碱裂解法提取质粒：原理和注意事项1
质粒DNA的提取-碱裂解法实验原理及步骤
实验二质粒DNA的提取－碱裂解法一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验介绍碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。
二、仪器及试剂1.仪器及耗材：37℃恒温摇床、冷冻离心机、台式离心机、微量移液器、50 ml离心管、1.5 ml离心管管、枪头、各种规格的量筒、接种环、试剂瓶、100 l或者250 ml三角瓶、玻棒等。
2.试剂及配制：LB培养液的配制：酵母浸提物 5.0 g；胰蛋白胨 10.0 g；NaCl 10.0 g；依次称量后加入800 ml去离子水后搅拌至完全溶解，用5 mol/L NaOH （约0.2 ml）调节培养液的pH值至7.0。
实验一-碱裂解法提取质粒DNA
实验一、碱裂解法提取质粒DNA及检测一、实验目的与原理简介实验背景：质粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技术。
质粒作为载体应具备下列四个特点:①有足够的容纳目的基因的幅度，并且对于携带的目的基因能够借助载体的复制和调控系统得到忠实的复制与增殖。
②在非必要的DNA克隆区有多种限制性核酸内切酶的单一识别位点，易于基因片段与载体的连接、重组与筛选。
③与宿主细胞有相同一个或多个遗传表型（如抗药性、营养缺陷型或显色表型反应等)。
④拷贝数多,易于宿主细胞的DNA分开，便于分离提纯。
分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细胞使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA.实验原理：碱裂解法质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的的.在强碱性pH时，染色体线性DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，调节pH值至中性时,变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性纠缠形成网状结构，经过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一直沉淀下来而被除去。
实验目的：提取基因工程中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。
二．实验试剂1,SolⅠ100ml： 1M Tris-HCL（pH8.0）2。
5ml,0.5M EDTA 2ml, DDW 91ml, 20％葡萄糖4。
5ml( 葡萄糖单独灭,灭完后加入Sol I中），高压灭菌，4°保存.2,SolⅡ100ml:（新鲜配制，常温使用）10% SDS 50ml, 2M NaOH 50ml.使用前将两种溶液混合。
3，SolⅢ 500ml：KAc 147g， HAc57。
5ml，加300mlDDW搅拌,定容至500ml。
高压灭菌，4°保存。
4，70%乙醇无菌水DDW5，苯酚/氯仿/异戊醇（25：24:1)氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。
碱裂解法提取质粒原理和注意事项
碱裂解法提取质粒原理和注意事项碱裂解法是一种用于提取质粒的常用方法，通过在碱性条件下使细菌细胞裂解，进而释放出质粒。
碱裂解法的原理是利用质粒与细菌细胞核酸的不同碱溶解性，使质粒保留在溶液中，而细菌细胞核酸被沉淀下来。
本文将详细介绍碱裂解法的原理和注意事项。
碱裂解法的原理：1.细菌细胞的预处理：首先，将含有质粒的细菌菌落接种到LB(琼脂)培养基中，经过适当时长的培养，使细菌菌落扩大到较大体积。
2.收获细菌细胞：将培养基中的细菌细胞收获下来，一般通过离心方法将菌液沉淀。
3.细菌细胞裂解：将细菌细胞沉淀后，将其重悬到高浓度的碱溶液中，使细菌细胞在碱性条件下裂解。
4.分离核酸：碱条件下，质粒DNA和线粒体DNA往往会溶于溶液中，而细菌细胞的染色体DNA不溶于溶液中，并随着碱度增加逐渐沉淀。
通过快速离心，将细菌细胞染色体DNA沉淀，而质粒DNA留在上清液中。
5.提取质粒：将上清液取出，通过乙醇沉淀方法使质粒DNA沉淀下来，通过离心收获质粒，即可得到纯化后的质粒DNA。
注意事项：1.使用无菌操作：为保证实验的准确性和重复性，实验过程中必须严格遵守无菌操作的要求。
例如，使用无菌器皿和无菌操作工具，避免细菌污染。
2.注意细菌菌落的培养条件和时长：细菌菌落的培养条件和时长会对实验结果产生影响。
培养条件应符合细菌所需的培养基成分和培养温度，时长应确保细菌菌落予以充足的生长和扩大。
3.使用高浓度的碱溶液：为充分裂解细菌细胞，需要使用高浓度的碱溶液，通常为pH12的溶液。
4.快速离心：由于细菌细胞裂解后的溶液中可能含有许多细菌细胞碎片和核酸碎片，为避免这些碎片沉淀到上清液中，需要进行快速离心，在最短时间内将质粒DNA沉淀下来。
5.质粒的纯化：通过乙醇沉淀方法提取质粒时，需要仔细控制乙醇的用量和沉淀时间，以避免损失待提取的质粒DNA。
总结：碱裂解法是提取质粒DNA的常用方法之一，其原理是利用质粒DNA与细菌细胞染色体DNA在碱性条件下的不同溶解性，通过沉淀法分离出质粒DNA。
碱裂解法提取质粒-配方,操作说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
碱裂解法提取质粒
碱裂解法抽提质粒原理碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，以下碱裂解法制备质粒的原理。
碱法质粒抽提用到三种溶液，溶液I：50 mM葡萄糖、25 mM Tris-Cl 、10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II：0.2 N NaOH、1% SDS；溶液III ：3 M 醋酸钾、2 M 醋酸。
