免疫学课件——第十一章 中和试验
[医学]免疫学课件——第十一章 中和试验
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先将病毒稀释成每一接种计量含100空斑 单位(PFU),加等量稀释的血清,37℃1小时.每一 稀释度接种3个已形成单层细胞的空斑瓶,同时 用同样稀释的病毒加等量的Hanks液作为对照.
免疫学原理与技术
空斑减少法中和试验
病毒稀释液
100PFU/0.5毫升
免疫学课件——第十一章 中 和试验
病毒或毒素与相应的中和抗体结合后,可使 其失去致病能力,此种中和反应有严格的种,型 特异性,而且还可以定量,所以可以定性,定量检 测病毒,毒素或抗体.
中和试验是以病毒或毒素对生物系统的毒 力为基础的,所以首先根据病毒,毒素特性选择 合适的细胞,鸡胚或试验动物,测病毒,毒素对其 毒价,再测抗体中和后的毒价,如果毒价有较明 显的变化,说明抗原,抗体发生了反应,即抗体对 病毒或毒素发生了中和.而且还可以根据毒价 的变化,来判断血清中抗体中和病毒或毒素的 能力—中和价(抗体的定量)
%
数
数
10-4
6
0
100
13
0
13/13
100
10-5
5
1
83
7
1
7/8
88
10-6
2
4
33
2
5
2/7
29
10-7
0
6
0
0
11
0/11
0
注:CPE为细0-5-lgTCID50 88%-50%
=
lg10-5-lg10-6
88%-29%
lgTCID50=-5.64 TCID50=10-5.64,0.1毫升
血清中和价(lg)=L+d(S-0.5)
中和试验
测定方法:将接种病毒，并已发病濒死的小鼠,无菌法取脑组织,称重、加稀释液充分研磨，配制成１0-1悬液，3 000r/ｍin离心20分钟,取上清液，以1０倍递次稀释成1０、10、10……10,每个稀释度分别接种５只小鼠，每只脑内注射0.0３ml，逐日观察记录各组的死亡数。
IgLD50(或ＴＣIＤ50）＝L+d(S－０．5)
Ｌ为病毒最低稀释度的对数，d为组距，即稀释系数,S为死亡比值的和。本例Ｌ=－４,d＝-1,S＝1+1+5/６+1/6=3
IgLD50＝-４＋(-1）×(3-0．5)
=-6.5
则LＤ50＝10,0.０3ml
注意：用本法计算稀释血清中和试验中和效价时，S应为保护比值之和。
(3)病毒的稀释按选定的病毒稀释度范围,将病毒液作10倍递次稀释,使之成为所需要的稀释度。
(4)感作将不同稀释度病毒分别定量加入两排无菌试管内,第一排每管加入与病毒等量的免疫(或被检)血清作为试验组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为对照组;充分摇匀后放37℃感作12ｈ。
(５)接种按“病毒价测定”中所述接种方法接种试验动物(或鸡胚、组织细胞)。观察持续时间，根据病毒和接种途径而定。
(２）EID50的测定(以新城疫病毒为例)将新鲜病毒液体10倍递次稀释法释成1０-1、1０-2、10-3……1０-９不同稀释度，分别接种9-1０日龄鸡胚尿囊腔,鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种0.２ｍl,每个稀释度接种6只鸡胚为一组,以石蜡封口,置37-38℃培养，每天照蛋,24h之内死亡的鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置４℃保存。连续培养5天，取尿囊液作血球凝集试验，出现血凝者判阳性,记录结果,按上述方法计算EＩD50。
中和实验方法
RSV 特异性中和抗体滴度检测一、实验原理：抗体与相应的病毒粒子特异地结合，使后者失去对易感动物或细胞的致病力。
（该试验方法以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2 倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液。
）二、实验分类：1. 固定血清--稀释病毒中和试验2. 固定病毒—稀释血清中和试验3. 简单定性中和试验4. 空斑减少法三、实验步骤：1. 提前设定56 C水浴锅，将分装好的待测血清于56 C灭活（降低补体对实验结果的影响）30min 。
2. 将加过双抗的培养基DMEM/F-12 （用于Hep-2 细胞；Vero 细胞常用DMEM培养基）和BI血清进行37C预热30min，与此同时灭好实验台（该准备3599细胞培养板灭过菌枪头以及15ml和50ml摇菌管）为后续实验做准备。
3•实验台灭菌30min，灭好台子后进行实验，首先取1.5mlEP管，用DMEM/F-12培养基8倍稀释待测血清（每管中加培养基210卩」再加相应的血清30^）1,拆开96孔培养板后在盖子进行设计（实验设计参考图1）,最后向每孔中加入75卩的培养基，按照实验设计加入相应的稀释血清75门用排枪以两倍梯度稀释血清。
