第一章1-6噬菌体载体2
大肠杆菌、质粒和噬菌体
细菌质粒性质：
5、质粒对于细菌的生长不是必须的
代表性细菌质粒（1）
F因子（fertility factor）
F因子，又称致育因子或性因子，62×106Dalton，94.5kb，环状双链DNA，编码94个中 等大小多肽，其中1/3基因（tra区）与接合作用有关。 存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中，决定性别。
★ 菌株基因优化：生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型 （例如β 半乳糖苷酶缺陷型），可用于分子克隆实验。 ★ 操作简便，表达量高：大肠杆菌操作和培养条件简单，适于大规模发酵。表 达的外源基因蛋白量甚至可以达到细菌总蛋白的80%。
大肠杆菌在分子生物学实验中的应用
缺点：
★ 基因结构差异：大多数真核基因含有内含子，细菌中没有除去内含子机制，外源基因 编码区必须是连续的，删除真核基因的内含子和5’非编码区 原核：CDNA 真核：DNA
划线到LB平板上。
质粒概述
质粒（plasmid）是染色体以外能 自主复制的遗传因子
不具有胞外期
对寄主细胞来说是非必需的 符合这三条标准的染色体外DNA或 RNA分子都可以称为质粒。 狭义的质粒：一般是指细菌染色体外的 环状DNA分子。 质粒的命名：一个小写字母p加2-3个 大写字母和数字，如pBV220，pET30 。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
郑丽舒
中国疾控中心 病毒病预防控制所
2015.04.15
主要内容
一、大肠杆菌：概述 应用 基本操作 二、质粒：常见质粒 质粒的分离纯化 感受态细胞 质粒转化 三、噬菌体：λ噬菌体及其载体 M13噬菌体及其载体 四、分子克隆
大肠杆菌
大肠杆菌
中文名称： 外文名称： 大肠杆菌 Escherichia coli (Theodor Escherich 1885)
噬菌体
包装容量
• λ噬菌体载体可插入长 噬菌体载体可插入长5-20kb的外来 的外来DNA，这 噬菌体载体可插入长 的外来 ， 比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装 长得多； 比质粒载体能插入的 长得多 的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的 效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建 效率高得比质粒载体复杂。 • 理论上的极限值可达 理论上的极限值可达23kb，但事实上较为有 ， 效的克隆范围仅为15kb左右 效的克隆范围仅为 左右
（3）外源片断与载体的连接 ） • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 通过载体的粘性末端，将载体连接成多 联体，以利于将两个cos位点之间的片断 联体，以利于将两个 位点之间的片断 装入噬菌体颗粒
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染 ）重组噬菌体的体外包装， 力的噬菌体颗粒 • 利用特殊材料，制备噬菌体包装蛋白 利用特殊材料， • 连接产物与包装蛋白混合时，就可完成 连接产物与包装蛋白混合时， 包装反应， 包装反应，形成有感染力的噬菌体颗粒 • 包装蛋白对所包装的 包装蛋白对所包装的DNA大小有高度选 大小有高度选 择性， 范围： 分子的75％－ ％ 择性， 范围：λDNA分子的 ％－ 分子的 ％－105％
基因克隆载体 (λ噬菌体载体 噬菌体载体) 噬菌体载体
• 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 噬菌体(bacteriophage)：是感染细菌、真菌、 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 放线菌或螺旋体等微生物的病毒。 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 不同的噬菌体在电镜下有三种形态：蝌蚪形、 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形， 微球形和丝形。大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头 部和尾部两部分组成。 部和尾部两部分组成。 • 头部 核心：核酸（ 核心：核酸（DNA或RNA） 或 ） 衣壳：蛋白质， 衣壳：蛋白质，六边形立体对称 • 尾部 蛋白质 尾部( 蛋白质) 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、 尾髓、尾鞘、尾板、尾丝、尾刺 与吸附宿主有关
基因工程知识要点
基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。
——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。
——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。
——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。
——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。
——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。
②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。
哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。
（简述寄主控制的限制与修饰现象。
⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。
所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。
R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。
