课题5DNA的粗提取与鉴定-温州第二高级中学
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【课题】:课题5 DNA的粗提取与鉴定【主备人】:苗贤举
【备课时间】: 3月10日【审核人】:宋利刚
【复习目标】
本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取,了解DNA的物理化学性质,理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。
【复习重点与难点】
复习重点:DNA的粗提取和鉴定方法。
复习难点:DNA的粗提取和鉴定方法。
【知识回顾】一、实验原理
1、提取DNA的方法
提取生物大分子的基本思路是。对于DNA的粗提取而言,就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。
1)DNA的溶解性
思考题1:DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点?对此有什么应用?
思考题2:利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开?
2)DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解,但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80o C的高温,而DNA在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解,但对DNA没有影响。
3)DNA的鉴定
思考题3:依据什么原理来鉴定DNA?
在条件下,DNA遇会被染成色,因此二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。
二、实验设计
1、实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑,但是使用的生物组织,成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料:
鱼卵、猪肝、菜花(花椰菜)、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌
2、破碎细胞,获取含DNA的滤液
1)制备和提取细胞核物质:动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例。
在鸡血细胞液中加入一定量的,同时用搅拌,得到鸡血细胞液。过滤后收集研磨液;
如果实验材料是植物细胞,需要先用溶解细胞膜。例如,提取洋葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的和,进行充分的搅拌和研磨。过滤后收集研磨液。
思考:①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?
②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?
③如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?
④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?
2)溶解细胞核的DNA:
向收集的滤液中加入的溶液,搅拌使DNA呈溶解状态。
3、去除滤液中的杂质
方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。
思考:
①为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?
②方案二与方案三的原理有什么不同?
4、DNA的析出与鉴定
将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积、冷却的,静置,溶液中会出现,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。
取两支20ml的试管,各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的
。混合均匀后,将试管置于中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变。
三、实验案例:以鸡血细胞DNA的提取和鉴定为例:
1.制备鸡血细胞液:在鸡血中加入质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液,离心处理;
2.提取鸡血细胞的细胞核物质:向鸡血细胞液中加入蒸馏水,搅拌、过滤;
思考1:加入蒸馏水的目的是什么?为什么能达到此目的?
3.溶解细胞核内的DNA:加入2mol/L的氯化钠溶液,搅拌,使DNA呈溶解状态;
4.析出含DNA的黏稠物:加入蒸馏水,用玻璃棒搅拌;
思考题2:此时加入蒸馏水的目的是什么?
5.滤取含DNA的黏稠物:过滤;
思考题3:这次过滤与上次过滤的目的一样吗?为什么?
6.将DNA的黏稠物再溶解:加入2mol/L的氯化钠溶液,搅拌,使DNA呈溶解状态;
7.过滤含有DNA的氯化钠溶液:过滤;
思考题4:这一步骤的目的是什么?
思考题5:为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?
8.提取含杂质较少的DNA:加入冷却的95%的酒精,搅拌;
思考题6:这一步骤的目的是什么?
思考题7:为什么加入的酒精需要冷却的?
9.DNA的鉴定:取两支试管,各加入0.015mol/L的氯化钠溶液5mL,一支加入提取的DNA,两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。
四、操作提示
1、以血液为实验材料时,每100ml血液中需要加入3g ,防止。
2、加入洗涤剂后,动作要、,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要,以免,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3、二苯胺试剂要,否则会影响鉴定的效果。
4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系:
当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时,随浓度升高,DNA的溶解度升高。
5.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。
鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的DNA的损失。
[典例解析]本实验中有三次过滤:
⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液
⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得()
A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液
C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNA
D含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
答案:A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液,使血细胞的细胞膜、核膜破裂,释放出核物质,此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液,这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理,方能得到较纯的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低,成丝状粘稠物,可经过滤留在纱布上。
【习题巩固】一、选择题(10个)
1.在研究DNA的基因样本前,采集来的血样需要蛋白水解酶处理,然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是()
A.除去血浆中的蛋白质
B.除去染色体上的蛋白质
C.除去血细胞表面的蛋白质
D.除去血细胞中的所有的蛋白质,使DNA释放,便于进一步提纯
2.与析出DNA粘稠物有关的叙述,不正确的是()
A.操作时缓缓滴加蒸馏水,降低DNA的溶解度
B.在操作A时,用玻璃棒轻缓搅拌,以保证DNA分子完整
C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度,两者均可析出
D.当丝状粘稠物不再增加时,此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L
3.洗涤剂能够瓦解(),但对DNA没有影响。
A.细胞壁
B.细胞膜
C.细胞核
D.细胞质
4.在沸水浴的条件下,DNA遇()会被染成蓝色。
A.斐林试剂
B.苏丹Ⅲ染液
C.双缩脲试剂
D.二苯胺
5.在DNA提取过程中,最好使用塑料试管和烧杯,目的是()
A.不易破碎
B.减少提取过程中DNA的损失
C.增加DNA的含量
D.容易洗刷
6.下列操作中,对DNA的提取量影响最小的是()
A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂,放出DNA等核物质
B.搅拌时,要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌
C.在“析出DNA粘稠物”时,要缓缓加蒸馏水,直至溶液中粘稠物不再增加
D.在用酒精沉淀DNA时,要使用冷酒精,甚至再将混合液放入冰箱中冷却
E在DNA的溶解和再溶解时,要充分搅拌
7.DNA的粗提取中,将与滤液体积相等的、冷却的(),静置2—3min,溶液中会出现白色丝状物。
A.0.9%的NaCl
B.0.14mol/L的NaCl溶液
C.质量分数15%的HCl
D.体积分数为95%的酒精溶液
8.以血液为实验材料时,需要向血液中加入(),防止血液凝固。
A.醋酸钠
B.龙胆紫
C.柠檬酸钠
D.醋酸洋红
9.在向溶解DNA的NaCl溶液中,不断加入蒸馏水的目的是()
A.加快溶解DNA的速度
B.加快溶解杂质的速度
C.减少DNA的溶解度,加快DNA析出
D.减小杂质的溶解度,加快杂质的析出
10.去除滤液中的杂质时,直接在滤液中加入嫩肉粉,利用嫩肉粉中的()分解蛋白质。
A.胃蛋白酶
B.胰蛋白酶
C.木瓜蛋白酶
D.肠肽酶
二、非选择题(3个)
1.提取鸡血中DNA时,要除去血液中的上清液,这是因为什么?
2.填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。
⑴提取鸡血细胞中核物质⑵溶解核内DNA:
⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA