第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第一章1-6噬菌体载体2
3、λ噬菌体载体的优缺点：•优点：包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高。
•缺点：λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。
•用途：λ噬菌体载体比质粒载体能插入的DNA长得多，常用于构建cDNA文库或基因组文库。
第一章分子克隆的工具酶和载体•第八节噬菌体载体•一、λ噬菌体•（一）λ噬菌体•（二）λ噬菌体载体的改造•（三）λ噬菌体载体举例（三）λ噬菌体载体举例•Lambda gt10•Lambda gt11•EMBL3和EMBL4Lambda gt10概述：•Lambda gt10是一种插入载体。
•在噬菌体阻遏基因cI内有单一的EcoRⅠ克隆位点。
用于插入小的cDNA片段(约6kb)，构建cDNA文库或基因文库。
•该载体克隆效率很高。
•在构建cDNA文库时，利用Oligo(dT)或随机引物合成的cDNA经过EcoRⅠadaptors或Linkers修饰后，就可以和λgt10连接起来。
•克隆到λgt10的噬菌体，可用核酸探针进行筛选。
Lambda gt10map宿主：•建议用C600 and C600hf1作受体菌。
筛选：•如果有外源DNA插入，cI基因失活，该噬菌体进入裂解生长途径，在培养皿形成噬菌斑。
反之，若无插入，cI基因表达，噬菌体进入溶原生长途径，不形成噬菌斑。
•核酸探针杂交。
Insertional cloning•Insertional cloning into the cI gene of thelambda -gt10 cDNA cloning vector (DNA inserts of ~1-5 kb) can be selected in hfl (highfrequency of lysogeny ) mutant strains of E. coli. In hflA strains of E. coli, expression of the lambda cII gene is elevated, resulting in transcriptional induction of the lambda cI repressor gene which promotes lysogeny . Disruption of the lambda cI codingsequence by DNA insertion into the unique EcoRI site of the lambda gt10 cDNA cloningvector, blocks the lysogenic pathway leading to cell lysis and plaque formation.Lambda gt11•λgt 载体系列：是插入型载体。
基因工程的载体
质粒的基本特征
质粒
携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
质粒
质粒的构建
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往 往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构 建的：
b
a b-半乳糖苷酶的a-肽段
CH2OH
HO
O
OHH H
O
H
H
H OH
Cl Br
N
Cl O Br
N
N
Br Cl
蓝白斑筛选：利用β-半乳糖苷酶插入失活 的 载 体 ， 在 生 色 底 物 ( X-gal) 和 诱 导 物 (1PTG)存在时，可形成深蓝色菌斑。用这 种载体进行克隆时，β-半乳糖苷酶基因的 大部分被外源DNA片段取代，所产生的重 组体丧失α-互补能力，在含有X-gal和IPTG 的平板下形成无色菌斑。因此，对于这类
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染 宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏 起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工 程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增
pSC101 8.8 kb 拷贝数 5 四环素抗性标记基因 Tetr ColE1 6.5 kb 拷贝数 20 - 30 大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124 ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因 Ampr
载体介绍
20
酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YAC）
YAC的特点： 1.只能在酵母细胞中扩增 2.克隆容量大，一般为200kb-500kb 3.构建原理，按染色体结构构建
21
染色体复制和遗传的三个基本组件：
1.自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（ori）
2.着丝粒（centromere，cen）
3.端粒（telomeres，tel）
TEL ORI
CEN
TEL
YAC的组成结构
23
YAC的缺点：
抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+， Kan+
多克隆位点MCS：克隆携带外源基因片段 P/E：启动子/增强子 Terms：终止信号 加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用
35
如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核 /真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛 选标记。
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
15
噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
16
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
17
pUC118 (MCS)
pUC119 (MCS)
puC118和 pUC119噬 菌粒载体 的分子结 构
（稍后以大肠杆菌质粒载体详细介绍）
载体介绍
