上海交通大学微生物实验课件实验十病毒血凝和血凝抑制试验
血凝与血凝抑制实验 PPT
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝 素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种 凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝 反应。
病
毒
红
颗细粒胞源自2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入 特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其 血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或 血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制， 称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
5、结果判定
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
血凝效价测定
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即 50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集；
1、概 述
ND是由ND病毒（Newcastle disease Virus, NDV） 引起的高度接触性和高度毁灭性的急性败血性传 染病。
❖1926年首先发生于印尼，同年发现于英国新城 ❖我国1928年有该病记载 ❖是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一 ❖被国际兽疫局（OIE) 列为A类传染病
别名： 新城疫、亚洲鸡温、伪鸡瘟
抗原
抗体
I am late！
四、实验材料
1、血凝板（2人/块） 2、新城疫阳性血清 3、被检血清（1份） 4、1％红细胞悬液 5、稀释液 6、移液器（50ul, 2人/把） 7、枪头
五、实验方法与结果判定
血凝实验和血凝抑制实验报告
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
血凝(HA)和血凝抑制试验(HI) ppt课件
如天花、鼠疫等病毒。
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(2) 不可逆转型
血凝素与病毒颗粒结合得比较紧密，不经过特殊处 理血凝素不能与病毒颗粒分开，这种病毒引起的红 细胞凝集，是不可逆转的。在一定的温度 (37℃) 下，病毒释放出一种能破坏红细胞表面受体糖苷键 的N-乙酰神经氨酸酶，当病毒颗粒从红细胞表面游 离出来后红细胞表面受体已被破坏而失去了再凝集 病毒的能力。
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3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）
3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μLPBS，换滴头。 3.2吸取25μL病毒悬液加入第l孔，混匀。 3.3从第1孔吸取25μL病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μL加入第3 孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取25μL弃之，换滴 头。 3.4每孔再加入25μL PBS。 3.5每孔均加入25μL体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液 充分摇匀后加入） 3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如 果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将 呈明显的钮扣状沉到孔底。
取出上清，进行HI试验；
用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性
病毒血凝与血凝抑制实验报告
病毒血凝与血凝抑制实验报告一、实验目的本次实验旨在研究病毒的血凝现象以及血凝抑制反应，以深入了解病毒的特性和相关的免疫学机制。
通过实验，掌握病毒血凝与血凝抑制实验的操作方法和结果判断，为病毒的检测、诊断以及疫苗研发提供实验依据。
二、实验原理（一）病毒血凝现象某些病毒表面具有能够与红细胞表面受体结合的血凝素，从而使红细胞发生凝集。
这种凝集现象可以在显微镜下观察到，并且凝集的程度与病毒的浓度有关。
（二）血凝抑制反应当特异性抗体与病毒表面的血凝素结合后，会阻断病毒与红细胞的结合，从而抑制血凝现象的发生。
通过检测血清中抗体对血凝的抑制作用，可以判断血清中是否存在特异性抗体以及抗体的效价。
三、实验材料（一）病毒株选用已知血凝特性的病毒株，如流感病毒、新城疫病毒等。
（二）红细胞新鲜采集的鸡、豚鼠或人“O”型红细胞。
（三）血清待检血清和已知阳性、阴性对照血清。
（四）试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水等。
（五）器材96 孔微量血凝板、移液器、离心机、显微镜等。
四、实验步骤（一）红细胞悬液的制备1、采集新鲜血液，加入抗凝剂。
2、离心去除血浆，用生理盐水洗涤红细胞 3 5 次，直至上清液无色。
3、最后用生理盐水将红细胞配制成 1%的悬液备用。
（二）病毒血凝滴度的测定1、在 96 孔微量血凝板中，从第 1 孔至第 12 孔，每孔加入25μL PBS。
2、在第 1 孔中加入25μL 病毒液，然后从第 1 孔吸取25μL 病毒液至第 2 孔，依次倍比稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取25μL 弃去。
3、每孔加入25μL 1%红细胞悬液，轻轻振荡混匀，室温静置 30 60 分钟。
4、观察血凝结果，以出现“＋＋”凝集的最高稀释度作为病毒的血凝滴度。
（三）血凝抑制实验1、取已测定血凝滴度的病毒液，按照 4 个血凝单位/25μL 的量加入 96 孔微量血凝板的第 1 孔至第 10 孔，第 11 孔为病毒对照，第 12 孔为红细胞对照。
实验病毒血凝和血凝抑制试验课件
• 与蛋白质分子类似，核酸 也是两性解离分子。 在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为 8.0~8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带负电荷，向正极移动。
• 用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥 分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率出现较大差异，达到分离的目的 。
(五) 4单位病毒液的配制
以出现红细胞凝集现象的最高稀释度为 1个单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释 度的病毒液,即为4单位病毒液.例如:出现红 细胞凝集现象的最高稀释度是2的9次方(病 毒的血凝效价为2的9次方),那么, 4单位病 毒液就为2的7次方.
