• 2、材料的预处理
– 处理目的：减少细胞内自由水的含量，使细胞 经受低温锻炼，以提高组织或细胞的抗冻能力 。
– 处理方法：
• 低温锻炼 • 预培养，加入提高材料抗冻能力的物质（如DMSO
转移温度
• 适用对象：不抗寒的植物或含大液泡和大 量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞 等）
• 程序降温仪
分级冰冻法
• 逐级冰冻法：将经保护剂处理的材料在0℃ 预处理后，依次通过不同温度的冰冻，如 -10 ℃、-15 ℃、-23 ℃、-40 ℃等，一般每 级约停留5min，然后学好入液氮。
玻璃化法
快冻法
• 0℃（或其它预处理温度）直接进入液氮。 • 降温速度：每分钟1000 ℃以上。 • 适用对象：
–高度脱水的植物材料，如种子、花粉、球茎、 块根等。
–抗寒性较强或经过低温锻炼的植物，如某些木 本植物的枝条或芽。
分级冷冻法
两步冷冻法
起始温度
0.1-10℃的 降温速度 -70℃~ -40℃
液氮
• 玻璃化：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化 过程。
• 原理：将高浓度的保护剂在超低温环境下凝固 ，形成无规则的玻璃化液，将玻璃化液和材料 一起处理一段时间后投入液氮中，此时冰冻保 护液和材料一起进入玻璃化状态（冰冻过程中 水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生 结构和体积的改变。
玻璃化法
• 优势：设备简单、操作方便、冻存效果好。 • 影响因素： 玻璃化冰冻保护液的组成及浓度； 植物材料的脱水温度和脱水时间。