电子克隆简介
克隆技术简介
克隆技术介绍张勋学号：160820216摘要克隆技术是生命科学技术领域里非常重要的部分，随着新时代的到来，克隆技术在人类生产生活中将发挥更加重要的作用。
人们享受着克隆技术带来的巨大好处，但与此同时，克隆技术对人类的可持续发展也提出了问题和挑战。
本文是通过从实质、方法、应用价值等方面对克隆技术进行一些介绍。
一、克隆技术实质1963 年J.B.S.Haldane在题为“人类种族在未来二万年的生物可能性”的演讲上采用“克隆(Clone)”的术语。
学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫“克隆”，这门生物技术叫“克隆技术”，其本身的含义是无性繁殖，即由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系，该细胞系中每个细胞的基因彼此相同。
早在1938年，德国胚胎学家Speman 最早提出克隆设想。
1962年，英国剑桥大学的Gurdon进行了青蛙胚胎核移植，获得成年蛙。
在经历半个多世纪的研究后，终于在1996年的7月5日，在苏格兰罗斯林研究所中，随着用体细胞克隆出来的小羊多莉的诞生，哺乳动物克隆技术真正的来到我们面前。
克隆技术作为人类在生物科学领域取得的一项重大技术突破，反映了细胞核分化技术、细胞培养和控制技术的进步，它对于扩大良种动物群体，提高畜群的遗传素质和生产能力，拯救濒危动物等的方面而言是迄今为止最为理想手段。
克隆也可以理解为复制，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。
时至今日，“克隆”的含义已不仅仅是“无性繁殖”，凡是来自同一个祖先，无性繁殖出的一群个体，也叫“克隆”。
这种来自同一个祖先的无性繁殖的后代群体也叫“无性繁殖系”，简称无性系。
简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。
但克隆与无性繁殖是不同的。
克隆是指人工操作动物繁殖的过程，无性繁殖是指：不经过两性生殖细胞的结合由母体直接产生新个体的生殖方式。
植物基因的克隆技术是生命科学研究的重要组成部分，是现代生命科学技术中最核心的内容，它是随着20 世纪70 年代初DNA 体外重组技术的发明而发展起来的，其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的位置，阐明其生化功能，并利用生物工程手段应用到生产实践中去。
-绵羊QM基因的电子克隆及其生物信息学分析
-----------------------------------Docin Choose -----------------------------------豆 丁 推 荐↓精 品 文 档The Best Literature----------------------------------The Best Literature作者简介尹珊珊（１９８２－），女，四川眉山人，硕士研究生，研究方向：生物信息学。
收稿日期２００８!０３!１０基因的电子克隆（ｓｉｌｌｃｏｎｃｌｏｎｉｎｇ）即利用计算机来协助克隆基因，是与定位克隆、定位候选克隆策略并列的方法之一。
ＥＳＴ（ＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｃｅｎｃｅＴａｇ）表达序列标签是指从不同组织来源的ｃＤＮＡ文库中随机挑选克隆，对其５＇或３＇端测序后得到的部分ｃＤＮＡ序列，长度一般在３００～５００ｂｐ［１］。
电子克隆采用生物信息学的方法延伸ＥＳＴ序列［２］，以获得基因部分乃至全长的ｃＤＮＡ序列。
ＥＳＴ数据库的迅速扩张，已经并将继续导致识别与克隆新基因策略发生革命性变化。
ＱＭ基因是Ｗｅｉｓｓｍａｎ等首次从人Ｗｉｌｍ’ｓｔｕｍｏｒ相关的细胞系中分离出来的一种基因［３］，是一种与肿瘤抑制，细胞生长、分化、发育和凋亡等有关的重要基因。
ＱＭ同源基因广泛地存在于动物、植物以及真菌界，目前已在小鼠、鸡、果蝇、牛、酵母、玉米和水稻等生物中克隆了ＱＭ同源基因，这些基因的核苷酸及其编码的氨基酸序列高度保守。
在鸡中，ＱＭ同源基因Ｊｉｆ!１可与癌基因ｃ!Ｊｕｎ的蛋白产物结合从而抑制ｃ!Ｊｕｎ的反式激活转录调节活性，影响细胞生长与增殖［４］；在酵母中，ＱＭ同源基因ＧＲＣ５／ＱＳＲ１与线粒体呼吸作用有关，而且ＱＭ基因突变，可导致酵母蛋白质合成下降、生长和分裂阻滞、细胞骨架异常，ＱＭ基因缺失，则导致酵母死亡［５］；在小鼠胚胎发育过程中，ＱＭ参与基因转录和转译后的调节，与组织细胞分化关系密切［６］。
电子克隆的操作方法
电子克隆的操作方法
电子克隆是指复制一个电子设备或电子产品的过程。
一般来说，电子克隆的操作方法包括以下几个步骤：
1. 取得原始电子产品：电子克隆需要一个原始的电子产品，这个产品将作为复制对象。
要么是购买一个现成的产品，要么是自己制造一个原型。
2. 制作电路图：通过分析原始电子产品，制作该电子产品的电路图。
电路图是该产品的蓝图，它告诉你产品中的每个部件的类型、位置和连接。
3. 组装克隆电子产品：根据电路图，组装克隆电子产品。
这个步骤需要一些电子器件，比如电阻、电容、晶体管等等。
也需要一些工具，比如焊接工具、万用表、示波器等等。
4. 测试克隆电子产品：在组装完成后，测试克隆电子产品，确保它工作正常。
可以使用万用表、示波器等电子测试设备来测试克隆产品的电流、电压、频率等等参数。
5. 优化电子产品：如果测试结果不理想，可以对电路图和组件进行优化。
再次测试，直到克隆产品达到预期效果。
需要注意的是，电子克隆有时是非法的，因为它可能涉及到知识产权等法律问题。
在进行电子克隆之前，需要认真考虑和评估相关的法律风险。
绵羊骨骼肌快速肌钙蛋白(TnCf)电子克隆及RT—PCR验证
Ａｂ ｔａ ｔ ｄ ｎ ｉ ｃｔｏ ｆｓ ｅ ｐ ｆｓ ｋ ｌｔｌｍｕ ｃｅ ｔｏ ｏ ｉ （ Ｃｆ）ｇ ｎ ａ ｅ ｎ ｉｓｓｑ ｅ ｃ ｏ ｓ ｒ ａｉｎ ｈ ｓ ｓｒ ｃ ：Ｉｅ ｔ ｉａｉｎｏ ｈ ｅ ａ ｔｓ ｅｅａ ｓ ｌ ｒ ｐ ｎｎ Ｃ Ｔｎ ｆ ｅ ｅ ｂ ｓ ｄ ｏ ｔ ｅ ｕ ｎ ｅｃ ｎ ｅ ｖ ｔ ａ ｏ