1、溶液I的作用对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。
加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和微生物生长。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。
2、溶液II的作用NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
3、溶液III的作用SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。
溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。
同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。
2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。
基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与PDS共沉淀。
所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。
这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。
碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化
实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化一、实验目的学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。
二、实验原理在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
三、实验材料大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）四、实验仪器、用具高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪五、实验试剂LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖抽提质粒DNA所需的溶液：溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1%SDS(w/v)，现配现用；溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；电泳缓冲液（0.5×TBE）：45 mmol/L Tris-硼酸，1 mmol/L EDTA，pH8.0；六、实验步骤：1、质粒DNA的提取（1）在LB固体平板上挑单菌落接入2ml 含Amp的LB液体培养基中（已灭菌），37℃振摇培养过夜；（已经完成）（2）取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（3）加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡混匀；（4）加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌；（5）加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min；（6）12000rpm离心5min；（7）吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；（8）小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）（9）加入200μL70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；（10）加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA，37℃放置10min。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒详细原理
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
每个曾经用碱法抽提过质粒朋友，希望你看本文后能有所收获。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的ED TA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓NaOH 稀释制备0.4 N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
碱裂解法提取质粒：原理和注意事项
质粒提取之达人建议碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。
追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。
这是导致我的学生误入歧途的主要原因。
后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多“老师”也是这个状态。
这就不得不让人感到悲哀了。
我想这恐怕和我们的文化有点关系。
中国人崇尚读书，“学而优则仕”的观念深入人心。
经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。
所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。
