课题5DNA的粗提取与鉴定-温州第二高级中学

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【课题】:课题5 DNA的粗提取与鉴定【主备人】:苗贤举

【备课时间】: 3月10日【审核人】:宋利刚

【复习目标】

本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取,了解DNA的物理化学性质,理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。

【复习重点与难点】

复习重点:DNA的粗提取和鉴定方法。

复习难点:DNA的粗提取和鉴定方法。

【知识回顾】一、实验原理

1、提取DNA的方法

提取生物大分子的基本思路是。对于DNA的粗提取而言,就是要利用、等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。

1)DNA的溶解性

思考题1:DNA在氯化钠溶液中的溶解度有什么特点?对此有什么应用?

思考题2:利用什么原理来将DNA与蛋白质分离开?

2)DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性蛋白酶能水解,但是对没有影响。大多数蛋白质不能忍受60—80o C的高温,而DNA在以上才会变性。洗涤剂能够瓦解,但对DNA没有影响。

3)DNA的鉴定

思考题3:依据什么原理来鉴定DNA?

在条件下,DNA遇会被染成色,因此二苯胺可以作为鉴定DNA 的试剂。

二、实验设计

1、实验材料的选取凡是含有的生物材料都可以考虑,但是使用的生物组织,成功的可能性更大。在下面的生物材料中选取适合的实验材料:

鱼卵、猪肝、菜花(花椰菜)、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基的大肠杆菌

2、破碎细胞,获取含DNA的滤液

1)制备和提取细胞核物质:动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例。

在鸡血细胞液中加入一定量的,同时用搅拌,得到鸡血细胞液。过滤后收集研磨液;

如果实验材料是植物细胞,需要先用溶解细胞膜。例如,提取洋葱的DNA时,在切碎的洋葱中加入一定的和,进行充分的搅拌和研磨。过滤后收集研磨液。

思考:①为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?

②加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?

③如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?

④此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?

2)溶解细胞核的DNA:

向收集的滤液中加入的溶液,搅拌使DNA呈溶解状态。

3、去除滤液中的杂质

方案一的原理是DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质,不分解DNA;方案三的原理是蛋白质和DNA的变性温度不同。

思考:

①为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?

②方案二与方案三的原理有什么不同?

4、DNA的析出与鉴定

将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积、冷却的,静置,溶液中会出现,这就是粗提取的DNA。用玻璃棒搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。

取两支20ml的试管,各加入物质的量浓度为的NaCl溶液5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入4ml的

。混合均匀后,将试管置于中加热5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有DNA的溶液是否变。

三、实验案例:以鸡血细胞DNA的提取和鉴定为例:

1.制备鸡血细胞液:在鸡血中加入质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液,离心处理;

2.提取鸡血细胞的细胞核物质:向鸡血细胞液中加入蒸馏水,搅拌、过滤;

思考1:加入蒸馏水的目的是什么?为什么能达到此目的?

3.溶解细胞核内的DNA:加入2mol/L的氯化钠溶液,搅拌,使DNA呈溶解状态;

4.析出含DNA的黏稠物:加入蒸馏水,用玻璃棒搅拌;

思考题2:此时加入蒸馏水的目的是什么?

5.滤取含DNA的黏稠物:过滤;

思考题3:这次过滤与上次过滤的目的一样吗?为什么?

6.将DNA的黏稠物再溶解:加入2mol/L的氯化钠溶液,搅拌,使DNA呈溶解状态;

7.过滤含有DNA的氯化钠溶液:过滤;

思考题4:这一步骤的目的是什么?

思考题5:为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质?

8.提取含杂质较少的DNA:加入冷却的95%的酒精,搅拌;

思考题6:这一步骤的目的是什么?

思考题7:为什么加入的酒精需要冷却的?