２ ．Ｃｏｌｇ ｆＡｎ ｍａ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇ ｌ ｅｏ ｉ ｌ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔｅ ｈ ｏｏ ｙ，Ｎｏ ｔ ｗｅ ｔＡ ＆ Ｆ Ｕｎｖ ｒ ｉ ，Ｓ ａ ｘ，Ｙａ ｇ ｉｇ，７ ２ ０ ｅ Ｓ ｒｈ ｓ ｉｅ ｓｔ ｙ ｈｎｉ ｎｌ ｎ １ １ ０，Ｃｈｎ ） ｉａ
中 图分 类 号 ： ８ ６ ９ ｓ ２ ． ９ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ： ０ ８— ｌ １ ２ １ ） １ ０ １ ４ １ ０ ３ １ （ ０ ０ ０ —０ ０ 一Ｏ
Ｉ ｉ ｃ ｌｎｎ ｆＳ ｅｐ ｔ Ｃ ｎ ｎ ｏ ｆ ｍｅ ｙＲＴ—Ｐ Ｒ ｎＳｌ ｏＣ ｏ ｉｇｏ ｈ ｅ ｎ ｙ Ｇｅ ｅａ ｄＣ ｎ ｉ ｄＢ ｉ ｒ Ｃ
摘 要 ： 统 的 基 因 克 隆 有 两 种 方 法 ： 是 建 立 包 含 Ｉ 基 因 的 ｅ ＮＡ 文 库 ， 据 基 因 的保 守 序 列 设 计 Ｄ 传 一 ｇ的 Ｄ 根 ＮＡ 探 针 ， 用 采 低 严 谨 度 的杂 交 获 得 目的 基 因 ； 者 是 根 据 基 因 的保 守 序 列 设 计 兼 并 引 物 ， 用 Ｐ Ｒ技 术 获 得 目的 基 因 ， 两 种 方 法 再 应 Ｃ 这 在 操 作 上 有 一 定 的 技 术 难 度 。 我 们 应 用 生 物 信 息 技 术 采 用 电 子 克 隆 的 方 法 获 得 绵 羊 骨 骼 肌 快 速 肌 钙 蛋 白 基 因 （ Ｃ） 编码序列 ， 用 Ｒ Ｔｎ ｆ全 并 Ｔ— Ｐ Ｒ进 行 验 证 ， 果 表 明 ： Ｔｎ ｆ 放 阅 读 框 ４ ３个 碱 基 中 。 子 克 隆 与 Ｒ Ｃ 结 在 Ｃ 开 ８ 电 Ｔ— Ｐ Ｒ Ｃ 结 果 有 ４个 碱 基差 异 ， 明 电 子 克 隆 是 基 因 克 隆 可 靠 的 生 物 信 息 学 辅 助 方 法 。 说 关 键 词 ：电 子 克 隆 ；表 达 序 列 标 签 （ Ｓ ） Ｅ Ｔｓ ；绵 羊 骨 骼 肌 快 速 肌 钙 蛋 白（ ｎ ｆ ＴＣ ）
电子克隆
OsG6PDH 的克隆
以小麦G6PDH蛋白（ 以小麦G6PDH蛋白（BAA97662 ）搜索水稻nr数据库结果 G6PDH蛋白 搜索水稻nr nr数据库结果
OsG6PDH 的克隆
上机操作1 利用基因组资料和NR 上机操作1：利用基因组资料和NR数据库 NR数据库
步骤 1：利用小麦G6PDH序列(BAA97662)检索NR数据库 利用小麦G6PDH序列(BAA97662)检索NR G6PDH序列(BAA97662)检索NR数据库
步骤4 去除序列中的数字（可以粘贴进入bioxm中 步骤4：去除序列中的数字（可以粘贴进入bioxm中，再复 制出来) 制出来)
步骤5 将复制的序列输入Softberry 步骤5：将复制的序列输入Softberry ）网站的FGENESH程序进行 （）网站的FGENESH程序进行 基因结构（外显子大小和位置） 基因结构（外显子大小和位置）的预测
步骤3：利用 或者DNAssist程序进行 程序进行EST序列拼接 步骤 ：利用BioXM或者 或者 程序进行 序列拼接
Os6PGDH 的克隆： 的克隆：
步骤3：利用 或者DNAssist程序进行 程序进行EST序列拼接 步骤 ：利用BioXM或者 或者 程序进行 序列拼接
选择部分第2条序列的头部序列搜索第1条序列
种子氨基酸序列 tBLASTn 水稻基因组contig 水稻基因组contig或BAC/PAC contig或 人工 外显子预测 RT-PCR，克隆， RT-PCR，克隆，测序
利用基因组资料
EST拼接 拼接 计算机
利用EST资料 资料 利用
种子核苷酸序列 BLASTn 水稻EST 水稻EST数据库 EST数据库 人工 序列拼接 计算机
上机操作2 利用EST数据: 上机操作2：利用EST数据: Os6PGDH 的克隆 EST数据
电子克隆新基因
有 所有 人 类基 因的 不 间断蛋 白编码
区， 经测 出 既有 序 列 克 隆又 有 物 理 一 克 隆 的 人 类 完整 ｃ ＮＡ， 就 将 提 供 全 Ｄ 面 系 统 分析 蛋 白功 能 并 最 终认 识 人 类
（ ＨＵＧ Ｏ）基 因命 名 委 员 会 批 准 使 用 了标 准 化 的 基 因命 名符 号 。 三 批 共 头 选择 １ ６个 人 类 新 基 因 用 ＲＴ－ ＰＣＲ 实验和 ｃ ＤＮＡ测 序 验 证 ，结 果 证 明 均 与预 测 序 列 一 致 ， 中 半 数 基 因是 具 其 有特 定 重 要 功 能 结 构域 的 基 因， 说 这 明我 们 的 电子 克 隆成 功 率 高 ， 提 供 并 了一 批 潜 在 的 疾 病 相 关基 因 、 胞 因 细 子 基 因和 信 号 传 导基 因等 人 类 小 分 子 肽 类 基 因 ， 具 有 科 学 意 义 和 学 术 价 值 。 于所 建 立 技 术 路 线 的 电 子 克 隆 由 基 因成 功 率 高 ， 可 能编 制成 自动 化 有
意义 。
因克 隆的一条有 效途 径 。 本研究 旨在
采用 电子克 隆法 发现 具 有 自主 知 识产 权 和 重 要 功 能 的人 类 新 基 因并 经实 验 初 步 证 实 ， 采用 生 物 信 息 学 方 法 克 为 隆新 基 因提 供 的 经 验 和 思 路 。
生命活动 本质的分子基础 。
我 们 进 行 的 人 类 新 基 因 电子 克 隆就是以数学算法为手段 ， 以计 算 机 和 互 联 网为 工 具 ， 用 现 有 的表 达序 利 列 标 签 （Ｓ 和 生 物 信 息 数 据 库 ，在 Ｅ Ｔ） 未注 释 的人 类 基 因组 序 列 上 发 掘 未 知 功 能 的 新基 因 ， 通 过 生 物 学 实 验 进 并 行编 码 序 列 和 功 能 验 证 ， 人 类 功 能 为