pBR322—→插入在Ampr 中，基因型为Tetr 、Amps 、—— →在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在含有四环素培 养基可生长； 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的现象叫插入失活。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷 贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷 贝数多（10-200个）。
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为:
接合型（conjugative plasmid)
非接合型（non-conjugative plasmid) 2. F质粒(fertility factor)
质粒（plasmid）是独立于染色体外、具有自主复制能 力的遗传单位，其本质是较小的核酸分子，大小范围在 1kb-200kb以上不等。
细菌质粒的一般生物学特性
1. 很多细菌中已发现；
2. 是独立于细菌染色体之外的辅助性遗传单位，基因组绝大 部分为双链环状DNA，不同质粒大小各异；
3. 大多数质粒的宿主范围较窄；
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载
体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
噬菌粒 pEMBL8 质粒 pUC8 单链噬 辅助噬菌体 大肠杆菌 菌体 寄主菌株 f1 M13 IR1 71/18
基因工程载体噬菌体载体
基因转殖
噬菌体载体可以在转基因植 物和动物中嵌入外源基因， 实现基因转殖和遗传改良。
洗牌策略
利用噬菌体载体的洗牌策略， 可以分离和筛选特定的DNA 或蛋白质序列，用于疾病诊 断和药物研发。
噬菌体载体的优势与限制
1 优势
高效的DNA复制和表达能力、容易获取和构建、适用于广泛的宿主细胞、可高表达目标 基因。
农业改良
噬菌体载体在基因工程研究中仍 有很大潜力，可以用于新型基因 编辑技术和药物运荷系统的开发。
噬菌体载体可以应用于药物运输、 基因疗法和肿瘤免疫治疗等领域 的创新药物开发。
噬菌体载体可用于改良农作物、 提高农作物的抗害能力和产量。
2 限制
容量有限、宿主细胞影响表达水平、病毒复制可能导致细胞毒性和免疫反应。
噬菌体载体构建与筛选方法
1
构建方法
通过DNA重组技术将目标DNA序列插入到噬菌体载体的适当位置，并使用DNA连接酶连接两 者。
2
筛选方法
利用选择标记和可视化标记（如荧光蛋白）来鉴定带有目标DNA序列的噬菌体载体。
噬菌体载体在基因表达与蛋白质生产中的 应用
基因工程载体噬菌体载体
了解噬菌体载体的定义、结构与类型以及在基因工程中的应用。探讨其优势 与限制，构建与筛选方法，以及在基因表达与蛋白质生产中的应用。最后， 展望噬菌体载体的未来发展趋势。
噬菌体载体的定义
噬菌体载体是指噬菌体基因组中携带外源DNA序列的DNA分子。它可以被用 来传递、复制和表达外源基因，对研究和应用领域具有重要意义。
Байду номын сангаас
基因表达
噬菌体载体可用于高效表达外 源基因，生产重组蛋白质，如 药物、酶和抗原。
蛋白质纯化
载体介绍
8
λ噬菌体载体举例：λgt10 载体
9
λ噬菌体载体举例：λEMBL3
10
λ噬菌体载体主要特点
主要有如下特点： (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大
仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建，也经常用 于外源目的基因的克隆。
贝数少（1-5个）； 2.“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)：拷
贝数多（10-200个）。
32
质粒DNA的转移
1. 质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型（conjugative plasmid) 非接合型（non-conjugative plasmid)
2. F质粒(y factor)
4.高容量的克隆能力：
45kb （最少不能低于30kb）。
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噬菌粒载体（phagemid vector)
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载 体系列，称为噬菌粒（phagemid或phasmid）
16
几种常用的噬菌粒载体的一般特征
17
pUC118 (MCS)
pUC119 (MCS)
puC118和 pUC119噬 菌粒载体 的分子结 构
30
质粒给宿主细胞的标记
1.氨苄青霉素 (Ampicillin ) 2.卡那霉素 (Kanamycin) 3. 四环素（Tetracycline） 4. 氯霉素(Chloramphenicol) 5. 链霉素（Streptomycin） 6. 潮霉素（Hygromycin ）
31
质粒的复制类型
据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为： 1.“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid)：拷
噬菌体载体
(刘志国，102-105页）
1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 常用作基因工程的噬菌体： ◆双链噬菌体：λ噬菌体。 * 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多 种克隆载体。 *目前常用的有： EMBL系列、 λgt系列、 Charon系列。 ◆单链噬菌体：M13噬菌体。
2. 噬菌体的感染性
噬菌体或病毒DNA
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高 特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合
入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两
种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它
们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：
高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；
(244页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
