第7章 高效液相色谱

(二 )分离条件选择和常见问题
一、色谱分离效能指标 分离度（resolution）
S S
t 色谱分离的两种情况 如何评价？
t
2）分离度（R） R值越大分离效果越好
在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式 计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定外，应 大于1.5。
R
2(t R2 t R1 ) W1 W2
孔约0.45 m，防止颗 粒物进行泵内。
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
三、 色谱柱
柱长15~30cm，内径4~5mm 基质 (硅胶或高分子聚合物微球)
功能层(固定在基质表面对样品分子
保留起实质作用的有机分子或功能团)
四、 检测系统
用来连续监测经色谱柱分离后的流 出物的组成和含量变化的装置。 溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应
亲和色谱
第二节 HPLC仪器
高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压
输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置
进样系统：进样器，进样阀
分离系统：色谱柱，恒温箱 检测系统：检测器 记录系统：记录装置、色谱工作站
一、 高压输液系统
1、贮液器和吸滤器：
贮液器: 1-2L的玻璃瓶 溶剂吸滤器: Ni合金，
对照
内标 对照+内标
校正因子f =(A内/ C内)/(A对/C对)
样品
内标 样品+内标
C样 = f · 样/(A’内/C’内) A
•外标法：
（1）外标一点法
被测成分与其峰面积成正比关系 要求供试液与对照液浓度相近
对照
C供
Ｃ对
=
A供 A对
样品
C供=
C对×A供 A对
•外标法：
（2）标准曲线法
绘制浓度－峰面积(峰 高)标准曲线； 拟合回归方程并计算 拟合常数；
1、定性分析
色谱鉴定法：保留时间对照
化学鉴定法：利用专属化学反应对分离
后收集的组分定性
色谱-光谱联用定性
非在线色谱光谱联用法： 色谱光谱联用仪
二、HPLC定性定量分析方法
2、定量分析
外标法：外标工作曲线法、外标一点法、
外标二点法等
不需知道校正因子，但需进样量准确 内标法：内标工作曲线法、内标一点法、
二 色谱分离条件选择

1.色谱柱的选择
色谱柱=载体+固定液

固定液的选择原则为：
“相似相溶原理”