电子克隆实验报告
实验名称：电子克隆技术及应用实验目的：1. 理解电子克隆技术的原理和方法。
2. 掌握电子克隆实验的操作步骤。
3. 学习如何分析克隆得到的DNA序列。
4. 了解电子克隆技术在基因工程和分子生物学研究中的应用。
实验时间：2023年X月X日实验地点：分子生物学实验室实验材料：1. DNA模板（已知序列或基因组DNA）2. 限制性内切酶3. 连接酶4. 载体DNA5. DNA聚合酶6. DNA标记物7. 琼脂糖凝胶电泳试剂8. DNA测序试剂9. 实验室常用试剂和耗材实验方法：1. DNA提取：从样品中提取DNA，使用酚-氯仿法或试剂盒提取。
2. DNA酶切：使用限制性内切酶对提取的DNA进行酶切，得到具有粘性末端的DNA 片段。
3. 载体DNA酶切：对载体DNA进行相同的酶切处理，以便于后续的连接。
4. DNA连接：将酶切后的DNA片段和载体DNA在适当的条件下进行连接，形成重组DNA分子。
5. 转化：将重组DNA分子转化到宿主细胞中，常用的转化方法包括电穿孔、热冲击法等。
6. 筛选：通过抗生素筛选或其他方法筛选出含有目的基因的转化子。
7. PCR验证：使用PCR技术扩增目的基因，验证克隆是否成功。
8. DNA测序：对克隆得到的DNA进行测序，分析序列的正确性和完整性。
实验步骤：1. DNA提取：取适量样品，按照试剂盒说明书进行DNA提取。
2. DNA酶切：将提取的DNA用限制性内切酶进行酶切，酶切条件根据酶的说明书进行设置。
3. 载体DNA酶切：对载体DNA进行相同的酶切处理。
4. DNA连接：将酶切后的DNA片段和载体DNA在连接缓冲液中混合，加入连接酶，在适当温度下进行连接反应。
5. 转化：将连接好的重组DNA分子转化到宿主细胞中，选择合适的转化方法。
6. 筛选：在含有抗生素的培养基中培养转化子，筛选出含有目的基因的转化子。
7. PCR验证：设计特异性引物，对转化子进行PCR扩增，检测目的基因的存在。
电子克隆及BioLign序列拼接
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电子克隆过程
从GenBank的核酸（nr）数据库中检索已测序 列植物的目的基因，获得目的基因cDNA序列， 以该序列为模板对另一种未测序列植物EST数 据库进行BLAST检索，获得与之部分同源的 EST群，从中选取一条EST作为种子序列 BLAST检索该植物的EST数据库，将检出与种 子序列同源性较高或有部分重叠的EST序列拼 接组装为重叠群（contig），再以此重叠群序 列重复以上BLAST检索过程，反复进行EST重 叠群序列的拼接和比对，直至检出所有的重叠 EST或重叠群不能继续延伸，最终获得未测序 列植物基因的cDNA全序列。
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人SEPHS2基因 基因mRNA序列获取 序列获取 基因
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Blastn
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选取高度同源的EST 选取高度同源的
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UniGene库检索 库检索
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下载UniGene Cluster序列 下载 序列
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序列拼接——BioLign 序列拼接
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EST序列片段 序列片段 Blastn contig
EST
in silico cloning
UniGene Cluster UniGene 实验检验 全长cDNA 全长
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举例说明
以人类磷酸化物合成酶2（selenophosphate synthetase，SEPHS2）基因的EST序列片段 为模板，克隆大鼠磷酸化物合成酶2基因 cDNA全长，来介绍电子克隆的操作方法。
电 克
BioLign„¬•m „¬•m 拼 郝万军
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全长基因的克隆
全长基因的克隆王闵霞 马欣荣 代富英 谭 红(中国科学院成都生物研究所,成都610041)摘 要:新基因全长cDNA序列、全长DNA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。
本文就克隆全长基因的各种技术如文库筛选法、各种PCR技术及新发展起来的电子克隆法等方法作一简单综述。
关键词:全长基因 克隆 文库筛选法 PCR 电子克隆The Cloning of Entire G eneWANG Minxia MA Xinrong DAI Fuying TAN H ong (Chengdu Institute of Biology,Chinese Academy of Sciences,Chengdu610041)Abstract:To obtai n the enti re DN A or cDN A sequence of a new gene is a problem f or researchers.The article described the techniques that are used to clone the enti re gene,f or ex am ple:screeni ng li2 braries,a great variety of PCR techniques and new developed silico cloni ng.K ey w ords:enti re gene,cloni ng,screeni ng libraries,PCR techniques,silico cloni ng 研究一个基因的结构、功能及其表达产物的特性,完整的基因信息是必需的,但是新基因全长cD2 NA序列的获得常常是分子生物学工作者面临的难题。