另一种类型的溶源周期是以噬菌体T1为原 型。比较少见。 基本特征是：不存在噬菌体DNA分子的整 合作用体系，而是变成了一种进行独立复 制的环形的质粒DNA分子。
(243页)
4. 噬菌体的溶源生命周期
Ⅱ、溶源周期的主要特征（以λ噬菌体为原型）： （1）噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 （2）经过短暂的转录。 （3）噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组 DNA上，变成原噬菌体。 （4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细 菌染色体的一部分进行复制。
(244页)
(英含遗工词)
(241页)
2. 噬菌体的感染性
将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并 在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之 前，将此培养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内， 头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌 体颗粒。 由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌 体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感 染周期。 此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置 为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大 量的噬菌斑。
基因工程 考试 重点 噬菌体载体
第二章 DNA重组克隆的单元操作练习题噬菌体载体(练习题)一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是；二是。
2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是。
3．λ噬菌体的基因组DNA 为kb，有多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按复制，成熟包装(晚期复制)则是按复制。
它有一个复制起点，进行向复制。
λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为kb，插入的外源片段最大不超过kb。
5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是和。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自、COS 位点序列来自，最大的克隆片段达到kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为个，取代型为个。
8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。
9．M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是，而来自噬菌体的主要结构是。
11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1)(2) (3) 。
12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：和。
13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为kb，后者为kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因组的的范围内。
载体介绍ppt课件
这种在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该 基因活性丧失的现象叫插入失活。
44
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r
Amp s Tet r
重组体的筛选
...
..
.
. .
涂布有Tet的培养基
. .
. .
.
.
涂布有Amp的培养基
45
2.pUC系列质粒载体
21
染色体复制和遗传的三个基本组件：
1.自主复制序列（ARS） （autonomous replicating sequence） DNA复制起始点（ori）
2.着丝粒（centromere，cen）
3.端粒（telomeres，tel）
TEL ORI
CEN
TEL
22
YAC的组成结构
23
YAC的缺点：
载体介绍
1
什么是载体？
简单说，载体就是将外源DNA或 基因携带入宿主细胞的工具。
2
载体应具备的特征
1.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原 点）
2.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，供 外源DNA片断插入，同时不影响复制
3.有一定的选择标记，用于筛选 4.具有较高的拷贝数，便于载体的制备
拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中 8.可直接对克隆的基因进行核苷酸测序
19
人工染色体载体（artificial chromosome vecter)
定义： 人工染色体载体又叫大分子DNA克隆载体，利用染色体的复制元件来 驱动外源DNA片段复制的载体。 其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。 用来克隆大片段的DNA，不做常规克隆使用。
第一章1-5噬菌体载体
4个操纵子：
• 阻遏蛋白操纵子：cI • 左右两个早期操纵子：复制酶、重组基因、 调节基因（cro、N、cⅡ、cⅢ和Q） • 晚期操纵子：裂解基因、头部和尾部蛋白 基因 • L链：左向转录链 • R链：右向转录链
16
cI，cro、N、cⅡ、cⅢ和Q，头尾和裂解基因 在基因组中的位置
• Figure. The genetic map of the λ phage. The positions of nonlethal and conditionally lethal mutations are indicated, and the characteristic clusters of genes with related functions are shown.