柱长,柱内径的要求
色谱柱有两种：一种是内装固定相的，称为填充柱， 通常为用金属（铜或不锈钢）或玻璃制成的内径2-6mm / 长 0.5~10m 的 U形或螺旋形的管子
150 160 387 1385
7
60
2010版药典二部中色谱柱的使用情况
色谱柱类型 品种数 C18柱 C8柱 氰基柱 硅胶柱 苯基柱 1210个 93个 21个 31个 9个
色谱柱类型 氨基柱 丁基柱 三甲基硅烷柱 二羟基丙基硅烷键合 硅胶柱 苯乙烯-二乙烯基柱
品种数 5个 3个 2个
1个
1个
缬沙坦 盐酸帕罗西汀 瑞格列奈 瑞格列奈片 苯磺酸顺阿曲库铵 注射用苯磺酸顺阿曲库铵 甲氨蝶呤 甲氨蝶呤片 注射用甲氨蝶呤
检测器
紫外-可见光
荧光 化学发光 电导 电化学 蒸发光散射 示差折光 质谱 ICP发射光谱 火焰离子化
梯度
可
可 困难 不可 困难 可 不可 可 可 可
主要特点
对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对 溶质的响应变化大。
选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、 pH和溶剂的影响。 灵敏度高；发光试剂受限；受流动相和脉动的影响。 是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响； 不能用于有机溶剂体系。 选择性高；受流动相pH值和杂质的影响；稳定性差。 可检测所有物质。 检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感 主要用于定性和半定量。 选择性高。 可进行多元素同时检测。 柱外峰展宽。
原子吸收光谱 可
五 、 数据处理和计算机控制系统
色谱工作站 在线显示
自动采集
处理储存 自动控制
第三节 HPLC方法及原理
一、液-液分配色谱法（LLPC） 二、化学键合相色谱法（CBPC） 三、液-固吸附色谱法(LSAC)
四、离子交换色谱法（IEC）
五、离子对色谱法（IPC）
六、尺寸排阻色谱法（SEC）
柱长）和选用固定相（粒径及孔径）
流动相 检测器
样品预处理
一、建立HPLC分析方法的一般步骤 3.分析条件的优化
流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量
一、建立HPLC分析方法的一般步骤
4、由获得的色谱图进行定性分析和定 量分析。
二、HPLC定性定量分析方法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
第一节、概述 一、含义
液相色谱 (LC) ：以溶剂液体为流动 相的色谱方法 高效液相色谱（HPLC）：
高效能固体细微粒为固定相
高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器
二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较
1. HPLC与经典LC的比较
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
类型
主要分离机理 主要分析对象或应用领域
吸附色谱
分配色谱 凝胶色谱
吸附能，氢键 异构体分离、族分离，制备
特点及要求：
外标法不使用校正因子，准确性较高，
操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批 量试样的快速分析。
我国药典收载HPLC法项目和数量比较表
数 量 2010版
项目 鉴别 检查
含量 测定
1985 版
1990 版 9 12
1995版 2000版
34 40 117
加入适量极性溶剂（如氯仿、醇等）
分离机理：范德华力、诱导力或氢键力 用途：多用于分离极性或中等极性化合物
正相色谱：极性固定相——非极性流动相（加极性
调节剂如氯仿）——极性柱（正相柱）
反相色谱：非极性键合固定相（ODS）——极性
流动相——非极性柱（反相柱）
流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈 调节极性）
分离机理——疏溶剂作用理论 非极性的烷基键合相
——硅胶表面的十八烷基
“分子毛” ——较强的疏水特性。
Biblioteka Baidu
流动相——极性溶剂
分离物——极性官能团有机物
分子中非极性部分——疏水烷基 ——缔合作用，分子保留 分子极性部分——极性流动相 ——离开固定相，减小保留
两种作用力之差，决定分子在色谱中的保留行为
二、化学键合相色谱法（CBPC） 1、反相键合相色谱法（RPBPC）
七、亲和色谱法（AC）
二、化学键合相色谱法（CBPC） 1、反相键合相色谱法（RPBPC）
固定相：
采用极性较小的键合固定相，如硅胶-C18H37 （ODS，C18）、硅胶-苯基等
流动相：
采用极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛-水、水和 无机盐的缓冲溶液等。
二、化学键合相色谱法（CBPC）
1、反相键合相色谱法（RPBPC）
气相色谱仪流程图

气相色谱仪组成 Ⅰ 载气系统：气源、气体净化器、供气控 制阀门和仪表。 Ⅱ 进样系统：进样器、汽化室。 Ⅲ 分离系统：色谱柱、控温柱箱。 Ⅳ 检测系统：检测器、检测室。 Ⅴ 记录系统：放大器、记录仪、色谱工作站。
气路系统: 要求具有 ：气密性 载气流速的稳定性 流量测量的准确性 常用载气：N2 H2 Ar He 气路系统 ： 单柱气路---恒温分析 双柱气路---程序升温分析 净化器：活性炭、硅胶和分子筛、105催化剂 作用是吸潮、除氧、脱烃。 稳压恒流装置：稳压阀和稳流阀
紫外、荧光、电化学检测器
总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应
示差折光，电导检测器
四、 检测系统
1、紫外检测器
微量吸收池，光程为2-10mm, 体积约为1~10 L
最小检测量10-9g· -1 ml
对流量和温度波动不敏感
接色谱柱 石英窗 UV 光电 倍增管 废液
可用于梯度洗脱。
最常用的通用型检测器
a-酸性糖蛋白柱
手性色谱柱α1酸性蛋白柱 手性色谱柱chiralcel OD-RH
牛血清白蛋白键合硅胶柱
气相色谱法 GAS Chromatography
气相色谱分析
气相色谱法是利用气体作为流动相的 一种色谱法。在此法中，载气 ( 是不与 被测物作用，用来载送试样的惰性气体， 如氢、氮等 ) 载着欲分离的试样通过色 谱柱中的固定相，使试样中各组分分离， 然后分别检测。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
正、反相色谱中极性和保留时间的关系
正相色谱
低极性流动相
反相色谱
高极性流动相
时间 中等极性流动相
时间 中等极性流动相
时间
待测物极性：A>B>C
时间
三、离子交换色谱法（IEC）
原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别 固定相：
基质：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶
第五节 HPLC的建立与应用
一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、根据被分析样品的特性选择适用于
样品分析的一种HPLC分离方式。
材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等
一、建立HPLC分析方法的一般步骤
一、建立HPLC分析方法的一般步骤 2、选择合适的分析方法
适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及
流动相： 作用不是为了控制分离，而是为了溶解样
品或减小流动相粘度。
常用流动相 ——四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水
用途
凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相
主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离 特点：