随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,对基因进行克隆的技术在原有的基础上也有了许多新的发展,例如差别显示杂交、抑制性差减杂交、RAP2PCR、代表性差异显示、酵母双杂交系统、cD2 NA直接捕捉法等。
棉花TRY基因的电子克隆
ｐ ｏｅｎ ｈ ｖ ｏ ｉｎ ｌ ｐ ｐ ｉｅ， ａ ｄ ｏ Ｏ — ｇｙ ｏ ｙａｉｎ ｉ ｒｔｉ ａ ｅ ｎ ｓｇ ａ ｅ ｔ ｄ ｎ ｎ ｌｃ ｓ ｌｔｏ ｓｔ ｎ ｔａ ｓ ｍ ｒｎ ｄ ｍａｎ ，ａ ｄ ｏ ｏｌｄ ｏｌ ｅ， ｏ ｒｎ ｍｅ ｂ ａ ｅ ｏ ｉｓ ｎ ｎ ｃ ｉｅ ｃ ｉ
Ｉ ｉ ｃ ｏ ｉ ｇ ｏ ｉ ｔ ｃ ｏ ｎ Ｃｏ ｔ ｎ ｎ Ｓ ｌ ｏ Ｃｌ ｎ ｎ ｆＴｒｐ ｙ ｈ ｎ ｉ ｔｏ ｉ
Ｚ Ｅ Ｇ Ｐｎ ， Ｈ Ｎ Ｑ ａ — ｉ。 Ａ ｎ—ｗ ｉＺ Ａ Ｇ Ｙｈ—ｎ ， ｕＹ ｎ ｉ Ｈ Ｎ ｅｇ Ｃ Ｅ ｕ ｎ ｊ Ｇ Ｏ Ｗｅ ａ ｅ，Ｈ Ｎ ａ ｉＱ ａ —ｙ ｇ ｎ （ ｅ ａ ｏ ｔ ｙｏ ｇｉ ｌ ｒｌ ｉｅ ｎｌ ｙ ， ｉｉ ｇＡ ｒｕｔ ａ ｎ ｅ ｉ ， ｒｍ ｉ ３０ ２ Ｃ ｉ ＫｙＬｂｒ ｏ ａ ｒ ｆＡ ｒ ｕ ｕ ｏ ｃ ｏ ｇ Ｘｎａ ｇｉ ｌ ｒｌ ｉ ｍｔ Ｕｕ ｑ ０５ ， ｈｎ ｃ ｔａ Ｂ ｔｈ ｏ ｊｎ ｃ ｕ Ｕ ｖ ｙ ８ ａ）
分子生物学名词解释
分子生物学名词解释名词解释：1、分子生物学 (molecular biology)是从分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。
解释：分子一般指生物大分子（核酸和蛋白质），即以生物大分子的结构与功能为研究基础，来研究生命活动的本质与规律。
2、医学分子生物学(medical molecular biology)是分子生物学的一个重要分支，是从分子水平上研究人体和疾病相关生物在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平上开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。
3、载体（vector ）：是能携带靶DNA（目的基因）片段进入宿主细胞进行扩增或表达的DNA分子。
4、克隆载体(cloning vector)：仅适于外源基因在宿主细胞中复制和扩增。
{5、表达载体(expression vector)：能使外源基因在宿主细胞中进行转录和翻译的载体。
6、质粒的复制子：质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。
7、噬菌体(phage)是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。
它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。
8、溶菌生长：λ噬菌体感染细菌后，λDNA通过粘性末端而环化，并在宿主中多次复制，合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌。
9、溶源生长：λDNA整合到宿主染色体基因组DNA中与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。
10、…11、插入型载体(insertion vector):每种酶只有一个酶切位点。
如λgt系列，适用cDNA克隆。
λ噬菌体载体12、置换型载体（replacement vector ）：有两组（成对）反向排列的多克隆位点，其间DNA序列可被外源基因取代。
如EMBL系列，适用基因组克隆12、穿梭载体：是一类既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制表达的载体。
猪SRPK1基因的电子克隆
Ｋ ｙｗ ｏ ｄ ： ￣ Ｋ ： ｉｎ ｒ ａｉ ｓｉ ｎ ｌ ｉ ； Ｆ ｎ ｅ ｅ ｒ ｓ Ｓ Ｐ １ ｂ ｉｏｍ ｔ ；ｉ ｏ ｏ ｎ ＯＲ ｄ ｒ Ｒ ｏｆ ｃ ｌ ｃｎｇ ｃ ｉ ｆ
关键词 ：Ｓ Ｐ ；生物信息 学；电子克隆 ；开放读码框查找 Ｒ Ｋ１
中图 分 类号 ：￥ ２ ８８ 文 献 标 志码 ：Ａ 文 章 编 号 ： １０ — ３９ ２ １） ３ ０ ０ —４ ０ ５ ９ ６ （０ ０ ０ — １ １０
Ｓｉ ｏ ｌｎ ｎ ｆｐｇ ＳＪ户 ｌ ｎ ｃｏ ｉｇ ｏ ｉ Ｒ ｉ ｃ
要 ： 用 小 鼠和 人 的 Ｓ Ｐ 基 因的 编码 区序 列通 过 Ｎ Ｂ 数 据 库 进 行 比 较 和 检 索 ，得 到 一 个 高 同 源性 的猪 Ｒ Ｋ１ ＣＩ
ｃＮ Ｄ Ａ序 列和 ４个 猪 Ｓ Ｐ 基 因的 Ｅ Ｔ 。利 用 Ｄ Ａ Ｎ软 件 将 以上 片段 进 行 拼 接 ，得 到 了一 条 较 长 的 拼 接 片 段 Ｒ Ｋ１ Ｓｓ Ｎ ＭＡ ｘ １ Ｏ Ｆｆ ｄ ｒ Ｂａｔ ｑ ｅ ｃ 程 序 分析 。 结 果表 明 ，Ｘ １中 包含 一 个 完整 的 长 为 ｌ９ ８ｂ 一 。 Ｒ ｎ ｅ 和 ｌｓ ２ｓ ｕｎ ｅ ｉ ｅ 一 ６ ｐ的 编 码 区 ，编 码 ６ ６个 氨 基 酸 ，且 此编 码 区 Ｄ Ａ序 列与 人 的 Ｓ Ｐ 基 因有 ９ ． ％的一 致 性 ，氨 基 酸 序 列 的 一致 性 为 ９ ． ％。 ５ Ｎ Ｒ Ｋ１ １３ ７ ２３ ９
