噬菌体载体7页word
第五章 噬菌体载体和柯斯载体
2、替换型载体（取代型载体）
（一）插入式载体
• λ噬菌体载体相对于质粒载体来插入失活
•如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及
Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的
失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶源化，产生 清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。
基 因 red 和 gam 位 于 非 必 需 区 域 内 ， 外 源 DNA片段能置换基因red和gam形成重组体， 其重组体不能在recA-的P2溶源菌中繁殖
可以在recA＋ 的P2溶源菌中繁殖并且显示出 Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶源菌 作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。
阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌
体转录。
需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染
色体上删除下来，使之形成环形的DNA分
子，恢复溶源周期开始时的状态。
Hif
整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子(host integration factor，Hif)结合形 成复合体，才能催化 attP和 attB在O区进行重组而形成原噬菌体。
cI
LA 32.7
λgt 10
EcoR I
RA10.6
λgt 10
•
Lac Z基因插入失活：如charon16A，λgt 11载 体，在非必需区段引入lac Z基因，在lac Z基 因上有EcoRⅠ位点，插入失活后利用X-gal法 筛选（兰白筛选）。
lac Z
LA 19.9
EcoR I
RA21.9
如 果 这 个 具 有 supE 基 因 的 EcoRⅠ 片 段 被 外 源
12第五章 噬菌体载体
234页
噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)
基因工程又称重组DNA技术 其实施至少要有四个必要的条件 1. 工具酶 2. 基因 3. 载体 4. 受体细胞
（《基因工程..》静国忠，85页）
(240页)
噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。 噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分 子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编 码外壳蛋白质的基因。
Ⅰ、若干基本概念
234页
噬菌体：细菌病毒。 烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后 引起细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。 温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌 产生溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入 溶原生命周期的噬菌体。 溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。 原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬 菌体DNA。 溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和 噬菌体的细菌。 噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞 裂解而形成的空斑。
第七讲 噬菌体载体与柯斯载体
第七讲噬菌体载体与柯斯载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所2005年8月目录一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体2．噬菌体效价测定与双层平板法3．噬菌体的生命周期4．噬菌体的溶源生命周期5．超感染免疫6．溶源性的诱发7．Campbell模型二、λ噬菌体载体1．λ噬菌体的生物学概述2．λ噬菌体载体的构建(1)λ噬菌体载体构建的基本原理(2)插入型载体(3)替换型载体3．λ噬菌体载体的改良(1)Spi-正选择的λ噬菌体载体(2)具有内删除特性的λ噬菌体载体4．λ重组体DNA分子的体外包装(1)λ重组体DNA的转染作用(2)λ噬菌体的体外包装5．λ噬菌体DNA的包装限制问题(1)包装限制的概念(2)包装限制与λ噬菌体的克隆能力(3)包装限制的生物学意义6．λ重组体分子的选择方法(1)cI基因功能选择法(2)lacZ基因功能选择法(3)Spi-选择法三、柯斯质粒载体1．柯斯质粒的定义及其构建(1) 噬菌体的克隆能力(2)柯斯质粒载体定义(3)柯斯质粒pHC79的构建(4)柯斯质粒克隆能力及其组成2．柯斯质粒载体的特点3．柯斯质粒载体的改良4．柯斯克隆(1)定义(2)理论依据(3)柯斯质粒包装条件(4)柯斯克隆程序(5)柯斯克隆的优点5．柯斯克隆的改良(1)柯斯克隆的局限性及其克服办法(2)Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3)Bates-Swift克隆方案噬菌体载体与柯斯质粒载体一、噬菌体的一般问题1．何谓噬菌体？(1)定义噬菌体英文名为Bacteriophage，简称phage，来源于希腊文“phages”，系指吞食之意，乃是一类细菌病毒的总称需要指出的是，“phage”这个英文单词既是单数又是复数形式。
作单数使用时是指一个噬菌体，如试管中含1个T4 phage；而用作复数使用时，则是指同一种噬菌体的众多颗粒，如试管中含有上百个的T4 phage。
“phages”是噬菌体的复数词，是指多种不同的噬菌体。
第八讲单链菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
λ噬菌体的综述参考word
摘要：噬菌体是一类温和噬菌体，它们感染大肠杆菌后能进行溶菌性生长(Lytic growth)和溶源性生长(Lysogenic growth)。
其溶源特性对基因重组与遗传工程研究有很大帮助。
本文就λ噬菌体的基因组结构、溶源化状态的建立和基因工程应用做简要的综述，分析存在的问题，并对研究方向进行了展望。
关键词：λ噬菌体溶原性溶菌性基因克隆引言：大肠杆菌噬菌体λ为长尾噬菌体科，是一类中等大小的大肠杆菌病毒，其基因组为双链线状DNA，由48502对碱基组成，分子量3.2×107 ，约50个基因，特点是相关基因成簇排列，形成若干个操纵子。
基因组两端为粘性末端，中间有相当长的DNA片段是裂解生长非必需的，这就为其作为外源基因的克隆载体提供了方便。
λ噬菌体由头和尾构成，其基因组组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。
感染时吸附位点为细胞壁。
属温和性感染；感染的DNA环化并整合于宿主基因组中。
以θ环双向复制，然后通过滚环机制单向复制。
用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