假单胞菌
一、λ噬菌体
7
（一）λ噬菌体
1、λ噬菌体特征： • λ噬菌体由头和尾构成。 • 基因组是长约50kb的线性双链DNA分子， 末端为长12个核苷酸的互补单链(粘端) 。 • DNA组装在头部蛋白质外壳内部，其序列 已全部测出。 • λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA 注入E coli，而将其蛋白质外壳留在菌外。
第一章
分子克隆的工具酶和载体
• 第八节 噬菌体载体
1
噬菌体载体
• 噬菌体（phage）：是感染细菌的一类病 毒。有的噬菌体基因组较大，λ噬菌体 和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、 fd噬菌体等。 • 用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的复 杂的多用途载体应用最为广泛。 • 要有效地利用这些载体，须熟知λ噬菌 体的分子生物学。为了适当地选用这些 载体，还应该了解设计和组建这些载体 时所考虑的原则。
17
（1）λ噬菌体的调节基因： • λ噬菌体的溶原生长和裂解生长发育过 程是在6个调节基因的控制下进行的； 如cI、cro、N、Q、cⅡ/cⅢ • cI：溶原性阻遏蛋白，能抑制除自身 外所有基因的转录。 • cro和N：是两个前早期基因，
基因克隆的载体噬菌粒载体
基因克隆的载体噬菌粒载体
第3页
4. 存在着一个多克隆位点区，所以许各种不一样类型外 源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 因为多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因5’端编码区，可按照IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组子；
基因克隆的载体噬菌粒载体
第2页
常见噬菌粒载体pUC118和pUC119
是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体基 因间隔区（IG）重组而成噬菌粒载体。
1. 含有较小分子量共价、闭合、环形基因组DNA，可克 隆10kb外源DNA片段，并易于进行分离与操作；
2. 编码一个ampr基因作为选择记号，所以只有携带 pUC118或pUC119噬菌粒载体大肠杆菌转化子细胞，才 能够在含有氨苄青霉素培养基中生长，便于转化子选择；
6. lacZ基因是置于lac开启子控制之下，这么插入 外源基因便会以融合蛋白质形式表示；
7. 含有质粒复制起点，在没有辅助噬菌体情况下， 克隆外源基因能够像质粒一样按常规方式，复 制形成大量双链DNA分子
基因克隆的载体噬菌粒载体
第4页
8. 带有一个M13噬菌体复制起点，在有辅 助噬菌体感染寄主细胞中，能够合成出 单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌 到培养基中；
第6页
pBluescript噬菌粒载体
基T3和T7噬菌体开 启子，能够定向指导外源基因转录活动；
2. 同时含有一个单链噬菌体M13或f1复制起点 和一个来自ColE1质粒复制起点，在不一样情 况下，能够采取不一样复制形式，分别合成单 链或双链DNA；
3. 编码有一个胺苄青霉素抗性基因，供作转化 子记号；
第八讲 单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系 -半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
第八讲单链菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
噬菌粒载体
（2）pUCll8和pUCll9噬菌粒载体的优点 主要的有如下几个方面： （i）具有小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进行体外分离与 操作； （ii）编码有一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带着pUCll8或pUCll9噬菌粒载体的大肠杆菌转化子细胞， 才能够在含有氨千青霉素的培养基中生长，便于转化子的选择； （iii）拷贝数含量高，每个寄主细胞可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的 载体DNA； （iv）存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA限制片段，不经修饰便可直接插入到载体分子 上； （v）由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5′-端编码区，故可按照Xgal-IPTG组织化学显色反应试验， 筛选重组体分子； （vi）lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因（当其读码结构没有发生改变的情况下）便 会以融合蛋白质形式表达，即产生出β 半乳糖管酶与外源蛋白质的融合产物； （vii）含有一个质粒的复制起点，因此在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规方 法，复制形成大量的双链DNA分子； （viii）带有一个M13噬菌体的复制起点，所以在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单链DNA拷贝，并 包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中； （ix）在Puc118和pUCll9这两个载体中，多克隆位点区的核着酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可 转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录负链DNA。 （x）可以直接对克隆的DNA片段进行核着酸序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。
（3）pUCll8和 pUCll9噬菌粒载体的克隆程序 应用PUClls或PUCllg噬菌粒作载体克隆外源DNA的标准程序，包括连接、转化和 筛选三个基本的步骤。首先选用适当的核酸内切限制酶，分别对克隆的外源DNA及载 体分lacZ△15的大肠杆菌之Amps表型菌株，涂布在含有Xgal-IPTG和氨个青霉素的营养培 养基平板上。只有获得了噬菌粒载体的转化子细胞才能生长成菌落，其中多克隆位点 上插入了外源DNA片段的呈白色，反之则呈蓝色。 图5-17展示了通过加 BamHI衔接物的办法，将目的基因克隆到pUCll9噬菌粒载体 的基本过程。
噬菌体载体
第三章噬菌体载体一、填空题1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是—-----------—；二是----------——。