（注意：最终到256倍时吸出的多余的75卩血清并弃掉。
）4•实验孔以及阳性对照孔分别每孔加入25卩1（注意：加毒时应从血清低浓度到高浓度）的104TCID50病毒混匀，4C孵育2 h。
5. 在实验剩余半小时左右进行消化细胞，镜检细胞汇合度为90%左右即可用，弃掉培养液后，用2-3 ml 无血清培养吹洗几遍细胞（意图为去除死细胞或活性不好的细胞），加入 2 ml 胰酶后开始计时，将细胞培养板置于37C的CO2无菌培养箱培养消化2-3min，在镜检细胞间有间隙或细胞收缩为单个状态为好，加入等体积的无血清培养基终止，小心吸掉液体，加入有血清的培养基2-3ml 轻轻地吹下皿底部的细胞，轻微用枪吹吸几次使其成为均匀的单细胞悬液后转移到新的15ml 离心管中等待细胞计数。
《免疫学实验》PPT课件
间接凝集抑制试验 ——妊娠试验
（已知） （已知）
（已知） （已知）
反向间接凝集试验 ——某些传染病和原发性肝癌的早期诊断。
四、实验操作内容
（一）玻片法—— ABO血型鉴定（每人做）
用已知血型Ab,测未知血型Ag；为定性实验。
ABO血型系统
血型 红细胞表面的血型Ag 血清中的血型b
二、免疫实验课目的 1.验证所学理论知识。 2.训练基本操作技能，培养独立工作能力。
三、要求 1.严肃认真。 2.多想、多看、多做。 3.当堂完成实验报告。
四、Ag-Ab反应的相关知识 血清学反应——即体外进行的Ag-Ab反应。 由于机体绝大部分抗体存在于血清中，故
称之为血清学反应。 1.Ag-Ab反应的基本原则 （1）用已知抗体检测未知抗原； （2）用已知抗原检测未知抗体。
——类风湿因子检测(小组做)
三、凝集反应相关知识
（一）概念 颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体结
合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
颗粒性Ag 又称凝集原 相应Ab 又称凝集素
· 颗粒性抗原： 光镜下可见，肉眼观呈浑浊悬
液，如细菌、RBC等。
· 可溶性抗原： 光镜下无形态，肉眼观呈澄清
4大经典免疫实验
（3）补体结合反应 （4）中和反应 （5）免疫标记技术
实验一 凝集反应
一、目的要求
1.掌握血清学反应概念、特点。 2.熟悉凝集反应的概念、常用凝集反应 的实验方法及结果判定。 3.了解凝集反应的原理、类型及其用途。
二、实验内容 1.直接凝集试验(玻片法)
——ABO血型鉴定(每人做) 2.间接凝集试验
（二）间接乳胶凝集试验 —类风湿因子检测 类风湿关节炎患者血清中存在： 变性IgG — Ag 抗变性IgG抗体(类风湿因子) — Ab 临床上用检测类风湿因子以辅助诊断
中和试验
中和试验病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验。
本试验主要用于：①从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病；②用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型；③测定抗病毒血清或抗毒素效价；④新分离病毒的鉴定和分型，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。
试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。
（一）简单定性中和试验本法主要用于检出病料中的病毒，亦可进行初步鉴定或定型。
先根据病毒易感性选定试验动物（或鸡胚、细胞培养）及接种途径。
将病料研磨，并稀释成一定浓度（约100 LD50～1 000LD50或TCID50）。
污染的病料需加抗生素（青霉素、链霉素各200～1 000单位），或用细菌滤器过滤，与已知的抗血清（适当稀释或不稀释）等量混合，并用正常血清加稀释病料作对照。
混合后置37℃1h，分别接种实验动物，每组至少3只。
分别隔离饲喂，观察发病和死亡情况。
对照动物死亡，而中和组动物不死，即证实该病料中含有与该抗血清相应的病毒。
本法亦可用于毒素（如肉毒毒素）的鉴定和分型。
（二）固定血清稀释病毒法本法多将病毒作10倍递增稀释，分置2列试管，第一列加正常血清（对照组），第二列加待检血清（试验组）。
混合后，置37℃作用1h，将各管混合液分别接种选定的试验动物，每一稀释度用3～5只动物。
接种后，逐日观察，并记录其死亡数，观察结束后，计算LD50和中和指数（表7-1、表7-2），本法适用于大量检样的检测。
表7-1 固定血清稀释病毒法术式表7-2固定血清稀释病毒法中和试验（例一）注：［1］分母为接种数，分子为死亡数；［2］LD50计算见实例。
中和指数＝中和组LD50/对照组LD50=10-2.2/10-5.5=103.3查3.3反对数是1.995，故中和指数103.3＝1.995。
也就是说该待检血清中和病毒的能力为正常血清的1.995倍。