如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的“八股学”。
生命科学是实验科学，它讲究动手。
如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。
一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的“艺术家”。
每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
碱裂解法提质粒原理
碱裂解法提质粒原理碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理基于DNA的碱基配对规则和DNA的两条链之间的翻转关系。
这种方法有很高的效率，可广泛应用于分子生物学和基因工程领域。
质粒是存在于细菌和酵母等微生物中的非染色体DNA分子，它们通常是环状双链DNA。
碱裂解法是将目标微生物（如大肠杆菌）中的质粒提取出来的方法，其过程包括质粒的裂解、蛋白质的去除和质粒的纯化。
首先，碱裂解法将目标微生物细胞中的质粒与细胞壁分离。
这一步骤通常涉及细菌培养、细菌丝核酸的提取以及DNA溶解。
在细菌培养过程中，大肠杆菌等微生物会在培养基中快速繁殖，形成细菌幕。
当细菌充分生长后，细胞壁会变得较薄弱。
此时，通过低速离心将细菌细胞从培养基中分离出来，获取到含有大量质粒的细胞沉淀。
接下来，细菌细胞的壁需要被破坏以释放质粒，这是将质粒提取出来的关键步骤。
一种常见的方法是使用SDS（十二烷基硫酸钠）作为表面活性剂，将其加入到含有细菌细胞的缓冲液中。
SDS能够破坏细菌细胞膜结构，同时与细胞膜内外的脂质相互作用，使其破裂。
此外，碱性条件还可以帮助加强该过程，通常加入10％氢氧化钠溶液。
在碱性条件下，DNA双链碱基配对被破坏，形成两条DNA单链，一条翻转并暴露于碱性溶液中。
破坏细菌细胞后，通过高速离心将细胞残渣分离出来，其中包含蛋白质、RNA和DNA碎片。
而质粒DNA则溶解在上清液中。
接下来，通过酚/氯仿法去除蛋白质。
在此过程中，酚用于与蛋白质结合，氯仿用于与水相溶解的DNA结合，从而实现两者的物理分离。
最终，通过离心使酚/氯仿混合液分为上清液、蛋白质相和DNA相。
获得DNA相后，可以继续进行纯化，以去除余留的RNA、酚等杂质。
常用的纯化方法有以异丙醇沉淀DNA、通过柱层析法（如硅胶柱层析法、离子交换柱层析法）分离和纯化DNA。
总结来说，碱裂解法提取质粒的原理是通过碱性条件下，利用SDS使细菌细胞破裂，释放质粒。
此后，通过酚/氯仿法去除蛋白质，并通过柱层析法进行纯化。
碱裂解法抽提质粒DNA的原理很详细
碱裂解法质粒提取的原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA 是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。
碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
下面是该法的提取原理:碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。
溶液I的作用任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH 值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
碱裂解法提取表达质粒载体pET
碱裂解法提取表达质粒载体pET-28a及电泳鉴定1. 实验原理可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子叫载体（vector）。
细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单一位点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。
常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
为表达蛋白质设计的载体称为表达载体(expression vector)。
pET系统是有史以来在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统之一，有一系列类似的表达载体。
如表达载体pET28a(见图3)，含有：T7噬菌体启动子、核糖体结合位点、乳糖操纵子、乳糖阻遏子序列（lacI）、 His6标签序列、凝血酶切割位点、多克隆位点、T7噬菌体终止子及pBR322复制子、f1噬菌体复制子、卡那霉素筛选标记序列等。
pET表达系统中的受体菌为能够产生T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)。
碱变性法抽提质粒DNA主要包括收集并悬浮细菌菌体、裂解细胞、将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA以纯化质粒DNA。
我们购买的质粒提取试剂盒的原理也是碱解法裂解细菌，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA。
碱裂解法提取质粒-配方,最好的说明
碱裂解法提取质粒一、基本概念1．质粒：质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。
现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。
在基因工程中质粒常被用做基因的载体。
许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。
有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。