2．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。
3．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。
在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。
它有一个复制起点，进行—-------—向复制。
λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。
其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。
这种黏性末端可以自然成环。
成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。
4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。
5．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------—。
6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。
从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。
8．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------——(2)——————————(3)—---------------------—。
9． M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1)————————(2)—-------------—，(3)———————————。
10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。
入噬菌体及质粒载体
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体
替换型载体
插入型载体
• 免疫功能失活的插入型载体：载体基因组 上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸 内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插 入到这种位点上时，就会使载体所具有的 合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能 进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的 λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没 有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑 浊的噬菌斑。
• 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向 重复序列。因此当外源DNA插入时，一对 克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉， 从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能 力。
λ噬菌体载体的特点
(1)筛选简便；
(2)可克隆的片段大，最大可达23 kb， 而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基
因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因
（OL, OR)之间的相互作用来决定的。 • 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那 么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源 周期。
构建λ噬菌体载体的基本原理
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第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
C．复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程：当感染的M13 phage颗粒穿过性须时，其外层主要衣壳蛋白质脱落，M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ蛋白进E.coli细胞内，↓感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用下转变为双链DNA，称复制型DNA。
通过结构进行几轮复制。
↓当基因Ⅱ产物在亲代RF DNA的正链特定位点上产生一个切口时，病毒基因组的扩增即告开始。
↓E.coli DNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正链的MB DNA(pdI将单核苷酸不断加到游离的3-CH上合成(+)DNA)。
↓当复制叉环绕模板整整一周时，新合成的正链由基因II产物切去，经环化后形成单位长度的病毒基因组。
*1.只形成(+)DNA的原理：当每个感染细胞中合成出200个(+)DNA时，便会产生出单链结合蛋白质。
这种蛋白质通过同(+)链DNA结合，从而阻断了(-)链DNA的合成。
*2.单链DNA结合蛋白(即GeneV产物)的功能有如下两方面：①阻断GeneIImRNA的转译；②与新合成的(+)DNA结合，阻止其再转变成RNA/DNA。
图M13 phage在感染的E.coli Cell内的复制过程，前四步发生在感染后的15-20分钟。
导致每个寄主细胞内积累100-200个环状RF DNA分子，随后持续产生单链(+)DNA并形成子代病毒颗粒。
因此在感染的细胞内，RF DNA的分子数目和子代(+)DNA的产生速率都能够保持适度。
D．异常的形态发生(大的克隆能力)与大多数其他细菌病毒不同，M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒，而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时，GeneV产物从正链上脱落，而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。
由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中，因此，对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。