（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。
噬菌体(Bacteriophage) ppt课件
性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
1 个体微小、可通过细菌滤器 2 无细胞结构专性细胞内寄生
3
分布广泛
11
1.3 噬菌体的特性
4 裂解或不裂解细菌 5 有抗原性可刺激机体产生抗体 6 能够抵抗热、低温、冰冻等
12
1.4 噬菌体结构
13
1.5 噬菌体的化学组成
核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质
蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部
并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起 寄主细胞裂解的噬菌体。
22
1.7 噬菌体侵染细菌实验
烈性噬菌体侵染细菌的过程
（1）吸附 （2）注入 （3）增殖 （4）装配 （5）裂解
23
1.7 噬菌体侵染细菌实验
24
1.7 噬菌体侵染细菌实验
噬菌体的侵染实验的结果 证 明 了 DNA 是 遗 传 物 质
14
1.5噬菌体的化学组成
噬菌体的一些结构蛋白
15
1.6 噬菌体的分类
按照基本形态可划分为三类： 蝌蚪状（T4）、微球状（ ∮x174） 和丝状（M13）。
16
根据噬菌体结构的不同可将其分为：
1
2
3
无尾部结 构的二十
面体
有尾部结 构的二十
面体
线状体
17
1.6 噬菌体的分类
迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构的二十面体，到目前为 止，研究者至少对5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数(占 96.2% )为有尾噬菌体。
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
载体介绍ppt课件
环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型
29
质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母 后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验 室名称，再加上质粒编号。
如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别 取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
载体介绍
1
什么是载体？
简单说，载体就是将外源DNA或 基因携带入宿主细胞的工具。
2
载体应具备的特征
1.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原 点）
2.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供 外源DNA片断插入，同时不影响复制
3.有一定的选择标记，用于筛选 4.具有较高的拷贝数，便于载体的制备
许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础 上改建而成。可见其原型质粒在使用上有 优点。
39
克隆载体
1.pBR322
它由三部分组成： 来自pSCl01的四 环素抗性基因Tetr 来自ColEl的衍生 物pMBl的松弛复 制起点ori 来自RSF2124的氨 苄青霉素抗性基 因Ampr。
组成:
40
特点
具有更小的分子量 （2686bp）和更 高的拷贝数（500700）。 具有多克隆位点
适于组织化学 方法检测重组 体
46
MCS
lacZ`
Ampr Ori
含四个部分：
1.来自pBR322的质粒复制起 点（ori）；
2.ampr ;
3.大肠杆菌β半乳糖苷酶基因 （lacZ）的启动子及其编码 α-肽链的DNA序列；
F+ 又叫雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞， 相应的 F– 又叫雌性细胞。
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组的载体-2
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-2二、噬菌体载体作为细菌寄生物的噬菌体，大多数具有编码多种蛋白质的基因，能利用宿主细胞的蛋白质合成体系，进行生长和增殖。
构建的噬菌体载体，以λ噬菌体、M13和粘粒最为常用。
㈠λ噬菌体载体野生型λDNA是一种基因组为4.8 kb的线性双链DNA，全部序列已知，共编码50多个基因。
其中约一半基因参与了噬菌体的生命周期活动，称为必需基因；另一部分基因，当被外源基因取代后，并不影响噬菌体的生命功能。
另外，在分子两端各有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，称cos位点。
野生型的λ噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体，即既能进入溶菌性生命周期又能进入溶源性生命周期。
λ噬菌体感染细菌后，λDNA通过粘性末端而环化。
既可溶菌性生长（裂解），即λDNA在宿主中多次复制并合成大量基因产物，装配成噬菌体颗粒，最后裂解宿主菌；又可以溶源性生长，即λDNA整合到宿主染色体基因组D NA中，与之一起复制并遗传给子代，但宿主细胞不被裂解。
裂解途径和溶源途径的选择取决于宿主与噬菌体之间的许多因素的相互作用，以及噬菌体基因组的精确调控。
λ噬菌体具有二个重要特征，使之成为一类重要的、很有价值的基因克隆载体。
①除必需基因外的功能相关（溶源生长和重组）基因成簇排列在一起位于中间部分，约占全基因组的30%，不是溶菌生长所必需的。
因此，该区可缺失或作外源DNA的插入区。
②噬菌体颗粒成熟的包装过程（外壳蛋白包装DNA），只要重组DNA不小于野生型λDNA全长75%和大于105%，均可被包装成具有噬菌体活性的成熟颗粒。
因此大约可插入长达15kb的外源DNA。