9.DNA的鉴定:取两支试管,各加入0.015mol/L的氯化钠溶液5mL,一支加入提取的DNA,两支各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后置于沸水中加热。

四、操作提示

1、以血液为实验材料时,每100ml血液中需要加入3g ,防止。

2、加入洗涤剂后,动作要、,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要,以免,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。

3、二苯胺试剂要,否则会影响鉴定的效果。

4.DNA的溶解度与NaCl溶液浓度的关系:

当NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时,随浓度的升高,DNA的溶解度降低;当NaCl溶液浓度高于0.14mol/L时,随浓度升高,DNA的溶解度升高。

5.盛放鸡血细胞液的容器,最好是塑料容器。

鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由于细胞内DNA的含量本来就比较少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就会更少。因此,实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管,这样可以减少提取过程的DNA的损失。

[典例解析]本实验中有三次过滤:

⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液

⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液

以上三次过滤分别为了获得()

A含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液

B含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液

C含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNA

D含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液

答案:A解析:用蒸馏水稀释鸡血细胞液,使血细胞的细胞膜、核膜破裂,释放出核物质,此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液,这种滤液必须经过实验中其他步骤得相继处理,方能得到较纯的DNA。DNA在0.13mol/LNaCl溶液中溶解度最低,成丝状粘稠物,可经过滤留在纱布上。

【习题巩固】一、选择题(10个)

1.在研究DNA的基因样本前,采集来的血样需要蛋白水解酶处理,然后用有机溶剂除去蛋白质。用蛋白水解酶处理血样的目的是()

A.除去血浆中的蛋白质

B.除去染色体上的蛋白质

C.除去血细胞表面的蛋白质

D.除去血细胞中的所有的蛋白质,使DNA释放,便于进一步提纯

2.与析出DNA粘稠物有关的叙述,不正确的是()

A.操作时缓缓滴加蒸馏水,降低DNA的溶解度

B.在操作A时,用玻璃棒轻缓搅拌,以保证DNA分子完整

C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度,两者均可析出

D.当丝状粘稠物不再增加时,此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L

3.洗涤剂能够瓦解(),但对DNA没有影响。

A.细胞壁

B.细胞膜

C.细胞核

D.细胞质

4.在沸水浴的条件下,DNA遇()会被染成蓝色。

A.斐林试剂

B.苏丹Ⅲ染液

C.双缩脲试剂

D.二苯胺

5.在DNA提取过程中,最好使用塑料试管和烧杯,目的是()

A.不易破碎

B.减少提取过程中DNA的损失

C.增加DNA的含量

D.容易洗刷

6.下列操作中,对DNA的提取量影响最小的是()

A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂,放出DNA等核物质

B.搅拌时,要使用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌

C.在“析出DNA粘稠物”时,要缓缓加蒸馏水,直至溶液中粘稠物不再增加

D.在用酒精沉淀DNA时,要使用冷酒精,甚至再将混合液放入冰箱中冷却

E在DNA的溶解和再溶解时,要充分搅拌

7.DNA的粗提取中,将与滤液体积相等的、冷却的(),静置2—3min,溶液中会出现白色丝状物。

A.0.9%的NaCl

B.0.14mol/L的NaCl溶液

C.质量分数15%的HCl

D.体积分数为95%的酒精溶液

8.以血液为实验材料时,需要向血液中加入(),防止血液凝固。

A.醋酸钠

B.龙胆紫

C.柠檬酸钠

D.醋酸洋红

9.在向溶解DNA的NaCl溶液中,不断加入蒸馏水的目的是()

A.加快溶解DNA的速度

B.加快溶解杂质的速度

C.减少DNA的溶解度,加快DNA析出

D.减小杂质的溶解度,加快杂质的析出

10.去除滤液中的杂质时,直接在滤液中加入嫩肉粉,利用嫩肉粉中的()分解蛋白质。

A.胃蛋白酶

B.胰蛋白酶

C.木瓜蛋白酶

D.肠肽酶

二、非选择题(3个)

1.提取鸡血中DNA时,要除去血液中的上清液,这是因为什么?

2.填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。

⑴提取鸡血细胞中核物质⑵溶解核内DNA:

⑶析出2mol/LNaCl溶液中的DNA

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