1、The discovery of bacteriophage lambda1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg第一个证明了 J. Lederberg和Tatum用来杂交的K-12中有原噬菌体，并命名为λ，经10年的研究搞清了溶原化的实质。
从此之后，λ噬菌体被广泛用于模式物种；1962年Esther Lederberg的同事并且还是她最好的朋友Allan Campbell首次发现了λDNA整合到细菌DN A的机制；之后由λ噬菌体改造后的载体广泛的用于基因工程。
2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、结构特点：λ为大肠杆菌温和性噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp），因分子两端各有一含12个核苷酸的黏性末端，故又可黏合成环状分子。
λ噬菌体载体大学生物学
重
性
组
λ噬菌体的裂解生长状态
裂解周期
λ噬菌体的溶原状态
野生型λ噬菌体的缺陷
野生型的λ噬菌体的基因组大而且复杂，不适于直接作 为基因克隆的载体。
lλ噬菌体基因组中含有基因克隆常用的限制性核酸内 切酶的多个识别位点
l由于λ噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子，要想 获得具有感染力的噬菌体颗粒，其DNA长度应控制在λDNA的75% ～105%的范围内，即野生型λ-DNA可装载的外 源DNA片段不大于2.5kb
l重组λ-DNA分子的筛选 较为方便，提取简便
谢谢
可以编码至少30个基因
黏性 末端
头 部 蛋 白
尾 部 蛋 白
整 合 、 重 组
调 控A 免合 疫成 性
DN 晚 期
调裂 控解
裂解生长非必要区
黏性 末端
λ噬菌体的结构示意图 在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈现线性，其两端的 5′末端各带有12个碱基的互补单链（黏性末端）。
GGGCGGCGACCT
12bp的cos位点
λ噬菌体载体的主要类型
l取代型载体具有成对的克隆位点，在这两个位点 之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所置 换。
λ噬菌体载体的主要类型
以λEMBL3和 λEMBL4为代表。
EMBL3载体 左臂（20kb）
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EMBL4载体 左臂（20kb）
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
λ噬菌体载体的优点
lλ-噬菌体载体在体外包装成噬菌体颗粒后，可以高 效转染大肠杆菌，感染宿主细胞的效率几乎可达 100%，而质粒DNA的转化率只有千分之一
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
噬菌体载体
第三章噬菌体载体一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。
2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。
3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。
它有一个复制起点，进行—-------—向复制。
λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。
5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。
8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。
9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—，(3)———————————。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。
λ噬菌体载体
λ噬菌体载体λ噬菌体，一种大肠杆菌双链RNA噬菌体。
是一种中等大小的温和噬菌体。
迄今已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。
一．λ噬菌体的分子生物学概述（1）λ噬菌体基因组的结构在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端，各有一条由12个核劳酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列，即通常所说的粘性末端。
注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成环形双链DNA分子。
随后在DNA连接酶的作用下，将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来，并进一步超盘旋化。
这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos 位点（略语cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）（如图）。
在环化的状态下，λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。
（2）λ噬菌体DNA的复制在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制。
到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的人基因组oxA组成的长多连体分子。
（3）λ噬菌体DNA的整合与删除λ噬菌体基因组的整合作用，是通过它的附着位点att，同大肠杆菌染色体DNA的局部同源位点之间的重组反应实现的。
整合作用需要int基因的表达，它是一种可逆的过程。
的复制子，这种过程叫做原噬菌体的删除作用。
λ噬菌体的删除，需要噬菌体xis基因和bio基因的协同作用才能实现。
（4）λ噬菌体DNA的转录与转译在溶菌周期，λ噬菌体DN A的转录是在三个时期，即早期、中期和晚期发生的。
大体的情况是，早期基因转录确立起溶菌周期；中期基因转录的结果导致DNA进行复制和重组；晚期基因的转录最终使DNA被包装为成熟的噬菌体颗粒。
噬菌体载体
(刘志国，102-105页）
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 常用作基因工程的噬菌体： ◆双链噬菌体：λ噬菌体。 * 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多 种克隆载体。 *目前常用的有： EMBL系列、 λgt系列、 Charon系列。 ◆单链噬菌体：M13噬菌体。
2. 噬菌体的感染性
噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合
入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两
种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它
们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
(244页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。 基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)