当外源DNA片段克隆到插入型载体上，噬菌体便丧失某些生物学功能，即插入失活效应。
又可分为免疫功能失活的和β-半乳糖苷酶失活的两种亚型。
①免疫功能失活的插入型载体。
插入位点位于基因组中的免疫编码区，外源DNA片段插入后，就会使载体合成阻遏蛋白的能力被破坏，导致不能进入溶源生长周期。
噬菌体
操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子克隆等技术即可操作， 在几周内即可筛选106～108克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系 统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。
筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成 本低、可多次扩增等突出优点。
2.6 噬菌体展示技术的局限性
所建库的容量和分子多样性受到限制； 不是所有的序列都，进而
1 个体微小、可通过细菌滤器 2 无细胞结构专性细胞内寄生
3
分布广泛
1.3 噬菌体的特性
4 裂解或不裂解细菌 5 有抗原性可刺激机体产生抗体 6 能够抵抗热、低温、冰冻等
1.4 噬菌体结构
1.5 噬菌体的化学组成
核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质
蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部
Bacteriophage
1
噬菌体概述
2 噬菌体展示技术
3 细菌的检测与治疗
4
噬菌体载体
5
噬菌体转导
第一章 噬菌体概述
概念
简史
分类 结构
特性
1.1噬菌体概念
噬菌体是感染细菌、真菌、 放线菌、螺旋体等微生物的 病毒，只能在活的微生物细 胞中复制增殖。
1.1噬菌体概念
噬菌体 分裂中的大肠杆菌 大肠杆菌 电镜扫描图
2.7 噬菌体抗体库的分类
(1)根据 免疫抗体库
插入基
因片段 非免疫抗体库 天然抗体库
的来源 库
半合成抗体
全合成抗体 库
第一个合成的噬菌体抗体库是Barbas等 1992年报道将依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有
毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。
基因克隆主要载体系统
低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后 仍能有效的转化给受体细胞,同时低分子量的质粒 对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高 的拷贝数可获得大量的克隆基因
a
11
(三)质粒载体的选择记号
新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。
a
8
a
9
(一) 质粒载体
质粒载体包括以下两种： 1.克隆的质粒载体
允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。 2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
a
10
(二) 质粒载体必须具备的基本条件
(1) 具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。
(2) 具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形 DNA、 单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。
a
17
噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
基因克隆主要载体系统
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲（Genetic Engineering）一、课程说明课程编码：02200200课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）学分：31．课程性质：专业必修课。
2．适用专业与学时分配：适用生物技术专业。
教学内容与学时分配3．课程教学目的与要求：本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。
其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。
基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。
基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。
它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。
对学生达到毕业要求贡献如下：1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；教学要求：学完基因工程学后，学生将具备以下能力：1）具有良好的自学能力；2）综合运用所掌握的基因工程学理论知识和技能、从事生物科学及其相关领域科学研究的能力。
4．本门课程与其它课程关系：先修课程为生物化学、微生物学、分子生物学、细胞学等，具备基础理论知识及实验能力是基因工程学课程的基础。
载体介绍
pBR322—→插入在Ampr 中，基因型为Tetr 、Amps 、—— →在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培 养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的现象叫插入失活。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷 贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷 贝数多（10-200个）。
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为:
接合型（conjugative plasmid)
非接合型（non-conjugative plasmid) 2. F质粒(fertility factor)
质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能 力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 1kb-200kb以上不等。
细菌质粒的一般生物学特性
1. 很多细菌中已发现；
2. 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大 部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；
3. 大多数质粒的宿主范围较窄；
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载
体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
噬菌粒 pEMBL8 质粒 pUC8 单链噬 辅助噬菌体 大肠杆菌 菌体 寄主菌株 f1 M13 IR1 71/18
基因工程-3-载体
完整的β-半乳糖苷酶 N端 C端
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
2.pUC系统
蓝白斑筛选
X-gal也是β-半乳糖苷酶的 一种底物，经降解后可生成 溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落 呈蓝色。
3.pGEM-T载体 经 Taq DNA 聚合 酶扩增后的 PCR 产物末端都带有单 个 A
六、枯草杆菌分泌表达系统
三、质粒的类型
1、抗性质粒（Resistance （R）plasmids） 2、致育因子（Fertility （F）plasmids） 3、Col质粒 4、降解质粒(degradative plasmids)
5、侵入性质粒(virulence plasmids)
四、质粒载体的改造 ①去掉不必要的DNA区域 ②减少限制性内切酶酶切位点 ③加入易于检出的选择性标记 ④关于质粒安全性的改造 ⑤改造或增加基因表达的调控序列
优点：
①非致病的土壤微生物,不像大肠杆菌那样具 有热源性脂多糖; ②遗传学特性先进,很多噬菌体和质粒适合于 用作克隆载体; ③分泌蛋白能力强,当分泌蛋白跨过细胞膜后, 就被加工和直接释放到培养基中,这使得回收 和纯化目的蛋白较为简单; ④良好的发酵基础和生产技术。枯草杆菌在 工业上长期被用于生产蛋白酶、α-淀粉酶等
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称
氨苄青霉素 （Amp）
作用方式
一种青霉素的衍生物，通过干扰细菌胞 壁合成之末端反应，而杀死生长细胞。
抗性机理
bla抗性基因编码的一种周质酶，即 β-内酰胺酶，可特异的切割amp的 β-内酰胺环，从而失去杀菌效力。
氯霉素（Cm） 一种抑菌剂，通过同核糖体50S亚基的结 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异 合作用，干扰细胞蛋白质的合成，并阻 地使氯霉素乙酰化而失活 止肽键的形成。 卡那霉素 （Kan） 一种杀菌剂，通过同70S核糖体的结合作 kan抗性基因编码氨基糖苷磷酸转移 用，导致mRNA发生错读。 酶，可对Kan进行修饰，从而阻止同 核糖体之间的相互作用。
基因工程-2-载体ppt课件
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度） ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 （琥珀突变型）
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记（如LEU2） ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
载体2
在酵母细胞中常用的载体的共同特点
• 这些载体，它们共同的特点是：（1）能在大肠杆 菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。这样可使外 源基因转化到酵母细胞之前先在大肠杆菌中扩增； （2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。这些标 记一般能和大肠杆菌相应的突变体互补，如 Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些还携带用 于大肠杆菌的抗菌素抗性标记；（3）含有合适的 限制酶切位点，以便外源基因的插入。共有三种 类型的载体，如图3-19 。
插入型载体
• 在λimm434区有EcoRI单一酶切位点便于外源DNA 插入的称为插入型载体。 λ gt10（CI) λgt11(LacZ) • 若 CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑 • 若 不插入外源基因 溶源 混浊斑 • 若LacZ插入基因 IPTG/X-gal平板有白斑 • 若LacZ无插入基因 IPTG/X-gal平板有蓝斑
附加体型载体（YEP）
• YEP型载体一般由大肠杆菌质粒、2µm质粒以及 酵母染色体的选择标记构成。2µm质粒含有自主 复制起始区（Ori）和STB区,STB序列能够使质粒 在供体细胞中维持稳定。利用2µm质粒，人们已 经构建出许多YEP型载体。YEP型载体PYF92 （如图3-21）就是由酵母的2µm质粒、pBR322质 粒和酵母的His3+(组氨酸)基因构成的。YEP型载 体对酵母具有很高的转化活性，一般为103-105转 化子/微克DNA。比YRP型载体更稳定，拷贝数也 高（25-100个/细胞），是基因克隆中的常用载体。
• • • • • • • • •
（二）λ噬菌体的类型 插入型载体 替换型载体 ( 三 ) λ噬菌体载体的应用 1.转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 2. λ DNA的体外包装
第一章1-6噬菌体载体2
3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。
