第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
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第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
吴乃虎
中国科学院遗传与发育生物学研究所
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
一、单链噬菌体的一般生物学
1.单链噬菌体的优越性
2.M13噬菌体的生物学特性
二、M13克隆体系
1.M13克隆体系
2.M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理
3.M13载体系列的发展
4.M13载体系列的优点
三、噬菌体展示载体
1.噬菌体展示载体的构建原理
2.噬菌体展示载体
3.噬菌体表面展示文库
4.应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例
四、噬菌粒载体
1.M13噬菌体载体克隆的若干难点2.噬菌粒
3.若干常用的噬菌粒载体4.pBluescript噬菌粒载体5.pUC118和pUC119噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体
一、单链噬菌体一般生物学
大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体,它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1.单链DNA phage的优越性
A.具有双链的复制型DNA(RF DNA),可如质粒质粒一样进行遗传操作;RF DNA:Replication Form DNA。
B.RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C.不受包装的限制。因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D.可容易地测出外源DNA的插入取向。
E.可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子,这种单链DNA分子有如下用途(作为模板):
*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序
*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针
*3利用寡核苷酸进行定点突变
2.M13 phage的生物学特性
A.M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切,例如:
①基因组组织形式相同;
②病毒颗粒大小、形状相近;
③DNA同源性高达98%以上。
B.在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA,感染具F性须的大肠杆菌菌株,因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的;M13噬菌体的(+)链DNA,又称为感染性单链DNA。
C.复制型双链DNA(RF DNA=Replication Form DNA) 感染过程:当感染的M13 phage颗粒穿过性须时,其外层主要
衣壳蛋白质脱落,M13 DNA及附着其上的Gene Ⅲ
蛋白进E.coli细胞内,
↓
感染性单链DNA(正链DNA)在细菌胞内酶的作用
下转变为双链DNA,称复制型DNA。通过结构
进行几轮复制。
↓
当基因Ⅱ产物在亲代RF DNA的正链特定位点上
产生一个切口时,病毒基因组的扩增即告开始。
↓
E.coli DNA聚合酶I以环状的MB负链模板合成正
链的MB DNA(pdI将单核苷酸不断加到游离的3
-CH上合成(+)DNA)。
↓
当复制叉环绕模板整整一周时,新合成的正链由基
因II产物切去,经环化后形成单位长度的病毒基因
组。
*1.只形成(+)DNA的原理:
当每个感染细胞中合成出200个(+)DNA时,便会
产生出单链结合蛋白质。这种蛋白质通过同(+)链
DNA结合,从而阻断了(-)链DNA的合成。
*2.单链DNA结合蛋白(即GeneV产物)的功能有如下两方面:①阻断GeneIImRNA的转译;
②与新合成的(+)DNA结合,阻止其再转变成
RNA/DNA。
图M13 phage在感染的E.coli Cell内的复制过程,前四步发生在
感染后的15-20分钟。导致每个寄主细胞内积累100-200个环状
RF DNA分子,随后持续产生单链(+)DNA并形成子代病毒颗粒。
因此在感染的细胞内,RF DNA的分子数目和子代(+)DNA的产生速率都能够保持适度。
D.异常的形态发生(大的克隆能力)
与大多数其他细菌病毒不同,M13并不是在细胞内组装成噬菌体颗粒,而是在GeneV蛋白-DNA复制物移动至细菌细胞膜的同时,GeneV产物从正链上脱落,而病毒的基因组从感染细胞的细胞膜上溢出时被衣壳蛋白所包被。由于病毒基因组并不需要导入一个预先形成的结构之中,因此,对于可被包装的单链DNA的大小并无严格限制。
E.M13是非溶菌的,因此不会形成真正的噬菌斑,实验中所见到的M13噬菌斑乃是由于感染细胞生长缓慢所致,其生长速率通常只为正常生长速率的1/2-3/4。
每个感染细胞每个世代可产生数百颗粒,因此培养基内可聚集大量的病毒颗粒,其效价可达1012pfu/ml。
二、M13克隆体系
1.M13克隆体系
A.M13mp载体系列是Messing et al., 构建的。这个载体系列都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来。
M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有-半乳糖苷
酶基因(lacZ)的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信
息。
B.M13克隆体系的寄主菌
寄主菌的F因子含有缺陷型的-半乳糖苷酶基因,它所编
码的多肽没有活性,并缺失第11-41位氨基酸。
这种寄主菌当其感染了没有外源DNA插入的M13时,在感
染细胞中产生的-半乳糖苷酶N端片段与寄主F因子产生
的缺陷型的-半乳糖苷酶结合后,可形成具酶活性的蛋白。