(英含遗工词)
(241页)
2. 噬菌体的感染性
将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。 由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。 此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。
基因工程载体噬菌体载体
• ◆ λ噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用 于各类基因库的构建。
第27页/共90页
重组噬菌体的分子量必须在野生型噬 菌体 分子量大小的75%至105%之间。
筛选标记： 蓝白斑(LacZ)、噬菌斑等。
用途： a.用作一般的克隆载体。 b.用于构建基因组或cDNA。 c.用于抗体库或随机肽库的构建。
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd。 优越性： 1. 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为
媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多
制约的，不存在包装限制 问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。
第36页/共90页
第37页/共90页M13噬菌 Nhomakorabea的特点•感染Ecoli后，在宿主细胞内会形成双链的复制型
ＤＮＡ（ replication form DNA, RF DNA）。可以 象质粒ＤＮＡ那样在体外进行纯化和操作。
•成熟的噬菌体颗粒仅能感染E.coli的F+细胞，这是
因为这种噬菌体的感染位点在性散毛上。但是无论
溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然 后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装， 最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。
溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主 细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细
菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA
第一章1-5噬菌体载体
4个操纵子：
• 阻遏蛋白操纵子：cI • 左右两个早期操纵子：复制酶、重组基因、 调节基因（cro、N、cⅡ、cⅢ和Q） • 晚期操纵子：裂解基因、头部和尾部蛋白 基因 • L链：左向转录链 • R链：右向转录链
16
cI，cro、N、cⅡ、cⅢ和Q，头尾和裂解基因 在基因组中的位置
• Figure. The genetic map of the λ phage. The positions of nonlethal and conditionally lethal mutations are indicated, and the characteristic clusters of genes with related functions are shown.
假单胞菌
一、λ噬菌体
7
（一）λ噬菌体
1、λ噬菌体特征： • λ噬菌体由头和尾构成。 • 基因组是长约50kb的线性双链DNA分子， 末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端) 。 • DNA组装在头部蛋白质外壳内部，其序列 已全部测出。 • λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA 注入E coli，而将其蛋白质外壳留在菌外。
第一章
分子克隆的工具酶和载体
• 第八节 噬菌体载体
1
噬菌体载体
• 噬菌体（phage）：是感染细菌的一类病 毒。有的噬菌体基因组较大，λ噬菌体 和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、 fd噬菌体等。 • 用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的复 杂的多用途载体应用最为广泛。 • 要有效地利用这些载体，须熟知λ噬菌 体的分子生物学。为了适当地选用这些 载体，还应该了解设计和组建这些载体 时所考虑的原则。
17
（1）λ噬菌体的调节基因： • λ噬菌体的溶原生长和裂解生长发育过 程是在6个调节基因的控制下进行的； 如cI、cro、N、Q、cⅡ/cⅢ • cI：溶原性阻遏蛋白，能抑制除自身 外所有基因的转录。 • cro和N：是两个前早期基因，
第五章、噬菌体和粘粒载体
第一节 噬菌体的一般生物学特性 第二节 λ噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体 第四节 单链噬菌体载体 第五节 噬菌粒载体
第一节 噬菌体的一般生物学特性
5.1.1.1 结构及核酸
噬菌体颗粒基本类型:无尾二十面体型、 具尾二十面体型和线状体型。
噬菌体的核酸，最常见的是双链线性 DNA。除此之外，还发现有双链环形 DNA、 单 链 环 形 DNA、 单 链 线 性 DNA以及单链RNA等多种形式。
这类载体有插入型的，如凯伦2；也有替换型的，如凯伦30。
许多Charon噬菌体载体，都带有编码着从半乳糖苦酶基因以及它的操纵 基因和启动子的laeＺ取代区段。
用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：
第一，核酸内切酶消化载体， 除去可取代的DNA区段。
第二，λ DNA臂同外源 DNA 片段连接。
第三，重组体的 DNA分子进 行包装和增殖，得到有感染性 的λ重组噬菌体。
返回第五章
5.1.2.1 溶源周期的主要特征
返回第五章
已知存在两种不同类型的溶源周期，其中最普遍的一种是以λ噬菌体 为原型，具有如下特性：
①噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。
②短暂的转录期之后，合成一种整合酶，之后转录活性便被一种阻 遏物所关闭。
③噬菌体DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。
能否发展出一种可将插入的DNA片段直接从λ载体转移到质粒载体的快 速简便的体内系统呢？
λZAP本质上是插入型载体。基因组中含有 一个可以在体内发生删除作用的pBluescript 噬菌粒（见本章第五节）的DNA片段，两 侧是由两个单链DNA噬菌体fi的复制信号。
pBluescript SK (+/-)
噬菌体载体
噬菌体载体第三章噬菌体载体一、填空1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是―-----------―；二是----------――。
2.首次报道的完整测序的单链DNA噬菌体是фX174，含有5386个碱基对的DNA和一个基因，是一个环状DNA分子。
基因组的最大特征是----------------。
3．λ噬菌体的基因组dna为―――――――kb，有――多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按―-----―复制，成熟包装(晚期复制)则是按―--------―复制。
它有一个复制起点，进行―-------―向复制。
