实验四、 苯巴比妥钠和放线菌素D对小鼠肝脏细胞色素P-450含量的
实验四、 苯巴比妥钠和放线菌素D对小鼠肝脏细胞色素P-450含量的影响 Experiment 4. Influence of phenobarbital sodium and actimycin D on the hepatic cytochrome P-450 content in mice
P-450属于血红素蛋白，其还原型与CO结合后，在波长450nm处出现吸收峰。因此，可以应用示差光谱法测定其含量。肝匀浆样品中通以CO后，加还原剂连二亚硫酸钠（Na2S2O4），然后在450nm和490nm处测定吸光度，其差值代入公式，即可计算出细胞色素P450的含量。
【实验目的】
肝匀浆中细胞色素P-450含量的简易测定；肝药酶的诱导剂、抑制剂的作用。
【实验对象】
小鼠（昆明种）
【仪器和药品】
分光光度计，扭力天平，制冰机，生理盐水（N.S.）；7.5g/L（0.75%）苯巴比妥钠（Pheno）；
0.02g/L（0.002%）放线菌素D（A.D.）；0.25M蔗糖溶液；Tris-HCl缓冲液。玻璃匀浆器，漏斗，试管（10 ml）数只，滤纸，移液管（1ml，2ml，5ml，10ml）数只，冰盒等。
【实验方法】
1. 动物分为3组：生理盐水组，苯巴比妥钠组及放线菌素D组。
1.苯巴比妥钠和放线菌素D i.p.三天，诱导或抑制肝药酶。
2.断头放血：于第三天（实验当日）将小鼠断头放血（须放净，因血红素会影响实验结果）；
3.制备肝匀浆：将0.25M的蔗糖溶液和0.05M Tris-HCl缓冲液置于冰块中预冷；剪下肝脏（肝组织不得少于400mg；勿破坏胆囊，因胆色素干扰实验结果；以滤纸吸去血迹，因血色素干扰实验结果）；扭力天平称重（垫锡纸；每次加样或加减法码时必须关上关平）；将肝组织置于匀浆器中，加入预冷后的0.25M蔗糖（0.5ml/100mg肝组织）；冰浴下研磨，直至组织变为淡粉色匀浆；取此匀浆液1ml，加入预冷后的0.05M Tris-HCl缓冲液9ml，充分混匀；冰浴下充以CO，1～2气泡/秒，通气2分钟。
4.通气完毕的溶液，倾入2个比色杯中，一个作为参照杯，另一个作为样品杯。向样品杯中加入连二亚硫酸钠5mg，充分混匀。参照杯调零后，在450nm和490nm处测定样品杯的吸光度，按下式计算P-450的含量：
P-450（nmol/g肝脏）= [（A450 – A490）/ E ? L] × 50000
A=E?C?L
E：P-450从490nm到450nm波长的示差光谱消光系数，本实验中E=104 L /cm ?mmol；
L：比色杯厚度（光路长度）≈1cm。
C：溶液浓度
A：吸光度
A.D. N.S. Pheno
A450 A490 P450 A450 A490 P450 A450 A490 P450
Mean±SD Mean±SD Mean±SD
6．计算
（1）P-450升高百分率：
[（Pheno – N.S.）/ N.S.] × 100%
（2）P-450降低百分率：
[（N.S. – A.D.）/ N.S.] × 100%
【注意事项】
1.操作要快（为了保证酶的活性）；
2.冰浴（为了保证酶的活性）；
3.血要放尽（P-450为血红素蛋白；血红素影响P-450）；
4.胆囊破后，胆红素会影响P-450的测定；
5.通CO的速度不能过快或过慢；
6.研磨，至肝组织由红色变成白色匀浆为止；
7.分光光度计上比色时，先测定A.D，再测定N.S，最后测定Pheno（P－450由低浓度
至高浓度）。
【思考题】
1.肝药酶的临床意义；
2.药物的耐受与交叉耐受, 联合用药应注意的问题。
3．P-450在药物转化中的作用。
4．不同实验组P-450含量不同的原因。
5．诱导剂增加P-450含量、抑制剂减少P-450含量的意义。
（韩国柱 苏成业 王明宇）
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定
摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。 关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE 前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。 在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3] 近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4] 1实验器材 1.1实验动物 昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2主要仪器 5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一） 2实验方法
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验题目】 小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠 【实验原理】 I.线粒体 线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。 线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。 线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。
姓名班级 13级生命基地班学号同组者： 科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理 超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。 活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。 活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到 重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。 活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。 本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒
肝切片的实验报告
肝切片的实验报告 篇一：肝切片实验报告？ 实验九显微摄影――小鼠肝脏结构年级专业 *班 *组学号姓名αβ 500μm 1 m 2 100μm i 100μm 4 50μm 图版说明： 图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（a），静脉血管（b）。图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（c）。图3：示肝小叶（d）。图4：示静脉血管（e）。 图5：示肝细胞（f），肝细胞细胞核（g）。图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（h），上皮细胞细胞核（i），肝血窦（j），中 央静脉（k），肝动脉（l），血细胞（m）。结构说明：肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝 糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组 成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏 正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细 胞围绕中央静脉成放射状排列。肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并
含有 糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。 一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约 25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边 经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 5 50μm篇二：实验报告(一) 实验名称：实验性空气栓塞实验时间：成绩：实验目的：了解空气栓塞对机体的影响实验材料：家兔，20ml注射器及针头，解剖刀，剪，镊子，面盒，浸有二甲苯的棉球若 干 等实验方法（简要说明）： 1. 先观察家兔的一般状况：活动状态、呼吸频率、嘴唇颜色及瞳孔大小等。 2. 用浸有二甲苯的棉球涂擦一侧耳廓，使局部血管扩张，便于穿刺注射。 3. 用注射器经耳缘静脉注入空气10～15ml，记录时间，