ｌｎ ｅ ｎ （ －）ｂ ＡＭＡＮ ｓ ｆ ｒ． ｃ ｍｐｅｅｏ ｅ ｉｇｆ ｍｅｏ ９ ８ｂ ｎ ｔ ， ｓｆｕ ｄ ｂ Ｆ ｏ ｇ ｒ ｅ Ｘ １ ｙＤＮ ｏ ｏｔ ｅ Ａ ｏ ｌ ｐ ｎｎ ａ ｆ ６ ｐｌ ｇｈ ｗａ ｎ ｙＯＲ ｗａ ｔ ｒ １ ｅ ｏ
生物信息学序列分析利用生物信息学进行功能基因电子隆技术
在对目的基因进行克隆时所采取的策略十分重要， 其途径大致分为： 正向遗传学途径 反向遗传学途径 电子克隆(in silicon cloning)——一种全新的方法。
正向遗传学是指通过生物个体或细胞的基因组的自 发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变， 然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应 的突变基因，并揭示其功能。功能性克隆(functional cloning)、表型克隆(phonetypical cloning)等，如：遗 传病基因的克隆。
2.6 cDNA微阵列或芯片(DNA microarray or chip)技术
近年发展起来的又一新的分子生物学研究技术，其实验 包括6个步骤：将cDNA克隆加工为可供点印的材料；将 cDNA克隆(或寡核苷酸)点印到载体上；样品RNA的分离 (总RNA或mRNA)；探针的制备(例如cDNA的合成和标 记)；标记的探针DNA与载体上的DNA杂交；杂交结果的 成像和图象分析。主要应用于：基因表达水平的检测； 通过比较组织细胞基因的表达谱差异，可以发现新的可 能致病基因或疾病相关基因；可进行基因点突变、多态 性检测及染色体结构研究。其最为主要的优点是：可自 动、高效、同时检测目的材料中大量基因的表达情况； 并几乎可用于所有核酸杂交技术的领域。
然后以该D于植物基因的克隆，由于可供利用的转座子 的种类太少，而转座子在不同的植物中转座的频 率和活性相差很大，并且需要筛选大量的个体来 鉴定转座子突变个体，限制了转座子标签法的应 用范围。
二、电子克隆基因 （In silico cloning）
1. 功能性克隆(functional cloning) 1.1 纯化后克隆 若研究者可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备 了免疫 筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利 用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。
18-硕士研究课-现代分子生物学-电子克隆-胡忠
基于染色体DNA的电子克隆优缺点
缺点和局限:
1. 必须经实验验证 2. 不适用以下种类的基因预测 A. 种间保守性差的基因 B. 外显子数目多而且每个外显子短的基因
3）电子克隆获得的基的完整cDNA序列和该序列所编码的氨基酸顺序。根 据待测生物的偏爱密码子反推合适的碱基顺序，设计引物
Rice root Oryza sativa cDNA clone R2345, mRNA sequence
AU184451
RICR2584A
99AS825
C25822
D004D07
AAAAAA
RICS1291A
ATG
C25822
AU184451
D004D07 99AS825
TAA AAAAAA
RICR2584A RICS1291A
est walking 的优点和局限
优 点：
快速，无须实验操作
局 限：
1. est库不均一；
2. est库测序精度不高（最高为97% ） 3. est库中有不完全剪切产物
CLONE INFO Clone Id: S20127_2Z DNA type: cDNA RIMERS PolyA Tail: Unknown SEQUENCE GATATGCGGCTANTATAGCCAGCATGCCATATGAGGGGCTTTTAGCATTAGAAGAGCAGA TTGGNGATGTAAATACTGGTCTGGCAAAAAGCTACATTGTAGAGAAATTGAAGACTAGCT TATTTGTNCCAGGATCATCCTGCATGTCTAATAAGTCTTCTGAATCTTCCATGGAGAATG ATGCTTGCATAATATGCCAGGAAGAGTATCAGGTTAAAGAATGCATTGGAACCCTTGACT GTGGCCACAGGTACCACGAAGATTGCATAAAACAATGGTTGATGGTAAAGAATTTATGCC CCATCTGCAAGACGACAGCTTTGTCAACCGGAAGAAGAAGTGGATAACGAACAGGAATAA TCTTATTAGTTATTTACTTCCGACAAATATTCAGCTCAATTTTGTATATAAGAAACGGTA GACCATTCTGCTACCTGTATTTGTTGCTCACTTTGTTGTGATCCGGGAGTAACTCAGCTT CCTAAACTGTACAGCCATAACATTGATCATTTTCTTCGGTGTAGAATATTTTAAATTACT CAGTTCGCCCCCATCTGTATCATAAGGCGGACCGACAAAAAAACTCACAATGTCATTTCT AGGCAAACATTGTATCTACCATCAGATTAAAAATCAGAACAGAACATGTGCTCTTCTGTN CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
电子克隆
电子克隆技术及其在植物基因工程中的应用王冬冬朱延明李勇李杰柏锡（东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030）摘要：电子克隆是随着基因组计划和EST 计划的实施而发展起来的, 是利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。
它具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点。
因此, 电子克隆技术必将成为植物基因工程中获得新基因的重要手段。
