高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因(含问题分析)

实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因

一、目的要求

1、学习高效液相色谱仪的操作。

2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。

3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。

二、基本原理

咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为：

N N

CH 3

H 3C

O

O N

N

CH 3

定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。

三、仪器和试剂

1、Agilent 1100高效液相色谱仪。

2、色谱柱：Kromasil C18，5µ 150×4.6mm 。

3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。

4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g

咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。

5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。

6、20μL平头微量注射器。

四、实验内容

1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、60、80μg·mL-1的标准系列溶液。

（1mL，2mL，3mL、4mL稀释为50mL）

2、谱仪器条件：

泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：10μL；柱温：室温。

3、仪器基线稳定后，进咖啡因标准样，浓度由低到高。

4、品处理如下：（1）将约25mL可口可乐置于一100mL洁净、干燥的烧杯中，剧烈搅拌30min或用超声波脱气5min，以赶尽可乐中二氧化碳。（2）准确称取0.04g速溶咖啡，用90℃蒸馏水溶解，冷却后待用。（3）准确称取0.04g茶叶，用20mL蒸馏水煮沸10min，冷却后，将上层清液，并按此步骤再重复一次。将上述三种样品分别转移至50mL容量瓶中，并定容至刻度。

5、上述三份样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），弃去前过滤液，取后面的过滤液，备用。

6、别取5mL可乐、咖啡饮料和茶叶水用0.45µm的过滤膜过滤后，注入2mL 样品瓶中备用。

7、“Agilent 1100高效液相色谱仪操作规程”分析饮料试液。

五、结果处理

1.测定每一个标准样的保留时间（进样标记至色谱峰顶尖的时间）。

2.确定未知样中咖啡因的出峰时间。

3.求取样品中咖啡因的浓度。

记得实验结果如下：

将标样的数据利用EXCEL软件绘图，并计算回归方程，如下：

将茶叶、百事可乐、速溶咖啡测试所得的峰面积代入回归方程计算浓度：

六、注意事项

1、不同的可乐、茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌量增减。

2、若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。

3、为获得良好结果，标准和样品的进样量要严格保持一致。

七、思考题

1、用标准曲线法定量的优缺点是什么？

答：标准曲线法的优点是：绘制好标准工作曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，因此特别适合于大量样品的分析。

标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。

2、根据结构式，咖啡因能用离子交换色谱法分析吗？为什么？

答：不行。因为离子交换色谱以离子交换树脂作为固定相，树脂上具有固定离子基团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆变换。平衡常数K值越大，表示组分的离子与离子交换树脂的相互作用越强。由于不同的物质在溶剂中离解后，对离子交换中心具有不同的亲合力，因此具有不同的平衡常数。亲合力大的，在柱中的停留时间长，具有高的保留值。依据咖啡因的结构式1,3,7-三甲基黄嘌呤或3,7-二氢-1,3,7三甲基-1H-嘌呤-2,6-二酮，其解离常数很小，不符合离子交换色谱的要求。

4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？

答：干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体,并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。