过氧化氢酶产生菌的研究

过氧化氢酶产生菌的研究摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。

关键字：过氧化氢酶发酵调控过氧化氢酶简介过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。

研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。

除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。

根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶(Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶(Pseudocatalase or Mn-catalasee)。

大多数的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。

来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的NADPH 分子。

过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。

过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。

过氧化氢酶能及时分解细胞内产生(主要为SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。

避免了过氧化氢通过Fenton 和Harber-weiss 反应产生·OH。

同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。

人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100 多年前，早在1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892 年Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。

1901 年Loew 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。

到1937 年，Sumner 和Dounce 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一。

随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，结缔组织中含量最低，在上述组织细胞内过氧化氢酶主要与细胞器如线粒体和过氧化物酶体结合的形式存在，而在红细胞中则以可溶的状态存在。

过氧化氢酶来源丰富，存在于几乎所有好氧生物中和一部分厌氧生物中。

动物过氧化氢酶存在于动物的主要组织中，尤以肝与红细胞为最多，脑、心脏与骨骼肌为最少，动物肝脏是过氧化氢酶的一个很大来源，国内外均已实现这一工艺的工业化生产。

另外，巴西研究者开发了从人胎盘中提取医用过氧化氢酶的技术。

植物方面，主要集中在过氧化氢酶保护植物抗氧化机理方面的研究。

不同来源的过氧化氢酶在细胞中的位置有所不同。

动物红细胞、肝脏以及细菌的过氧化氢酶存在于细胞质中，必须将细胞破碎才能提取到过氧化氢酶，因此酶的分离、提纯较为复杂。

细菌过氧化氢酶的热、碱稳定性虽然可随来源不同而不同，但因为是胞内酶，实现高产和提取均不方便。

酵母的过氧化氢酶主要积累于胞内，而一些丝状真菌的过氧化氢酶则主要分泌于胞外，胞内也含有一定量的过氧化氢酶。

因此选用嗜热丝状真菌来生产过氧化氢酶在应用和产品提取方面具有较大优势。

此外也有研究通过构建基因工程菌来生产过氧化氢酶。

目前商业化的过氧化氢酶以动植物提取和微生物发酵生产为主，本文将重点讨论微生物来源的过氧化氢酶的生产。

自20 世纪80 年代以来，织物和纸张的生产者以及其他工业就已经开始使用过氧化氢代替有毒的氯气来漂白和消毒产品。

过氧化氢可用于消除新鲜水果和蔬菜上有害的细菌，如沙门氏菌和大肠杆菌，还可用于消毒奶制品，为食品的纸包装如果汁盒消毒也不必冷藏储存等。

在去除生产过程中剩余的过氧化氢的过程中，人们将注意力转向了具有非常高的催化效率的过氧化氢酶，因此过氧化氢酶在食品、医药、临床等行业都有着广泛的用途。

目前过氧化氢酶主要的应用领域包括：1) 临床。

在临床分析中，过氧化氢酶对研究自由基代谢失衡、抗衰老和肿瘤发病机理具有一定价值，对某些疾病的诊断、鉴别诊断亦具有重要意义[12,14]。

过氧化氢酶可消除过氧化氢，对超氧化物歧化酶起保护作用，因而具有抗衰老作用[15]。

2) 医药。

由于过氧化氢具杀菌、清洁、漂白及消毒的功效，常用于器械消毒。

如在隐形眼镜消毒过程中添加过氧化氢酶可分解消毒液中残留的过氧化氢。

国内、外均有研究的专利发表[16-18]。

3) 食品加工。

过氧化氢酶可使食品保鲜，并作为消除啤酒、饮料中分子氧、活性氧和自由基的抗氧化剂。

此外过氧化氢酶可与葡萄糖氧化酶并用作为氧的去除剂，还可用于牛乳杀菌及干酪原料乳的杀菌[19]。

4) 其他工业。

与过氧化氢同时使用，用于橡胶成型、塑料及多泡性粘合剂。

纸浆、纤维、毛漂白工艺中除残留的过氧化氢。

加入化妆品中可防止皮肤衰老，还可处理半导体废水。

近年来随着过氧化氢在纺织、造纸、制浆等行业的普遍应用，市场对过氧化氢酶的需求也呈大幅增长趋势。

PH对酶活力的影响在25℃的测活体系中,改变不同的pH值,研究pH值对酶催化底物H2O2水解活力的影响将等量的酶液与不同pH值的缓冲液等量混合,室温下放置30min后,然后取出10μL处理的酶液正常的测活体系(25℃,pH7.0)中检测酶的剩余活力,结果表明pH对酶的碱稳定性范围较宽,在pH7~14区域较稳定。

温度对酶活力的影响粗酶在不同温度下(30~100℃)的50mm的磷酸缓冲(PH7.0)热处理10min后,迅速冷却到室温,然后取出10μL处理的酶液在正常的测活体系(25℃,pH7.0）表明酶在85℃以下热处理30min,酶活力基本保持不变,在8 5℃以上酶活力开始下降,随着处理的温度升高,酶活力呈快速下降.实验说明酶在85℃以内都具有较好的热稳定性.高于85 ℃,酶极不稳定。