固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长 相对分子质量差别必须大于10％才能分离
疏水分配作用 各种有机物分离、分析与制备 溶质分子大小 高分子分离，分子量及其分布 的测定 无机离子、有机离子分析
离子交换色谱 库仑力
离子排斥色谱
离子对色谱 手性色谱
Donnan膜平 衡 立体效应
有机酸、氨基酸、醇、醛分析
疏水分配作用 离子性物质分析 手性异构体分离，药物纯化 生化特异亲和 蛋白、酶、抗体分离，生物和 力 医药分析
表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂
流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液 用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离例如
氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。
离子交换剂由基质、电荷基团（或称功能基团）
和 反离子组成。基质一般是不溶性聚合物，如
树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；
纤维素－O — CH2— COO-— Na＋
内标二点法、内标对比法
一、色谱定量公式：
mi = fi′• Ai
mi ：待测物质质量 fi′：待测物质定量校正因子 Ai ：待测物质色谱峰的积分面积
定量分析的依据是被测组分的量与响应信号成正比，但相同含量的物质由于物理、 化学性质的差别，即使在同一检测器上产生的信号也不同，直接用响应信号定量， 必然导致较大误差。故引入校正因子。 校正因子是定量计算公式中的比例常数，其物理意义是单位面积所代表的被测组分 的量。
测定供试品峰面积(峰 高)，带入方程，求出浓 度。
外标法定量
外标法定量示例
浓度 标准1 标准2 标准3 标准4 标准5 峰面积
12 40 80 120 140
7187 12845 21437 27557 31440
样品结果直接在标准工作曲线上读出，非常简单，尤其对大量样品分 析时特别适合。 要求进样量、色谱分析条件严格不变；容易出现较大误差。
含量测定 • 内标加校正因子法：
▲选择适宜的物质作为内标物，以待测组分和内标物的峰高比或 峰面积比求算试样含量的方法称为内标法。内标法的关键是选 择合适的内标物。 ▲校正因子（f ） 其含义为：内标物峰面积与其浓度之比 （As/Cs）是对照品峰面积与其浓度之比（AR/CR）的多少倍。
f=
As/Cs AR/CR
用途
主要用于分离非极性至中等极性的各类有机化合物

改变流动相配比可分离极性化合物 用水和无机盐的缓冲液为流动相可分离易离解的 样品有机酸、有机碱等。
二、化学键合相色谱法（CBPC）
2、正相键合相色谱法（NPBPC）
固定相： 极性的有机基团，CN、NH2。双羟基等
键合在硅胶表面
流动相： 非极性或极性小的溶剂（如正已烷）中
基质 电荷基团
反离子
树脂 －
N+(CH3) —
OH-
溶剂中的离子与反离子进行交换， 是与带电荷相同的进行交换还是带电荷相反的进行交换？
离子交换层析的基本步骤
四、凝胶色谱法（SEC）
原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择
性渗透实现分离。
固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、
亲水凝胶、无机多孔材料。