•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。
第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。
•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。
用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。
•该载体克隆效率很高。
•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。
•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。
Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。
筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。
反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。
•核酸探针杂交。
Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。
λ噬菌体载体大学生物学
重
性
组
λ噬菌体的裂解生长状态
裂解周期
λ噬菌体的溶原状态
野生型λ噬菌体的缺陷
野生型的λ噬菌体的基因组大而且复杂，不适于直接作 为基因克隆的载体。
lλ噬菌体基因组中含有基因克隆常用的限制性核酸内 切酶的多个识别位点
l由于λ噬菌体外壳只能接纳一定长度的DNA分子，要想 获得具有感染力的噬菌体颗粒，其DNA长度应控制在λDNA的75% ～105%的范围内，即野生型λ-DNA可装载的外 源DNA片段不大于2.5kb
l重组λ-DNA分子的筛选 较为方便，提取简便
谢谢
可以编码至少30个基因
黏性 末端
头 部 蛋 白
尾 部 蛋 白
整 合 、 重 组
调 控A 免合 疫成 性
DN 晚 期
调裂 控解
裂解生长非必要区
黏性 末端
λ噬菌体的结构示意图 在噬菌体颗粒内，基因组DNA呈现线性，其两端的 5′末端各带有12个碱基的互补单链（黏性末端）。
GGGCGGCGACCT
12bp的cos位点
λ噬菌体载体的主要类型
l取代型载体具有成对的克隆位点，在这两个位点 之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所置 换。
λ噬菌体载体的主要类型
以λEMBL3和 λEMBL4为代表。
EMBL3载体 左臂（20kb）
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EMBL4载体 左臂（20kb）
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
中间可替代区（14kb）右臂（9kb）
EcoRⅠ BamHⅠ SalⅠ
SalⅠ BamHⅠ EcoRⅠ
λ噬菌体载体的优点
lλ-噬菌体载体在体外包装成噬菌体颗粒后，可以高 效转染大肠杆菌，感染宿主细胞的效率几乎可达 100%，而质粒DNA的转化率只有千分之一
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。
•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。
第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。
•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。
用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。
•该载体克隆效率很高。
•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。
•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。
Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。
筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。
反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。
•核酸探针杂交。
Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。
插入了大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因片段，可以表达外源cDNA 而形成β-半乳糖苷酶融合蛋白。
•λgt18/19 、λgt20/21和λgt 22/23 是λgt 11的衍生载体。
•重组体筛选：•未重组的噬菌体载体转入lac -宿主后，在X-gal 平板上形成淡蓝色噬斑；而外源DNA 片段插入载体后，重组噬菌体形成无色噬斑，很容易辩别。
•常常用免疫学方法对噬班或菌落进行筛选。
Lambda gt10 mapLambda gt11 mapLambda gt11概述：•Lambda gt11是一个克隆和表达载体。
•用于小的插入（7.2 kb ）片断构建cDNA 文库或基因文库。
•在其β-半乳糖苷酶翻译终止位点上游的LacZ 基因内，有单一的EcoR Ⅰ位点。
•如果外源DNA 的阅读框与lacZ 吻合，即可表达融合蛋白。
•在构建cDNA 文库时，利用Oligo (dT)或随机引物合成的cDNA 经过EcoR ⅠAdaptors 或Linkers 修饰后，可以和λgt11连接起来。
宿主：•建议用Y1089(r-) and Y1090(r-)作受体菌。
筛选：•利用特异的抗体进行筛选。
EMBL3和EMBL4•EMBL3/4是由λ1059衍生的λ置换型载体。
•是常用的基因组克隆载体，克隆的DNA 片段大小为9-23kb 。
•多克隆位点分别位于一个14 kb 填充片段的两侧。
•两载体均在填充片段内含有red 及gam 基因，可由Spi 表现型筛选重组子。
•除多克隆位点的顺序相反外，EMBL3和EMBL4的其余特征相同。