阐述了电子克隆应用所依据的数据库与生物信息资源, 介绍了利用电子克隆获得功能基因的方法, 及其在植物基因工程中的应用现状与前景。
关键词：电子克隆; 植物基因工程; 表达序列标签EST; 生物信息学电子克隆(in silico cloning)是近年来伴随着基因组计划和EST 计划发展起来的基因克隆新方法。
电子克隆的技术原理是利用日益发展的生物信息学技术, 借助电子计算机的巨大运算能力, 通过EST 或基因组的序列组装和拼接, 利用RT- PCR 的方法快速地获得新基因。
国际上Boguski 等学者在1994 年开始利用电子克隆方法发现新基因, 中国科学院生物物理研究所陈润生研究组在1996 也开始了对电子克隆的研究[1]。
电子克隆技术应用的前提条件要具备拟研物种的丰富核酸序列信息, 其他物种的相关基因的信息, 以及强大的计算机硬件和相关生物信息学分析软件。
基因组和EST 资料的丰富程度决定了电子克隆得以在人类、小鼠等生物中广泛应用。
由于受到序列资料的限制, 植物基因的电子克隆还鲜有报道。
但随着植物基因组计划和功能基因组学的发展, 电子克隆在植物基因工程研究中必将发挥出巨大的功用。
1 电子克隆技术及其依托的生物信息学资源1.1 电子克隆的基本原理利用电子克隆方法获得新基因是生物信息学的研究内容之一。
生物信息学资源是由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。
而电子克隆的应用即是基于这三部分生物信息学资源而展开的。
它是利用计算机技术, 依托现有的网络资源( EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等) , 采用生物信息学方法( 包括同源性检索、聚类、序列拼装等) , 通过EST 或基因组的序列组装和拼接, 利用RT- PCR 快速地获得部分乃至全长cDNA 序列的方法。
EST电子延伸克隆专题讨论总结
EST电子延伸克隆专题讨论总结【EST电子延伸/克隆】专题讨论总结目的：方便后来战友的参考，积累资源。
原因：1。
最近求助较多；2。
是一种较常用的生物信息学手段。
形式：1。
可以为原创总结2。
可以为本版关于EST电子延伸讨论的总结(需要有连接)3。
以上二者结合（推荐）内容：1。
在线/离线的工具，并简单介绍优缺点。
2。
推荐优秀的工具。
3。
可能存在的问题以及解决方法的探讨。
4。
以上3点并不强求全部都有，能就一点深入即可。
5。
也可提供线索。
奖励：1。
积分奖励：根据总结的情况，奖励底线：3分，最高奖励：20分或更高，不设上线（适用于自编软件）。
2。
提供线索视情况加1-2分。
2。
战友的点击、浏览、学习、肯定、收获、回报其实才是最大的奖励衷心感谢参与讨论的诸位战友：starrweb；wxbing；tussah ；yinhp01 ；crickfrancis；hxygz ；sunxjk ；fxd ；楚布衣；ke nmed ；稀糊醋鱼；tonyybn ；yxiangmind；huazii_2003 ；Gmail ；newdragon；xiaoxiao ；ttdcs ；magicwang； tussah ；jef。
你们的参与促成了讨论的成功。
感谢magicwang；yinhp01；crickfrancis的精心总结，你们的工作使得大家的讨论更有意义。
--------imsupergene电子克隆简介新基因搜寻和蛋白质功能分析是人类基因组图谱公诸于世后的研究热点，电子克隆技术以数学为核心，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签（EST）和生物信息数据库，可以加速对人类基因组未知功能新基因的发掘，为人类功能基因组学与蛋白质组学研究提供新的线索和基础。
利用电子克隆并结合实验验证可以纠正或避免现有的人类基因组编码序列错误。
电子克隆定义：依托现有的网络资源等,用同源性检索、聚类、序列拼装等获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。
电子克隆简介
以上各步骤由程序自动完成
如何做拼图游戏
以构建的重叠序列群为信息标签，进一 步检索比对，搜索其高度同源序列
如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没 有新的发现，说明拼接组装得到的EST可能囊括了所以可能的 目的基因序列
根据以上步骤，得到了一个全长为1678 bp的EST序列
常用软件及网络资源简介
EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的 工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也 可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复 制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使 用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻 译、寻找开放读框以及进行阅读校对
常用软件及网络资源简介
优点与缺点的讨论
与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以 下的优点：
rf克隆原理
rf克隆原理RF克隆是一种常见的无线遥控技术，它能够复制现有无线遥控设备的信号，并将其发送给目标设备，以实现对目标设备的远程控制。
在现代无线遥控技术中，RF（Radio Frequency）克隆原理被广泛应用，例如汽车门禁系统、无线报警系统和无线遥控门等。
RF克隆的原理可以简单概括为两个步骤：信号接收和信号发送。
接下来，我将详细解释这两个步骤的工作原理。
首先，我们需要一个RF信号接收器，它可以接收到待克隆设备发出的信号。
这个接收器通常是通过一个射频接收模块实现的，该模块有能力接收目标设备发出的无线信号。
当我们按下待克隆设备的按键时，接收模块会捕获到该设备发出的信号，并将其解码为数字信号。