医学免疫学全套完整版PPT课件
自身免疫性疾病发生机制
感染因素
免疫调节异常
遗传因素
某些自身免疫性疾病具有家族 聚集性，与遗传基因密切相关。
免疫系统对自身抗原产生免疫 应答，导致自身组织损伤。如T 细胞和B细胞对自身抗原的识别 障碍、免疫调节分子的异常表 达等。
某些感染因子可诱发自身免疫 性疾病，如EB病毒与鼻咽癌、 幽门螺杆菌与胃炎等。
探讨疫苗在预防慢性病中的潜力，如糖尿病、阿尔茨海默 病等疫苗的研究进展。
4 未来疫苗发展趋势
展望未来疫苗研制技术的发展方向，如个性化疫苗、多价 疫苗等。
抗体工程在医学领域应用
抗体工程基本技术
介绍抗体工程的基本技术，包括基因工程抗 体、人源化抗体等。
抗体在疾病治疗中的应用
探讨抗体在疾病治疗中的潜力，如单克隆抗 体治疗肿瘤、自身免疫性疾病等。
通过识别病原体表面的甘露糖等糖类分子而激活， 参与固有免疫应答的早期阶段。
补体系统激活途径和效应
溶解作用
直接溶解某些细菌和病毒感染的 细胞。
免疫调节作用
参与适应性免疫应答的调节和激 活。
01
调理作用
促进吞噬细胞对病原体的吞噬和 清除。
02
03
04
炎症介质作用
参与炎症反应，吸引和激活炎症 细胞。
04
超敏反应发生机制及类型
01
I型超敏反应
由IgE抗体介导，肥大细胞和嗜 碱性粒细胞释放组胺等活性介 质引起的速发型超敏反应，如 过敏性鼻炎、支气管哮喘等。
02
II型超敏反应
由IgG或IgM抗体与靶细胞表面 抗原结合，引起靶细胞溶解或 组织损伤的超敏反应，如输血 引起的溶血反应、新生儿溶血 病等。
03
03
固有免疫系统
第五节 中和试验
第十一章血清学试验第五节中和试验根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。
中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。
中和试验可在体内进行也可在体外进行。
体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。
常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。
体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。
根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。
根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。
毒素和抗毒素也可进行中和试验。
其方法与病毒的中和试验基本相同。
一、终点法中和试验终点法中和试验（Endpoint neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。
有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。
(一)固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。
1.病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD50)作为毒价单位，而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。
以感染发病作为指标的，可用半数感染量(ID50)。
用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID50)。
免疫学课件-第十一章中和试验PPT课件
些难以治愈的病毒感染具有重要意义。
03
挑战与前景
目前中和抗体药物的研究与开发仍面临诸多挑战，如抗体筛选、稳定性、
生产成本等问题，但随着技术的不断进步，相信中和抗体药物将具有广
阔的应用前景。
疫苗的研究与开发
研究内容
中和试验在疫苗的研究与开发中也具有重要作用，通过检测疫苗免 疫后机体产生的中和抗体，评估疫苗的保护效果和免疫原性。
中和试验在免疫学研究中的前景
01
02
03
病毒变异研究
中和试验对于研究病毒变 异和进化具有重要意义， 有助于了解病毒变异对免 疫应答的影响。
疫苗研发
中和试验在疫苗研发中发 挥着重要作用，可用于评 估疫苗免疫效果和保护力。
抗体药物研发
中和试验在抗体药物研发 中具有关键作用，可用于 评估抗体药物的疗效和安 全性。
试验方法
将效应分子与细胞结合，观察细胞功能变化，如降低或消除即认为 被中和。
应用
细胞的中和试验可用于细胞信号转导研究、药物作用机制研究等。
03
中和试验的应用
病毒性疾病的诊断
诊断方法
中和试验常用于病毒性疾病的诊断，通过检测患者血清中 的中和抗体，判断是否感染病毒。
诊断价值
中和抗体出现较晚，病毒中和抗体滴度与病毒血症、临床 症状的消失及产生免疫力相一致，故中和试验可用来确定 病毒感染的类型、病程及预后。