最新小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 摘要： 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下： 一、实验器材 1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供） 2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机， CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱
二、实验方法 ●匀浆 是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出来的方法。 小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液， pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4℃, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。 ●盐析 是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。 盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4
原代小鼠肝细胞制备
细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程 实验试剂 培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存） 鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存） 实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）； 液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。 实验方法 实验准备
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定
小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定 摘要： 过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。 过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。 现报告如下： 一、实验器材 1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供） 2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电 热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱 二、实验方法 来 6g；按1： pH4.0）,
是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。 盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。 ●透析 是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。 透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存， 制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。 ●层析 是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。 分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。 取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。 2、过氧化氢酶的性质测定 制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。 标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。
细胞生物学小鼠细胞培养实验报告
广州大学 综合设计性实验报告 学院生命科学学院 课程细胞生物学实验 实验项目细胞培养 实验题目小鼠肝细胞的原代培养 专业生物技术 年级、班别生技142 姓名徐嘉宽 学号 1414300030 任课教师陈鲲
细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养 摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。 关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言 初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理 原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。 细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材 解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。
大鼠肝脏组织病理切片的制作和 HE 染色
大鼠肝脏组织病理切片的制作和HE 染色 步骤如下： （一）固定与修块 取组织块放入Bouin氏液中，组织块的直径应小于7mm。6小时左右后用双面 刀片将组织块修剪成3-5mm3大小。 （二）脱水与透明 1．75%乙醇50分钟 2．85%乙醇50分钟 3．95%乙醇（I）30分钟 4．95%乙醇（II）30分钟 5．100%乙醇（I）30分钟 6．100%乙醇（II）30分钟 7 1/2 二甲苯（乙醇与二甲苯等体积）20分钟 8．二甲苯（I）20分钟 9．二甲苯（II）10分钟（可依据透明效果而定） 若脱水不好，二甲苯溶液颜色会变混浊。在每一步骤之后，要充分滤干组织 块，一般用筒纸吸干组织块上的液体，以免影响其他液体的浓度，但也要防止组织块干燥。全过程约需要5h。 （三）浸蜡、包埋与修蜡块 1．浸蜡：将60℃恒温箱打开，使石蜡充分溶解，待脱水与透明结束后，将 组织块转入石蜡里，放置于60℃恒温箱120分钟。 2．包埋：将60℃的石蜡倒入纸盒内，然后用小镊子将各组织块按一定的顺 序排列好，使切面朝下。不同组别的同一组织包埋于一个蜡块中，以保证切片和染色条件相同。为防止倒入纸盒内的石蜡底部立刻凝固，可将纸盒置于一玻璃板上（或大培养皿内），然后将玻璃板置于80-90℃左右热水上，包埋时蜡盒底部 要放平，做蜡块的蜡要反复冻融较好。 3．修蜡块：待纸盒内蜡凝固后，用刀片将其修成梯形，组织块与蜡块边缘 之间的距离不得小于2mm。 （四）切片 在载玻片上擦少量甘油蛋白。可滴半滴甘油蛋白于载玻片上，用手指充分抹 匀，呈半干状为佳。切片厚约4-8μm，将切片在55℃左右水浴中展开，展开程度以带黄颜色的组织完全摊平为准。用涂有甘油蛋白的载玻片从水浴中捞取切片，放入37℃烘箱中过夜。每个组织块捞片2张。过夜后，将载玻片置于玻片架上，进行下面的实验。 （五）脱蜡、染色与脱水 倾斜玻片架，将玻片架和载玻片下缘的试剂用筒纸吸干，减轻对其他试剂浓 度的影响。全过程约需要60分钟。 1．脱蜡 （1）二甲苯（I）15分钟 （2）二甲苯（II）15分钟 （3）100%乙醇2分钟 （4）95%乙醇（I）1分钟 （5）95%乙醇（II）1分钟 （6）蒸馏水浸洗1分钟
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 陈素君 200900140007 实验目的：了解原代培养的基本方法及操作过程。学习细胞消化、细胞计数、营养液的配制 及酸碱度的调节。初步掌握无菌操作方法。学会分辨死活细胞，掌握细胞计数。 实验原理：细胞培养是用无菌的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体内进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种理化因素对细胞生长发育和分化等的影响，二是细胞培养便于人们对细胞内部结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育过程的观察。因而是探索和显示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，但是不可忽略它脱离了生物机体的一些变化。细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养是指直接从动物体内获得的细胞组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养的条件下，使其不断地生长及繁殖。 