细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。
根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。
每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。
按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒;另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。
一般分子量较大的质粒属严紧型。
分子量较小的质粒属松弛型。
质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。
pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。
如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。
质粒DNA的提取（碱裂解法）
质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。
此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。
这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。
4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。
7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。
碱裂解法提取质粒：原理和注意事项
碱裂解法提取质粒：原理和注意事项质粒提取之达人建议碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
可是我收研究生十几年了，几乎毫无例外的是我那些给人感觉什么都知道的优秀学生却对碱法质粒抽提的原理知之甚少。
追其原因，我想大概是因为《分子克隆》里面只讲实验操作步骤，而没有对原理进行详细的论述。
这是导致我的学生误入歧途的主要原因。
后来我发现其实是整个中国的相关领域的研究生水平都差不多，甚至有很多老师”也是这个状态。
这就不得不让人感到悲哀了。
我想这恐怕和我们的文化有点关系。
中国人崇尚读书，学而优则仕”的观念深入人心。
经常听到的是父母对他们的独苗说，你只要专心读好书就可以了。
所以这读书的定义就是将教课书上的东西记住，考试的时候能拿高分……这就是现代科学没有在中国萌发的根本原因。
如果中国文化在这一点上不发生变化，那么科学是不能在中国真正扎根的，它只能蜕化成新的八股学”。
生命科学是实验科学，它讲究动手。
如果实验科学只要看看书就可以了，那我想问有那位神仙看看书就会骑自行车了？或者听听体育老师的讲解就会滑冰了？可是光动手不思考，不就成了一个工匠？一个合格的生命科学研究者，需要在这两方面完善自己。
一个杰出的科学工作者，是一个熟知科学原理并善于应用的艺术家”每个曾经用碱法抽提过质粒的同学，希望你看本文后能有所思考，让中国的未来有希望。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液1, 50 mM 葡萄糖/ 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA，pH 8.0 ；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS ；溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
碱裂解法提取质粒实验报告
一、实验目的1. 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和操作步骤。
2. 熟悉实验过程中所使用的仪器和试剂。
3. 学习质粒DNA的纯化和检测方法。
二、实验原理碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法，其原理基于质粒DNA与染色体DNA在变性和复性过程中的差异。
在强碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。
而质粒DNA由于具有共价闭合环状结构，其氢键断裂后，两条互补链仍保持一定程度的结合。
当pH值调节至中性时，质粒DNA能够迅速复性，而染色体DNA则不能复性，形成缠连的网状结构。
通过离心，可以将复性的质粒DNA与未复性的染色体DNA及其他杂质分离开。
三、实验材料1. 仪器：恒温摇床、台式离心机、微量离心管、移液器、电泳仪、凝胶成像系统等。
2. 试剂：LB液体培养基、含质粒的大肠杆菌、溶液I（50 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L EDTA、25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，2 mg/mL溶菌酶）、溶液II（200 mmol/L NaOH、1% SDS）、溶液III（3 mol/L NaAc，pH 4.8）、TE缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA）、无水乙醇、70%乙醇、琼脂糖、溴化乙锭（EB）等。
四、实验步骤1. 将含质粒的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养。
2. 取适量菌液，8000 rpm离心2分钟，收集菌体。
3. 将菌体沉淀用溶液I重悬，加入溶菌酶溶液，室温放置10分钟。
4. 加入溶液II，混匀，65℃水浴10分钟。
5. 加入溶液III，混匀，室温放置5分钟。
6. 12,000 rpm离心10分钟，收集上清液。