免疫学课件-第十一章中 和试验
• 中和试验概述 • 中和试验的常用方法 • 中和试验的应用 • 中和试验的挑战与展望
01
中和试验概述
中和试验的定义
中和试验是一种检测抗体或抗原的试 验方法，通过加入适量的抗体或抗原 ，使原有的免疫反应被抑制或消除， 从而确定抗体或抗原的量。
免疫学实验技术培训课件
免疫学实验技术
15
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（免l疫a学实t验t技ic术e theory） 16
三.血清学试验的优越性
• 1、特异性强，敏感性高 • 2、检样量少，预处理简单 • 3、试验方法多，功能各异，可择优选用 • 4、方法简易快速 • 5、可用于抗原或抗体的定位
免疫学实验技术
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补体结合反应
检测病毒
免疫学实验技术
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溶血
+
—
免疫学实验技术
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4.沉淀反应 (precipitation)
• 沉淀反应是指可溶性抗原（细菌培养滤液 、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与 相应抗体在液相中特异结合后，形成的免 疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。
• 反应中的抗原称为沉淀原，可以是类脂、 多糖或蛋白质等；抗体称为沉淀素。
免疫学实验技术
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抗体的免疫原性
马血清制备的 破伤风毒素
免疫学实验技术
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一抗和二抗
一抗：可以特异结合底物，就是识别出我们想要检 测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出 来的。
二抗：可以和一抗结合，并带有可以被检测出的标 记(如带荧光、放射性、化学发光或显色基团）， 作用是检测一抗。
当一抗结合到底物上，就可以通过二抗检测出来。
水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚
至纳克水平上对其进行定量。
免疫学实验技术
23
免疫酶技术分为两类： 免疫酶组织化学法或免疫酶染色法
免疫酶测定法： 固相免疫酶测定法 酶联免疫吸附试验（ELISA） 应用最广泛
免疫学实验技术
24
1.酶联免疫吸附试验（ELISA）
医学免疫学实验课件
免疫分子
包括抗体、细胞因子和补体 等，协调和调节免疫反应的 过程。
免疫学实验的目的和重要性
免疫学实验旨在研究免疫系统的功能、反应和调控机制，帮助阐明疾病发生 的机理，并提供改善诊断和治疗方法的基础。
常见的免疫学实验方法
1 ELISA检测
2 流式细胞术
通过测定特定抗体或抗原 的定量反应，用于检测疾 病标志物和免疫应答水平。
通过将细胞悬浮液与荧光 标记的抗体反应，用于定 量和鉴定免疫细胞的类型 和数量。
3 免疫组化
利用抗体与组织中的抗原 特异性结合，用于检测和 定位特定蛋白质的表达和 分布。
实验准备和实施步骤
1
实验设计
制定实验方案和流程，本采集
从受试者收集血液或其他生物样品，并进行预处理和储存。
医学免疫学实验课件
医学免疫学的定义
医学免疫学是研究人体免疫系统的一门学科，主要关注免疫系统的功能、结构和异常状态，致力于预防和治疗 与免疫系统相关的疾病。
免疫系统的组成和功能
免疫器官
包括脾脏、淋巴结和肺等， 承担着产生、存储和激活免 疫细胞的重要功能。
免疫细胞
包括T细胞、B细胞和巨噬细 胞等，负责识别、捕获和消 灭入侵的病原体。
3
试剂准备
准备实验所需的试剂、标准品和控制品，确保其纯度和可靠性。
4
实验操作
按照实验方案进行各项操作，包括样品处理、测量和分析等。
实验结果和数据分析
• 整理实验数据，进行统计和图形化处理。 • 分析数据，比较实验组和对照组的差异，并寻找相关的趋势和规律。 • 从实验结果中得出结论，并进行科学解释和讨论。
实验的局限性和未来展望
免疫学实验具有时间、资源和技术限制，未来可以发展更加高效和精确的实验方法，以进一步深入研究免疫系 统及相关疾病。
中和试验
第五节中和试验抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为血清学反应或免疫血清学技术。
第一节概述免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为：1. 凝聚性反应包括凝集试验和沉淀试验。