λ噬菌体的dna既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性dna分子的两端各有一个――个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做――――――位点。
4.根据噬菌体的包装能力，将噬菌体基因组DNA转化为野生型λ插入载体。
该载体的最小分子量约为――KB，插入的最大外源片段不超过――KB。
5．野生型的m13不适合用作基因工程载体，主要原因是――――和--------------―。
6.Cosmid是一种质粒噬菌体杂合载体。
它的复制子来自---，cos位点序列来自---，最大的克隆片段达到----KB。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为――个，取代型为――个。
8.野生型λ噬菌体DNA不应被用作基因工程载体，原因如下：（1）-----（2）-----（3）------。
9．m13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)――――――――(2)―-------------―，(3)―――――――――――。
10.噬菌体颗粒由质粒和噬菌体DNA组成，其中质粒的主要结构是---------，而噬菌体的主要结构是---------。
11．m13单链噬菌体基因2和基因4之间的ig区有三个最重要的功能，即(1)―――――(2)―------------―(3)―-------------―。
入噬菌体及质粒载体
• ③质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因
功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。
质粒载体的种类
• 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为 载体。人工构建的质粒可以集多种有用的 特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗 生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素 基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含 有27种限制性内切酶的单一识别位点。
λ- 噬菌体及质粒载体
——郭苋 2014212346
噬菌体的一般生物学特性
• 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能 生长也不能复制。
• 基本功能： • 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化
学物质的破坏 • 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 • 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。
• 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以
得到广泛应用。
• 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左
酶形成融合蛋白质的克隆载体。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
第四节-单链丝状噬菌体载体
第四节单链丝状噬菌体载体一、M13 噬菌体的生物学1．M13 噬菌体的组成和结构M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。
感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。
M13 噬菌体的基因组为单链 DNA ，由 6407 的碱基组成（GenBank 注册号为V00604）。
基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。
较大的间隔位于基因Ⅷ 和基因Ⅲ 以及基因Ⅱ 和基因Ⅳ 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。
M13 噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因Ⅱ，Ⅴ 和Ⅹ），形态发生蛋白（基因Ⅰ，Ⅳ 和Ⅺ），结构蛋白（基因Ⅲ 、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ 和Ⅸ）。
所有结构蛋白在形态发生之前都插入在宿主细胞的质膜中。
基因组 DNA 为正链，按基因Ⅱ 至基因Ⅳ 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。
图 3-20 是 M13 噬菌体的遗传图谱。
M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。
噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因Ⅷ 编码的结构蛋白呈管状排列而成（图 5-32），成熟的基因Ⅷ 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的α 螺旋蛋白。
顶端由 5 个基因Ⅶ 和 5 个基因Ⅸ 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。
5 个基因Ⅲ 蛋白和5 个基因Ⅵ 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。
图 3-21 是 M13 噬菌体结构模型。
2．M13 噬菌体的增殖吸附是噬菌体感染的第一步， M13 噬菌体只感染具有性纤毛的菌株，携带 F 质粒的菌株可产生性纤毛。
在吸附过程中，噬菌体的基因Ⅲ 蛋白与性纤毛发生作用。
随后丝状噬菌体穿入到性纤毛，基因Ⅲ 蛋白与宿主的 TolQ 、TolR 和 TolA 蛋白发生作用，去除外壳蛋白，致使病毒 DNA 及附着于其上的基因Ⅲ 蛋白进入宿主菌体内。
在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA），即 RF DNA 。
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第三章噬菌体载体
一、填空题
1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。
2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。
3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。
它有一个复制起点，进行—-------—向复制。
λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。
5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、C OS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。
8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。
9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—，
(3)———————————。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。