E．M13是非溶菌的，因此不会形成真正的噬菌斑，实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致，其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。
每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒，因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒，其效价可达1012pfu/ml。
二、M13克隆体系1．M13克隆体系A．M13mp载体系列是Messing et al., 构建的。
这个载体系列都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。
M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息。
B．M13克隆体系的寄主菌寄主菌的F因子含有缺陷型的-半乳糖苷酶基因，它所编码的多肽没有活性，并缺失第11-41位氨基酸。
这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时，在感染细胞中产生的-半乳糖苷酶N端片段与寄主F因子产生的缺陷型的-半乳糖苷酶结合后，可形成具酶活性的蛋白。
*M13噬菌体之寄主菌株应用M13噬菌体载体进行克隆时的寄主菌株有：JM101，JM105，JM107，JM109，JM110，TG1，TG2，XL1-Blue，XS127，XS101，71/18，KK2186，MV1184，(FromSomebrook et al., 1989. P.211)2．M13克隆体系-半乳糖苷酶显色反应原理*M13和相关寄主菌株如JM101。
由于它们单独均不能产生有功能活性的-半乳糖苷酶，因此单独均不能显色。
只有当M13 phage载体和JM101一类菌株一道才能产生完全的有功能活性的-半乳糖苷酶，因此可以显色。
A．X-gal显色反应原理具功能活性的-lac是以四聚体形式存在的，它可将无色的底物X-gal：(X-gal: 吡喃半乳糖苷衍生物)5-bromo-4chloro-3-indolyl--D-galactoside(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷)切成半乳糖和深蓝色的底物-靛蓝：5-bromo-4-chloroindigo因此，X-gal可以作为检测-半乳糖苷酶活性的一种有效的指示剂。
B．顺反子内互补作用或-互补作用推理：*使M13体系显色最简单的办法是使之带上一个完整的lac操纵子，但这样的结果会使M13分子过大而不便于克隆操作。
*所以，应用DNA重组技术构建出只具-半乳糖苷酶基因一小部分的M13派生载体。
这个片段编码-半乳糖苷酶的氨基末端，即-肽链。
*通过顺反子内互补测验(intracistroniccomplementation test)便可检测出这种肽链的功能活性。
定义：所谓顺反子内互补作用，是指编码同样的多肽链序列但又各具有一个突变的两个基因，联合产生出一种有功能活性的蛋白质多肽的生化过程。
举例：两个lac操纵子突变体：一个在染色体上Lac-一个在F质粒上Lac-当两者同处一个细胞内(部分二倍体)，两个lac突变体互补了，形成Lac+互补作用：顺反子互补也可以多肽形式出现，例如M13克隆体系就是一个典型的例子。
Lac缺失突变lacZ(M13)简称M15↓合成一种缺失了11-41氨基酸的缺陷性的-半乳糖苷酶，又称M15多肽。
这段缺失使该酶失去了四聚化作用的能力。
遗传标记lacZ M15：缺失突变体，缺失lacZ基因中的-半乳糖苷酶N端部分编码序列。
M15所表达的小肽可以参与互补。
M13 phage的许多寄主菌所携带的F附加体都有这种缺失的lacZ基因变种。
但是，在体外加入野生型的-半乳糖苷酶的溴化氰片段(cyanogens bromide fragment)(2-92氨基酸)就可以使M15多肽的活性得以恢复，重新获得形成四聚体的能力。
因此说溴化氰自然补偿了lacZ基因的M15突变，这种作用叫做-互补作用：其中M15蛋白质多肽叫-受体溴化氰片段叫-给体M13-JM101互补作用：实验发现，用一种特定的-半乳糖苷酶的HindII片段代替溴化氰片段，同样也可以发生-互补。
在M13-JM101克隆体系中；M13噬菌体载体具有lac HindII片段，JM101 F质粒具有M15突变基因。
所以M13-JM101是可以实现-互补作用的；可形成具功能活性的-半乳糖苷酶。
克隆基因活性的调节：M13载体所携带的HindII片段上具有：lacIlac启动子(P)lac操纵位点(O)lacZ(-肽链)4 个组成部分，简称lacZOPI片段。
*HindII片段=lacZOPI片段*由上述可见M13-HindII片段上不带有功能性的阻遏基因。
所以在被感染的细胞中，-半乳糖苷酶的合成将是组成型的：因为当M13噬菌体颗粒感染了E.coli细胞之后，很快就会累积约200个RF DNA/cell；假若其上带有HindII片段，那么普通的lac+细胞的阻遏状态将会随着HindII片段的复制而得以消除；这是因为每个细胞中都仅存有10个左右的阻遏物分子的缘故。
结果在感染的细胞中，lac结构基因的转录活动便属于组成型的。
*从组成型到诱导型的改造为了克服这种组成性，已将lac阻遏基因的I q突变引入寄主细胞。
这个I q突变基因可以产生出十余倍超量的阻遏物，所以这种突变的存在，寄主细胞就能合成出充足的阻遏物去补偿大量的M13 RF DNA分子。
在具有lacI q 突变基因的寄主细胞中，给lac操纵子加入一种诱导物，典型的是IPTG，就可以激活HindII片段的复制。
IPTG分子结构式IPTG的作用：*是一种含硫的乳糖类似物。
IPTG：isopropylthio--D-galactoside 异丙基硫代--D-半乳糖苷。
*这种类似物在没有乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成-半乳糖苷酶。
所以我们称IPTG为-半乳糖苷酶的安慰诱导物(gratuitous inducer)，亦即不发生代谢变化的诱导物。
*在X-gal显色反应中，-半乳糖苷酶同样也需要诱导，但X-gal 不是一种诱导物，所以得在琼脂平板上加入IPTG。
JM101寄主菌株(及其它类似菌株)：在M13克隆体系中常用JM101菌株作寄主，该菌株染色体上的lacZ基因已经缺失了，但在它携带的F质粒上有一个M15基因和lacI q突变，这有两个方面的作用：*第一，可以产生出超量的lac阻遏物，这就使得lac操纵子的表达置于培养基中渗入的IPTG的调控之下。
*第二，当M13载体感染之后，通过-互补作用，便会形成有功能活性的-半乳糖苷酶。
在补加X-gal及IPTG的培养基中，就会出现蓝色的菌落。
3．M13载体系列的发展M13噬菌体要发展成克隆载体。
着选必须鉴定出可用来克隆外源DNA的非必要区段，然而它似乎不存在这种区段。
*特殊区段的发现——M13唯一的基因间区段的发现。