2. 标记抗体技术包括荧光抗体、酶标抗体、放射性标记抗体、发光标记抗体技术等。
3. 补体参与的反应补体结合试验、免疫黏附试验等。
4. 中和反应病毒中和试验、毒素中和试验。
一、血清学反应的一般特点1. 特异性与交叉性血清学反应具有高度特异性，如抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合，而不能与口蹄疫病毒结合。
这是血清学试验用于分析各种抗原和进行疾病诊断的基础。
但若两种天然抗原之间含有部分共同抗原时，则发生交叉反应。
交叉反应是区分血清型和亚型的重要依据。
2. 抗原抗体结合机理抗原和抗体的结合为弱能非共价键结合，其结合力决定于抗原决定簇和抗体的抗原结合点之间形成的非共价键的数量、性质和距离。
常规的血清学反应，如凝集反应、沉淀反应、补体结合反应等，只有在抗原与抗体呈适当比例时，结合反应才出现凝集，沉淀等可见反应，在最适比例时，反应最明显。
这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反应的现象，称为带现象。
二、血清学反应的影响因素1.电解质特异性的抗原和抗体具有对应的极性基(羧基、氨基等)，它们互相吸附后，其电荷和极性被中和因而失去亲水性，变为憎水系统。
易受电解质作用失去电荷而互相凝聚、发生凝集或沉淀反应。
2.温度较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会，从而加速反应的出现。
常用37℃水浴保温。
3.酸碱度血清学反应常用pH为6-8，过高或过低的pH可使抗原抗体复合物重新离解。
第二节凝聚性试验抗原与相应抗体结合形成复合物，在有电解质存在下，复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或沉淀物，根据此现象来测定相应抗体或抗原，称为凝聚性试验。
分为凝集试验和沉淀试验。
一、凝集试验细菌、红细胞等颗粒性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验。
中和试验
4.病毒的中和抗体（neutralization antibody ）指：针对病毒某些表面抗原的抗体，此类 抗体能与细胞外游离的病毒结合从而消除病 毒的感染能力。 5.中和抗体的作用机制：
①直接封闭病毒表面抗原，如与病 毒表面吸附蛋白（VAP）结合，从 而阻断病毒的吸附
②改变病毒表面结构
2012.7.17 张文昌
• 背景 • 原理 • 方法 • 应用 • 各种方法利弊分析 • 发展趋势 • 质量控制
（一） 背景介绍
1.当病原微生物侵入机体时会诱导机体体液 免疫产生相应的抗体。 2.病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自 身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才 能感染细胞，并进一步扩增。 3.病毒完整的复制周期
（七）质量控制
因目前尚无CMV中和抗体的国家标准品，该方法的准确性无 法验证，下面分别对精密性，耐用性和专属性进行验证。
① 精密性验证 重复性验证 对同一份CMV-IVIG样品在同一次试验中平行检测12次，计
算变异系数（CV） CV=σ/μ σ为方差，μ为平均值 中间精密性验证 A：不同操作者对同一份样品分别检测三次 B：同一操作者不同工作日对同一份样品检测三次 分别计算CV
步 骤 三
加至已长成单层 的MRC-5细胞
16h，18h，20h 所铺细胞数目要求较高，防止细胞叠层
梯度乙醇固定细胞， 封闭30min
相继用IE1单抗， 生物素标记羊抗鼠IgG，
链霉亲和素-HRP， 以及底物显色
图像采集与数据处理
步骤一 步骤二 步骤三
实验组
病毒对照
细胞对照
25μ l血清 25μ l维持液 25μ l维持液
③病毒与中和抗体形成的免疫复 合物，易被巨噬细胞吞噬清除
中和试验步骤
中和试验步骤1、测定病毒TCID50/100l2、制备细胞悬液，使细胞浓度约为1105个/mL，加到96孔细胞培养板中，每孔100l。
置37℃ CO2培养箱中，直至细胞长至单层。
3、血清灭活：将待检测的血清放到56℃水浴30min（此时血清中的病原菌都已被灭活）。
4、100TCID50/50l病毒液或者200TCID50/25l病毒液的制备，这两者是等价的。
100TCID50/50l病毒液制备方法：计算已测定了TCID50/100l的病毒原液稀释至100TCID50/50l的稀释倍数:lg100TCID50/50l=-log100-log(100/50)=-2、30103得100TCID50/50l=10-2、30103，假设病毒TCID50/100l=10-6、3，则稀释倍数=(100TCID50/50l)(TCID50/100l)=106、3102、30103≈9976倍。