red及gam基因•red及gam基因：编码一种与重组有关的（核酸外切酶和一种抑制E coli recBCD核酸酶活性）蛋白。
•二者抑制噬菌体使之无法在一些宿主菌（噬菌体P2的溶源菌株）中生长，•噬菌体P2的溶源菌株：如基因组内含有一个拷贝P2基因组的菌株。
•spi-筛选：当填充片段被外源片段取代时，重组菌株成为red-及gam-，噬菌体能在P2的溶源菌株中生长。
这一现象称为spi-筛选（对P2介入敏感）。
•spi-筛选不利于亲代载体，可降低非重组子的数目。
Replacement of lambda DNA •Replacement of lambda DNA containing the red and gam genes in the lambda EMBL3 genomic DNA cloning vector with BamHI compatible DNA inserts of ~10-20 kb, permits lytic growth of recombinant phage in E. coli strains containing the P2 bacteriophage lysogen.EMBL3和EMBL4•特征：1. 9-23kb的置换容量。
2. 未切的DNA，消化和去磷酸的DNA臂都是有效的。
3. 要提供宿主菌株。
•宿主：建议用NM538、NM539作受体菌。
LambdaGem-11•是EMBL3的衍生载体，有反向的T7及SP6两个启动子，可以合成RNA探针。
•在多克隆位点区域有特意设计的覆盖的XhoI及BamHI位点，它们分别离T7及SP6启动子为6及11个核苷酸。
•在T7及SP6两个启动子的两侧有非对称的SfiI位点。
•Bacterial strains KW251 and LE392 are included with LambdaGEM®-11 Arms.LE392, NM538 and NM539 are included with uncut vector DNA.提供（cDNA文库表达）载体的公司•Stratagene•Novagen•Invitrogen：Topo Gateway®•BD Biosciences ClontechLambda ZAP®II Vector•载体插入pSK质粒序列，能进行蓝白斑筛选。
•能产生单链环状DNA。
•用于序列测定或定点突变。
Charon4A、Charon21A、Charon32～35和Chaoon40载体•Charon载体：是为克隆DNA大片段而设计的置换型载体。
•Charon32～35和Charon40载体与以前构建的Charon4A和Charon21A载体相比较，可接受的DNA片段更大，可利用的限制酶切位点更多。
•Charon40：•外源DNA长9～24kb；•填充片段两侧各有一个方向相反的多克隆位点；•由许多头尾相接的小DNA片段构成的多填充片段、很容易除去，这是其得天独厚的优点。
因为用单一限制酶(NaeI)可将该片段酶消化成碎片，用聚乙二醇分级沉淀法轻而易举地除尽。
Charon4A•构建真核生物基因组文库的置换型载体。
•填充片段7kb。
载体选择的因素：•限制性内切酶的使用；•插入外源DNA片段的大小；•载体是否将被用于在E coli中表达所克隆的基因；•是否将以质粒或噬菌粒的形式从噬菌体中回收外源DNA；•携带的外源DNA是否将被装配成一个所克隆DNA的大的重叠的叠连群（overlapingcontig）。
（四）、文库的构建1、cDNA 文库的构建•Preparation of abacteriophage l cDNA library.2、基因文库的构建Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage l vector .•Cloning in phage λ. Anonessential central region of the phage chromosome isdiscarded and the ends ligatedto random 15-kb fragments of donor DNA. A linear multimer (concatenate) forms, which is then stuffed into phage heads onemonomer at a time by using an in vitro packaging system.In vitro lambda phage packaging噬菌斑评价The plaque formation assay二、柯斯质粒载体（cosmid）背景•对于λ噬菌体基因组而言，只要含有cos 位点，即可与外壳蛋白包装成λ噬菌体颗粒；这样我们可以除去λ噬菌体中的左右臂和中段，仅留下两端包装所必需的cos序列，使其与适当长度的外源DNA序列重组，经包装、感染后，即可进行基因克隆。
Cosmid：•定义：即粘粒载体。
是即粘粒载体。
是一种人工构建的含有λ噬菌体的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
•柯斯质粒能被包装到λ噬菌体颗粒中，通过感染大肠杆菌而获得扩增；它携带入宿主细菌的DNA片段（超过45kb）要比质粒载体携带的要大。
1、cos质粒构建•将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA两端包装噬菌体所必需的cos 序列，再加上质粒的复制序列、标记基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。
•粘粒可插入30～45 kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。
•λ噬菌体最多只能携带23kb的外源DNA，所以粘粒主要用于DNA 文库的构建，以获得基因组大片段的DNA克隆。
cosmid构建•cosmid=cos site-carrying plas mid 由λ噬菌体的cos粘性末端+质粒人工构建而成。
•Cosmid：包括质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点、λ噬菌体的cos粘性末端。
Cosmid基因的克隆Cosmid的改良和选择：•1)将两个cos位点组合到同一个粘粒载体中，两个位点的存在将大大简化在载体中的定向克隆。