7. 向上清液中加入等体积的无水乙醇，混匀，室温放置15分钟。
8. 12,000 rpm离心10分钟，收集沉淀。
9. 用70%乙醇洗涤沉淀，12,000 rpm离心5分钟。
10. 弃去洗涤液，将沉淀溶解于TE缓冲液中。
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是一种用于从大肠杆菌中提取质粒的方法。
碱裂解法是其中一种常用的方法，该方法利用碱性条件下DNA的不稳定性，将细胞壁溶解，并使质粒DNA从细胞中释放出来。
本文将介绍碱裂解法的步骤、原理以及优缺点。
碱裂解法的步骤如下：1.大肠杆菌培养：首先从保存在琼脂板上的大肠杆菌菌落中挑取一株菌，接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养过夜，直到菌液呈现较浓的悬浮液。
2.收取大肠杆菌：将培养液离心，除去上清。
用冷凉的纯水冲洗沉淀两次，将菌沉淀重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0。
3.制备碱性溶液：在50 mM Tris-HCl缓冲液中加入0.2 M NaOH 和1% SDS，混匀制成碱性溶液。
4.碱性裂解：将菌悬液与等体积的碱性溶液混匀，使菌细胞在碱性条件下裂解。
孵育数分钟至十几分钟，直至溶液变为粘稠状。
5.酸性中和：加入等体积的3 M醋酸，酸性中和碱性溶液。
此步骤中，质粒DNA会从溶液中析出沉淀。
6.离心：用高速离心将沉淀离心下来，除去上清。
7.溶解：用适量的纯水将沉淀溶解，可以通过轻轻摇动溶液使其充分溶解。
8.纯化：通过离心或其他纯化方法，如柱层析、琼脂糖凝胶电泳等技术，纯化目标质粒DNA。
碱裂解法的原理是利用碱性条件下DNA的不稳定性。
当细胞处于高pH环境中时，碱性条件会破坏大肠杆菌的外膜，使细胞壁失去完整性。
此时，细胞内的DNA易于释放出来，包括质粒DNA。
然后，通过酸性中和反应将质粒DNA沉淀下来。
最后，通过纯化步骤，可以得到高纯度的质粒DNA。
碱裂解法的优点是简单易行，不需要较昂贵的设备和试剂，并且可以在相对短的时间内提取到目标质粒DNA。
此外，这个方法适用于大多数质粒类型和质粒大小。
碱裂解法适用于小规模提取或初步提取，用于大规模提取时效率较低，不推荐使用。
然而，碱裂解法也存在一些缺点。
首先，该方法提取到的DNA含有RNA、蛋白质和其他污染物。
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法是一种常用的提取质粒的方法，其原理主要基于碱性条件下DNA的
特性。
在这种方法中，碱性条件能够使得DNA变性，即双链DNA分子被分解成
两条单链DNA。
这种变性的DNA在碱性条件下会呈现出单链的形态，使得质粒
得以被提取出来。
在进行碱裂解法提取质粒时，首先需要将含有目标质粒的细菌进行培养，使得
细菌大量繁殖并产生大量的质粒。
随后，通过离心等方法将细菌进行分离，得到含有目标质粒的细菌菌体。
接下来，将细菌菌体进行溶解，使得细菌菌体内的细胞壁和膜被破坏，释放出含有质粒的细胞内液。
此时，碱性条件的作用就体现出来了。
通过加入碱性溶液，使得DNA发生变性，双链DNA分子被分解成两条单链DNA。
在这种碱性条件下，质粒的DNA与
细菌染色体的DNA会有不同的解旋速度，从而使得质粒的DNA得以被分离出来。
质粒的DNA呈现出线性形态，方便后续的提取和纯化。
在质粒的DNA被分离出来后，可以通过中性化等方法使得DNA重新回到双
链的形态，从而得以进行后续的分析和应用。
碱裂解法提取质粒的原理简单而有效，被广泛应用于分子生物学领域中。
总的来说，碱裂解法提取质粒的原理是基于碱性条件下DNA的变性特性。
通
过使DNA变性，质粒的DNA得以被分离出来，从而实现了质粒的提取。
这种方
法简单易行，成本低廉，适用于大规模的质粒提取工作。
因此，碱裂解法在分子生物学研究中具有重要的应用价值。
掌握碱裂解法抽提质粒的原理
6.中和： 加350ul溶液P3 ，立即温和颠倒离心管6-8次，充分混匀，此时将出现白色 絮状沉淀。（注：此时质粒DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合物沉淀）。
↓10000 rpm, 10 min
7.转移上清：将上清吸入另一支干净的离心管中（注意尽量不要吸出沉淀）
↓10000 rpm, 10 min
2. 柱平衡：向吸附柱中加入500ul的平衡液BL，将吸附柱置于收集管上 ↓ 10000 rpm，1min
倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于收集管上
3. 收集菌体： 取1.4ml菌液转入小离心管中
↓ 10000 rpm，1min
弃上清。将离心管倒置于纸巾上，以尽量去除上清。
4.悬浮： 加250ul溶液P1于细菌沉淀中，涡旋震荡（或用加样枪吹打），彻底
实验仪器与材料
（一）仪器：超净工作台， 恒温摇床，台式离心机， 高压灭菌锅
（二）材料：1.5ml 离心管， 加样枪，含有质粒pQE30 的大肠杆菌TG1 、LB液 体培养基
实验步骤
1. 细菌培养：接种含质粒pQE30的大肠杆菌TG1 10μl 到10ml含氨苄青霉素 (100μg /ml)的LB培养液中， 37℃摇培过夜（10~12h）
▪ 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 ▪ TE缓冲液：溶解DNA
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液（含DNA)
TE溶解DNA
溶液I充分重悬 溶液II裂解
酚抽提(去蛋白）
质粒DNA溶液
乙醇沉淀DNA
溶液III中和
洗涤沉淀
[质粒提取试剂盒组成]
平衡液BL STE缓冲液（溶液P1） Lysis Buffer（溶液P2） 3M NaAc，pH 4.8（溶液P3） 去蛋白液PD 漂洗液PW 洗脱缓冲液EB 离心吸附柱 废液收集管 RNaseA （10mg/ml）