这个数字信号包含了许多关于按键所对应的操作的信息。
接下来，我们需要一个RF信号发送器，它可以模拟待克隆设备的信号并将其发送给目标设备。
发送器通常通过一个射频发射模块实现，这个模块有能力将数字信号转换为无线信号并将其发送出去。
在RF克隆中，我们需要将之前接收到的信号编码为无线信号，并通过发送器发送出去。
这样，目标设备就会收到和认可这个信号，并执行对应的操作。
需要注意的是，RF克隆并不总是成功的。
一些高级的安全措施可以防止克隆信号的识别和连接。
例如，一些设备使用了固定代码或者滚动代码进行加密，以确保只有合法设备的信号才能够被认可。
在这种情况下，进行RF克隆就会变得困难或者不可能。
总结一下，RF克隆是一种利用无线遥控技术复制现有设备信号的方法。
通过接收目标设备的信号并将其传递给目标设备，我们可以实现对目标设备的远程控制。
尽管RF克隆在某些场景下可能受到一些安全措施的限制，但它依然是一个非常方便和常用的技术。
不过需要强调的是，任何使用RF克隆技术的行为应遵循法律和伦理规范，确保不侵犯他人的权益和使用它进行非法活动。
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普遍适用性较差 电子克隆后需要研究其指导合成的蛋白质的
功能才更有实际意义
现状与展望
国外的科研人员做了许多有益的贡献，特别 是水稻、拟南芥等全基因组测序完成后，借 助软件分析，从中发现和克隆了一系列全新 的基因
我国的研究人员也进行不少的具有建设性和 创造性的探索和尝试，也取得了令人鼓舞的 成果
欧洲分子生物学信息网（European Molecular Biology Net，EMBnet）， /
常用软件及网络资源简介
欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL）， http://www.embl-heidelberg.de/
以上各步骤由程序自动完成
如何做拼图游戏
以构建的重叠序列群为信息标签，进一 步检索比对，搜索其高度同源序列
如果发现了与之高度同源的未知序列，则重复上述步骤；若没 有新的发现，说明拼接组装得到的EST可能囊括了所以可能的 目的基因序列
根据以上步骤，得到了一个全长为1678 bp的EST序列
优点与缺点的讨论
与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以 下的优点：
简便快速，成本低廉，设备简单 对操作人员技术要求不高 成功率高
优点与缺点的讨论
尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然 而在实际操作中依然存在些不足之处：
电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出 来的，现实中可能并不存在
EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征 了成熟mRNA可能的剪接方式
什么是电子克隆
电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、 核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源 性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼 接等方法延长EST序列，直至没有与之同源 的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认 为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的 cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物， 进行RT-PCR克隆出相应基因的方法
常用软件及网络资源简介
美国国家生物信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）， /
美国冷泉港实验室（Cold Spring Habor Laboratory，CSHL），/
如何做拼图游戏
将检索得到的同源序列保存到PC机上，运行 DNAStar软件包，将上述序列输入，由于基 因测序是借助质粒载体完成的，序列中难免 混有载体序列，因此需要运行程序查找载体 序列，对序列进行末段修剪去掉冗余部分
如何做拼图游戏
程序根据外显子和内含子的编码规则和排布 方式搜索和定位开放阅读框，开放阅读框是 电子克隆的重点研究对象；接着，程序对各 段序列的重复序列和差异序列进行逐一检索 和比对，并对重叠区域进行拼接和组装，构 建重叠序列群
如何做拼图游戏
以此EST序列为cDNA序列，对其设计囊括整 个开放阅读框的特异性引物，设计得到的上 游引物为：5’-CTA-GCC-CAC-TAC-CATGGA-TCC-TTG-3’，下游引物为：5’-CAGAAT-TTC-TGT-AGC-CTT-GCT-GAT-3’，
引物的具体合成可交由经营分子生物学相关产业的公司商业化 合成
拼图游戏一样的原理
借助计算机找到具有相同或相似图案的图块， 拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部 的微调。
剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的 开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两 端的引物，RT-PCR扩增侯选基因
应用
电子克隆主要应用于两个方面： 一个是利用EST序列检索同源性序列，并由
如何做拼图游戏
对延伸出的cDNA其作人工的可靠性验证 提取水稻中总RNA，进行RT-PCR，电泳检
测结果 转录调控的研究
常用软件及网络资源简介
DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包， 它以功能全面和强大而著称，它主要包括以 下几个应用程序：EditSeq、GeneMan、 GeneQuest、MapDraw、MegAlign、 PrimerSelect、Protean、和SeqMan II
分析和定位开放阅读框 虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 可靠性检查 分析与之相关的调控序列
如何做拼图游戏
以电子克隆新的水稻过氧化氢酶（catalase， CAT）基因为例，简介延伸cDNA的流程：
以登录号为CA759712的EST在对其在核酸序 列数据库中进行BLAST检索比对时，发现登 录号为CB652681的序列推测为水稻CAT基因 的部分序列，与信息标签 EST具有比较高的 同源性，该EST序列将作为种子序列
电子克隆简介
南京农业大学生命科学学院 沈文飙
什么是电子克隆 拼图游戏一样的原理 应用 如何做拼图游戏 常用软件及网络资源简介 优点与缺点的讨论 现状与展望
什么是电子克隆
Watson & Crick 成功解析了DNA分子 二级结构，开创了分子生物学时代
Karry Mullis 发明了PCR反应，体外大 规模、有目的和快速地克隆目标基因成 为可能
信息科学技术特别是数据库技术在战后 飞速发展
什么是电子克隆
表达序列标签（expressed sequence tags， EST）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部 分序列片段，长度大约为200~600bp
由于基因表达调控作用不同，同一个基因的 mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基 因的全长cDNA可能包含多个EST
传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相 比就如同集约化地捕捞一群鱼
拼图游戏一样的原理
相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物 种中的同源基因序列在一定程度上可以代表 目的基因的序列
可代表程度与两序列的相似度直接相关，加 之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是 可行的 ，但需要作同源性检验以克服主观因 素的影响
GeneQuest可以发现注释DNA序列中的基因， 并提供相关的参数，包括ORF、拼接位点、 转录因子结合位点、重复序列、限制性内切 酶酶切位点等。通过应用“methods”命令， 序列的各项相关信息和参数可以以图形的形 式展示出来。
常用软件及网络资源简介
MapDraw可以制作简单的线性图到有注释的 环形图，在展示限制性酶切位点的同时，还 可以同时展示序列的feature、开放阅读框及 其翻译结果。MapDraw工具主要应用与规划 酶切位点和克隆实验，产生详细和eq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的 工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也 可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复 制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使 用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻 译、寻找开放读框以及进行阅读校对
常用软件及网络资源简介
此拼接cDNA序列以期挖掘新基因 另一方面是在全基因组已经测序的物种中，
研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发 现的基因 目前应用比较广泛的是第一方面
应用
数据库查询 数据库比对 文件下载 序列分析 序列装配 分子模型 结构分析 功能分析
应用
在全基因组已经测序的物种中推测新基因的 步骤如下：
Thank you for your patience!
日本国立遗传研究所（National Institute of Genetics，NIG）， http://www.ddbj.nig.ac.jp/
北京大学生物信息学中心（Peking University Center of Bioinformatics，PKUCBI）， /
什么是电子克隆
传统的克隆方法是利用基因特异性骤繁琐、成 本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得 到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的 cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通 过PCR扩增出表达的那一段基因
常用软件及网络资源简介
MegAlign提供了比对方法，进行DNA和蛋白 质序列的配对和多序列比较。多序列比对可 以在MegAlign的工作界面中进行查看和编辑。 可以根据队列的结果制作进化树，有关序列 距离的数据和残基替代可以作成表格
常用软件及网络资源简介
PrimerSelect能够辅助设计引物和探针。输入 DNA、RNA 或反向翻译的蛋白质模板序列后， PrimerSelect可以在计算序列的各种参数，用 户可以通过控制各种参数限定计算结果。在 模板处理后，PrimerSelect按照用户定义的参 数确定引物的位置，并给引物评分，然后筛 选出模板序列上的最佳引物序列。
现状与展望
随着科学技术的不断发展，以及数据库准确 性的逐渐提高，电子克隆的两大制约因素， 辅助设计软件和数据库将日臻完善，电子克 隆技术将日趋成熟。
电子克隆技术有可能从根本上改变人们对与 基因克隆的看法，改变基因克隆长久以来沿 用的策略，改变科研人员关注焦点，促使研 究人员致力与生物大分子的功能，以更好的 造福于全人类