过氧化氢酶的应用食品工业：半个世纪以前CAT就开始应用于食品工业。

利用 C A T 能分解 H 2 O2 产生 O2 的性质, 可在烘烤食品制造过程中将 C A T 和过氧化氢一起用作疏松剂。

但 C A T 更广泛的应用是对牛奶等的消毒。

在牛奶保存或奶酪制造前用过氧化氢对牛奶或液体鸡蛋制品进行消毒, 然后用 CAT 去除残余的过氧化氢。

这一过程可以在低温下进行, 从而避免高温处理造成的蛋白质变性和某些营养物质的破坏。

环保行业：目前发达国家环保行业的过氧化氢消费量约占过氧化氢总消费量的 10 % ~ 15 %。

用 CAT 取代化学试剂降解工业废水中含有的 H 2 O2 可以避免二次污染, 同时也可以降解芳环化合物和脂族化合物。

其中辣根过氧化氢酶( H RP) 由于价格便宜且失活慢, 已在很多含酚废水处理中得到了应用。

造纸工业：近年来造纸行业相继以H2O2漂白代替传统漂白方法, 并通常用SO2和亚硫酸氢钠去除漂白后的H2O2。

随着世界各国对环境和安全问题的考虑, 促进了去除H2 O2方法的深入研究, 有研究表明, CAT可在10min内将 H2O2降解, 在这个领域具有广阔的用前景。

2004 年美国能源部的爱达荷国家工程和环境实验室的研究者们分离并生产了一种过氧化氢酶产品( 命名为超稳定过氧化氢酶) , 可应用于纺织和造纸行业的漂白过程,该项工作被评为 200 4 年 100 个最显著的技术成果之一。

纺织行业：在印染加工过程中, 传统的去除过氧化氢的工艺有两种, 一为织物经漂白后用大量热水、冷水反复清洗( 至少应洗 3 次) 再进行染色; 二为织物经漂白后用还原剂还原, 再用水清洗一遍后进行染色。

而应用过氧化氢酶可快速去除过氧化氢, 只需要冷洗一遍, 甚至不用水洗, 并可以与染色工艺同浴。

该方法可节约用水及能源、缩短工艺时间、实现安全染色、减少布面磨损,并有利于保护环境。

工业酶催化：在许多氧化酶的催化过程中会生成H2O2的副产物, 而H2O2往往会对底物、产物或酶造成降解, 因此,过氧化氢酶能快速分解H2O2的性质使其在工业酶催化中也有重要的应用。

例如, 在利用乙醇酸氧化酶催化乙醇酸生产乙醛酸的过程中, 由于副产物H2O2容易导致产物乙醛酸的降解和酶的失活, 人们通常采用乙醇酸氧化酶和过氧化氢酶的双酶催化体系, 使催化过程能够顺利进行, 并保持较高的产率。

菌种来源微生物过氧化氢酶的野生菌株生产微生物过氧化氢酶发酵研究最早可追溯到1951年，Brizuela 等首次报道了用杆菌Bacillus 发酵生产过氧化氢酶。

后来，研究者不断筛选出新的过氧化氢酶生产菌株，同时发展出各种优化发酵过程的方法。

由于过氧化氢酶在微生物中普遍存在，生物多样性赋予了微生物多种可能的过氧化氢酶合成、分泌和调控机制，因此通过菌种筛选提高发酵水平是一种十分有效手段。

目前为止，至少筛选出8 种产过氧化氢酶的微生物，如变幻青霉Penicillumvariabile、黑曲Aspergillus niger、酿酒酵母Saccharomyces cereisiae、葡萄球菌Staphylococcus、溶壁微球菌Micrococcus lysodeiktious、嗜热囊菌Thermoascus aurantiacus、枯草芽胞杆菌Bacillussubtilis、放射型根瘤菌Rhizobium radiobacte 等(表1)。

目前最高的过氧化氢酶发酵水平是在枯草杆菌中获得的，最高产量达到18 000 U/mL，生产强度可以达到1 000 U/(mL·h)[21]。

除菌种筛选外，培养条件优化(pH、温度、溶氧等) 和培养基优化等手段也运用到微生物过氧化氢酶的发酵中，过氧化氢酶的发酵水平不断提高赵志军等通过培养基优化，使过氧化氢酶产量从30 U/mL 提高到3 258 U/mL[23]。

邓宇等通过氮源优化，使酶活从3 000 U/mL 提高到11 000 U/mL[22]。

经过50 多年的努力，研究者将过氧化氢酶的发酵水平从78 U/mL提高到18 000 U/(mL·h)，生产强度从0.1 U/(mL·h) 提高到1 000 U/(mL·h)。

但随着菌种筛选工作的不断开展，从自然界直接筛选获得产酶水平大幅提升的微生物的几率越来越小，这就要求研究者通过基因工程手段定向的构建能够高产过氧化氢酶的微生物。

基因工程菌构建为了进一步提高微生物过氧化氢酶的产量，研究者尝试构建基因工程菌来高效生产过氧化氢酶。