(六)病毒的红细胞凝集抑制试验
1、加生理盐水50μl于96孔板的一排的1-12孔。
采集新鲜的抗凝血,以生ຫໍສະໝຸດ 盐水洗3次,每次离心 5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓 度.
(四)红细胞凝集试验
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12孔 。
2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准病 毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比 稀释至第11孔，弃去50μl，12孔为阴性对照。
• 溴化乙锭可以用来检测单链或双链核酸（DNA或RNA） 。但是染料对单链核酸的亲和力相对较小，所以其荧 光产率也相对较低。
• 有一些低毒产品替代：sybr green、sybr gold、gene finder
电泳准备
• 用透明胶封固玻璃板两头，在板一端放置电泳梳子。 • 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g
DNA电泳
• 取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液（甘油， 溴酚蓝，DNA稳定剂）混合后，用微量取样器 慢慢将混合物加至样品孔中。
实验10 病毒血凝和血凝抑制试验PPT21页
实验10 病毒血凝和血凝抑制试验
56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
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(六)病毒的红细胞凝集抑制试验
1、加生理盐水50μl于96孔板的E、F两排的1-12孔。 2、各加标准血清50μl于E、F两排第一孔，倍比稀释到第
某一病毒能够引致血凝，是否可以判定它是何种 病毒？如果不行，应该再要进行什么实验？为什么？
下次实验
血清学试验（凝聚试验和ELISA)p163,171
10孔，弃50μl。 3、E排加50μl4个血凝单位病毒抗原，加至11孔
F排加另一种病毒，同上 4、 然 后 各 孔 加 50μl的 1%鸡 红 细 胞 ， 混 匀 ， 室 温 静 置
30min 。 5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最
高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。
血凝实验是病毒与红细胞的凝集 血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验
4 红细胞的解脱现象
某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨 酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下 来，因此，血凝试验的时间太长，可能会 在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实 验过程中必须控制好时间。
三 、实验操作
(一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集
病
红
毒
细
颗
胞
粒
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入 特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或 其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗 粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被 抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝 抑制反应。
抗原
抗体
I am late！
3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验 鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也 可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制 试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫 效果，或动物是否受到病毒感染
4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的病毒的最高稀释度，为
HA滴度。
6、血凝效价（HA）的确定
将板直立，首先观察红细胞阴性对照， 应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附 于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即 为血凝效价。
结果判定
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱA B C D
进行血凝抑制前抗原要做什么准备？
(五) 4单位病毒液的配制
实验十 病毒血凝和血凝抑制
一、 实验目的
1: 学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本操作 3: 理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用
二 、实验原理
1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹 病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些 动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈 现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是 配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相 应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的
(四)红细胞凝集试验（每2人一块血凝板）
1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12 孔。
2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准 病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍 比稀释至第11孔，弃去50μl，第12孔不加任何病毒 液，为阴性对照。
3、加50μl的1%鸡红细胞于12个孔，按病毒的低浓度 至高浓度加入。
HA和HI结果判定
HA试验
HI试验 判定结果：能将病毒凝集红细胞的作用完全抑制的血清 的最高稀释倍数为该血清的红细胞凝集抑制效价，以2 的指数表示。
比较一下，你自己培养的病毒与 提供的病毒的血凝效价和血凝抑 制效价，分析一下实验中关键点 是哪些？
实验报告
实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 思考题
37℃培养72小时的鸡胚--放置于4 ℃，致死鸡 胚--消毒气室--用镊子打开气室-打开壳膜--用移液 器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管--5000转， 离心5分钟，以去除细胞沉淀--上清液作血凝 和 血 凝抑制试验作用. 观察鸡胚的病变特征 (三)制备1%浓度的鸡红细胞
采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离 心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1% 浓度。