11．M13单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即(1)—————(2)—------------—(3)—-------------—。
12．野生型的M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：
——------------------和——-----------------。
13．以丸噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA的长度是不同的，前者为—----—
kb，后者为————kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的—---------------—的范围内。
二、判断题
1．取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在λDNA中具有两个切点。
外源DNA通过取代这两个切点问的片段被克隆。
2.现在最常用的pUC载体是pUCl8，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。
另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA．。
3．噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。
4．λ噬菌体DNA和M13单链噬菌体DNA在成熟前的DNA复制都是用滚环模型。
5． M13噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100个子代噬菌体。
6．以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量是相同的。
三、选择题(单选或多选)
1．限制性内切核酸酶EcoRI在野生型的丸噬菌体DNA中有5个切点、HindⅢ有7个切点，BamHI也有5个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过( )
(a)体内突变 (b)完全酶切后连接
(c)部分酶切 (d)先用甲基化酶修饰后再酶切
2． pBluescriptMl3载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，如：
(a)可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析
(b)利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增
(c)利用通用引物进行序列分析
(d)利用这两个启动子进行定点突变
上述四种功能中哪一种是不正确的?( )
3．下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( )外都是正确的。
(a)通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了10～10 0倍
(b)BAC载体在细菌中以环型超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易
(c)BAC载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
(d)克隆到BAC载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列 4．以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会大小不一、生长速度不一的现象，其原因是( )
(a)营养成分不足
(b)重组后的质粒复制不稳定
(c)重组后的黏粒整合到宿主染色体上
(d)重组体中插入片段的大小不同
5． M13K07是一种辅助噬菌体DNA,可用它帮助噬菌粒制备单链DNA,这是因为( )
(a)M13K07能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA
(b)M13K07能够提供成熟包装的蛋白
(c)M13K07提供了成熟包装所需的信号
(d)M13K07的10个基因都是正常的
6．黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，( )
(a)它具有COS位点，因而可进行体外包装
(b)它具有质粒DNA的复制特性
(c)进入受体细胞后，可引起裂解反应
(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应
7． Mu噬菌体也是一种转座元件，这种转座元件( )
(a)可引起寄主的突变
(b)可用于细胞内的基因工程
(c)具有转座酶基因
(d)以上说法都正确
8. 关于M13的IG区，下列说法中哪一项不妥当?( )
(a)具有正负链的复制起点
(b)具有噬菌体DNA被包装的信号
(c)具有150个碱基的AT富集区
(d)具有八个回文序列，可形成五个发夹环
9． M13噬菌体基因组编码10个基因，在它的成熟过程中起调节作用的蛋白是( )
(a)gp2蛋白 (b)gp5蛋白 (c)gp7蛋白 (d)gp9蛋白
四、简答题
1．在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上，为什么?
2．如何将野生型的九噬菌体改造成为一个理想的载体?
3．用SalI切割从噬菌体J2分离的DNA时，得到8个片段，分别是： 1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和11.4kb。
但是，用SalI切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2噬菌体DNA时，只得到7个片段，分别是： 1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和11.4kb，根据这些结果，您得到哪些信息?
4．在cI基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑?
5．λ噬菌体DNA被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么?
五、问答题
1. 为什么野生型的九噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?
2．什么是蓝白斑筛选法?
3. 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?
4．什么是cI筛选法?
5．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
6．什么是M13的IG序列区?有何特点和功能?
7．将野生型的M13改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问M13中的EcoRI最初是如何引入的?
8.以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌体的就就一定是重组体?
9．M13系列载体具有那些优缺点？
10．黏粒载体具有哪些特点与不足?
11．辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?
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