实验一 小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案：
（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液
一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用
二、实验原理：
1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧
2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞
匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质）
3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀
4、离心：离心机分离固液
三、实验步骤：
1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g
2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）,
组织捣碎机匀浆3-5min
3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min
4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液
5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE
检测，-20℃冰箱保存。

另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。

（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理
二、实验原理：
1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程
2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出
3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子
的一种分离纯化技术
三、实验步骤：
1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态
下浴搅拌1h；
2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀；
3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助
溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀；
4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检
测，-20℃冰箱保存。

5、将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。

6、将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙
醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一
次透析液；
7、一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集
沉淀；
8、用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器
助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。

（测OD280，若
蛋白浓度小于1mg/ml）
9、留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，
-20℃冰箱保存。

10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用
11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样
品浓缩至400-500ul收样，放置4℃
（三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶
一、实验目的：
二、实验原理：
三、实验步骤：
1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾
斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天
2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。

将层
析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓
冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。

当凝集颗粒沉
积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。

关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。

3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲
液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。

凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的
高度不得出现干胶和断层，应保持凝胶面平衡
4、浓缩样品（前次实验已经操作）
5、加样：打开层析柱口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面齐平时，关上出口。

用吸管吸取待分离的浓缩后的样品溶液400-500ul，在接近凝胶床表面处沿层析柱内
壁缓缓加入。

打开层析柱口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。

待样品液恰好完
全进入凝胶上端内面时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸缓冲液小心冲洗管
壁上的蛋白质，然后再加入磷酸缓冲液至距凝胶柱表面约4cm高。

6、洗脱：洗脱过程中不断加入磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），保持0.3-0.5mL／min
（约5-10滴／min）的流速，洗脱速度不可过快，以防样品带扩散。

7、收集及检测：样品进胶开始，用试管收集流出液，。

收集管依次在407nm和280nm
波长下，以磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）调零，测定各管吸光度值。

以管号为横
坐标吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线
8、收获纯化产物：合并收集OD407nm和OD280nm重叠峰值管，再次测定OD407nm
和OD280nm波长下的吸光度值即为最终得到的纯化产物
9、留样：取2mL纯化产物存样备用于蛋白浓度及Km至测定，放置4℃冰箱保存.
10、留样：取浓缩后的层析纯化样品60ul，用20uL4×电泳上样Buffer制样，备用于
SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存放置。

四、实验结果
（四）SDS-PAGE法测定纯化的过氧化氢酶分子量
一、实验目的：
二、实验原理：
1、电泳：带点粒子在电场中的泳动
条件：带电粒子、电场、介质
影响因素：1）电场强度2）带电粒子情况3)带电粒子形状4）带电粒子分子量
2、SDS-PAGE：上样缓冲液的成分1）溴酚蓝：指示剂2）油：比重剂
3）β-巯基乙醇：破坏蛋白二硫键4）SDS：破坏蛋白氢键和疏水键
3、测分子量：lgMW=A-BRf Rf=过氧化氢酶的迁移率/溴酚蓝的迁移率
三、实验步骤：
1、凝胶的制备（由实验室老师完成，包括装板、配胶、凝胶液的灌注和聚合）
2、蛋白质样品的处理：将样品放在沸水中煮沸5min
3、加样：在垂直板型电泳装置的两个槽内加电极缓冲液，必须使缓冲液高于电极，然
后用微量注射器分别在各个样品槽中加样，匀浆液加15ul，盐析液和透析液加30ul
4、电泳：上槽接负极，下槽接正极，打开直流电源，刚开始电流控制在15-20mA电
泳15min后再升到50mA,保持电流强度不变，待指示剂溴酚蓝迁移至下沿约1-1.5cm
处，停止电泳，需h
5、剥胶和固定：电泳结束后取下凝胶管，用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入
凝胶柱与玻璃管内壁之间，轻轻旋转玻璃管，一面注入蒸馏水，一面推针呈旋转式前进，是凝胶柱与管壁脱离
6、染色：将凝胶浸入染色液（0.1%考马斯亮兰R-250，40%甲醇和10%的冰醋酸）中，
染色0.5h，弃去染色液
7、脱色：加入脱色液（10%甲醇和10%的冰醋酸），脱色1-3h，期间更换2-3次脱色液，
然后将胶浸泡脱色液中过夜，至背景透明清楚后为止
8、测量和数据处理
四、实验结果：如图所示
（五）过氧化氢酶米氏常数的测定
一、实验目的：学会滴定的方法和Km值的测定
二、实验原理：
1、V=Vmax［s］/Km+［s］1/V=Kmax/Vmax［s］+1/Vmax
2、2H2O2 2H 2O +O2(反应学原理)
剩余的用KMnO4滴定：2 KMnO4+5 H2O2+3 H2SO4 2MnSO4 + K2SO4+5O2+8H 2O 在酸性环境下（硫酸）紫红色变为滴定终点的微红色，记录滴定用的ml数，取平均值计算H2O2的准确摩尔浓度。

求出反应前后的浓度差及反应的速度（V），以1/［s］为横坐标，1/V为纵坐标作图可求出酶的H2O2Km值
三、实验步骤：
1、稀释样品匀浆：4ul匀浆+4mlPBS 层析：2ul层析+1mlPBS
2、取6个50ml干燥的锥形瓶，编号后按下表操作
要求：试剂加入准确而迅速，立即摇匀。

加入试剂10min后到时立即加入25% H2SO42.0ml，边加边摇匀，终止酶促反应
3、滴定：用标准的0.002mol/L KMnO4滴定，记录个瓶消耗的KMnO4ml数。