要细胞能在体外长期生长，必须满足基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 台盘蓝氧化与还原型颜色不同，活细胞由于新陈代谢产生较强还原力，染色后呈无色，死细胞染色后呈蓝色。细胞计数以显微镜计数法进行，即将少量待测样品悬浊液置于特定的具有确定容积的载玻片上（计菌器），于显微镜下直接观察计数。 细胞浓度（个/ml）=4个中等方格内的细胞总数÷4×10000×稀释倍数。 实验用品： 一、器材 解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、吸管、橡皮头、烧杯、移液枪、注射器、针头、Eppendorf管。上述器具彻底清洗、消毒、烤干、包装好 倒置相差显微镜、酒精灯、酒精棉球、试管架、解剖板 二、试剂 PBS缓冲溶液、培养液、台盘蓝 三、小白鼠 实验方法： 1. 细胞的原代培养 1.1断头法处死小鼠，将血放掉洗净，在酒精中浸泡3min消毒。 1.2在超净工作台无菌操作，将小鼠背朝下放在解剖板上，用镊子提起腹部皮肤，剪开。沿 开口向两侧斜着剪开，翻起皮肤露出腹腔，即可看到白色的胃。提起胃，找到后面条状的脾，用弯头镊子取出脾，将周围的脂肪组织去除。PBS缓冲液清洗1-2次待用。 1.3在无菌培养皿内加入PBS缓冲液30滴，用L型针头吸取PBS0.2mL注入小鼠脾脏，用针 头在脾脏上戳几个小孔，顺脾脏轻轻刮，从小孔挤出分散的细胞。 1.4将培养皿倾斜，使大块组织充分沉淀，吸取分散的细胞悬液2mL，1000r/min离心5min。
过氧化氢酶产生菌的研究
过氧化氢酶产生菌的研究 摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。 关键字：过氧化氢酶发酵调控 过氧化氢酶简介 过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶(Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶(Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多数的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的NADPH 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。过氧化氢酶能及时分解细胞内产生(主要为SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。避免了过氧化氢通过Fenton 和Harber-weiss 反应产生·OH。同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100 多年前，早在1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892 年Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。1901 年Loew 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。到1937 年，Sumner 和Dounce 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一。随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，
小鼠原代肝细胞培养
一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液； 消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)； 消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP； 基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）； 小牛血清（BS，GIBCO公司提供）； 培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养 动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。 或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。
原代细胞培养：原代肝细胞
【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。
细胞生物学实验六 小鼠肝细胞线粒体的超活染色 山东大学实验报告
细胞生物学实验六小鼠肝细胞线粒体的超活染色 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-11 同组者：吕赞孙佳孟何娟 一、实验目的 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、实验原理 线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电 化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性 或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、 甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。 三、实验器材 1.器材： 小白鼠，解剖盘，镊子，剪刀，载玻片，盖玻片，滴管，双凹片，小烧杯，显微镜； 2.试剂： 1/500詹纳绿B染液；Ringer试剂
小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察实验报告
细胞生物学实验报告 题目：小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 姓名：刘恋学号：201000140049 系年级：10级生科2班 一、【实验目的】 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。 二、【实验原理】 1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。 不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。 线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。 活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。
小鼠肝脏取材步骤
小鼠肝脏组织取材步骤 小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。 材料：小鼠 试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛 仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊 培养皿无菌手套 实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组 实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。
小鼠脾脏细胞原代培养
小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景： 一、细胞培养的基本条件： 1.无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 2.细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 3.细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 4.细胞保存条件：液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
3.CO2培养箱： CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： ①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90 ℃，14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制： 1.水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液： ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25％。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基： 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污