5、取一块新的96孔板，1-10列每孔加50l待检血清原液，再用8道孔排枪加每孔100TCID50/50l病毒液50l，稍微吹打使血清与病毒液混均。
11列先每孔加50l维持液，再于11列的第一孔加50l标准阳性血清，将标准阳性血清往下作1:2、1:22至1:28倍稀释。
12列第1孔加标准阴性血清原液50l，再加100TCID50/50l病毒液50l。
用维持液将100TCID50/50l的病毒液作4次连续10倍稀释，稀释成10TCID50/50l、1TCID50/50l、0、1TCID50/50l,依次加到第12列的3到6孔，每孔加50l，再每孔加50l维持液。
将培养板置37℃ CO2培养箱中和1h。
6、将细胞长至单层的培养板中的维持液倒掉，然后将上一步已中和1h的血清病毒液转移到长了单层细胞的培养板中，转移的时候要小心，以免加的液体把细胞吹掉了。
7、再每孔加150l维持液，微量振荡器上震荡30s，混均。
将培养板置37℃ CO2培养箱中，96h后开始观察记录结果。
中和试验
结束后，计算LD50和中和指数(表7-1、表7-2)，本法适用于大量检样的检测。 本法多用以检出待检血清中的
中和抗体，对病毒而言，通常中和指数大于50者判为阳性，10-49为可疑，小于10为阴性。 (三)固定病毒稀
释血清法 本法用以测定抗病毒血清的中和价，将待检血清2倍递增稀释，加等量已知毒价的病毒液(与血清混
中和试验
介绍
01 正常值
03 注意事项 05 相关疾病
目录
02 临床意义 04 检查过程 06 相关症状
中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。
正常值
人体处于动态平衡、健康状态。
临床意义
本试验主要用于：①从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病;②用抗毒素血清 检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型;③测定抗病毒血清或抗毒素效价;④新分离病毒的鉴定和分型，中和试 验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血 清稀释病毒法、固定病D50)，摇匀后，置37℃作用1h，接种实验动物。 注：接种剂量0.1ml，含病
毒100LD50; 系指与病毒混合后的稀释度; 分母为接种数，分子为保护数;
PD50为半数保护，其计算
法同LD50的计算。 (四)空斑减少法 在细胞培养上进行病毒中和试验，近年来多采用空斑减少法。先将病
TCID50)。污染的病料需加抗生素(青霉素、链霉素各200-1 000单位)，或用细菌滤器过滤，与已知的抗血清(适
当稀释或不稀释)等量混合，并用正常血清加稀释病料作对照。混合后置37℃1h，分别接种实验动物，每组至少3
只。分别隔离饲喂，观察发病和死亡情况。对照动物死亡，而中和组动物不死，即证实该病料中含有与该抗血清
中和试验
中和试验中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。
所属分类：免疫学概述动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。
中和试验(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。
两种试验方法介绍中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。
(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。
但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。
用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。
在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。
测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10、10、10……10，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。
本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。
实验二 中和试验
在上述各孔内加入50 l稀释好的病毒液，混匀。 在上述各孔内加入50µl稀释好的病毒液，混匀。 50 同时设待检血清毒性对照， 阳性血清对照， 同时设待检血清毒性对照 ， 阴 、 阳性血清对照， 病毒对照和正常细胞对照， 病毒对照和正常细胞对照 ， 其中病毒对照要作 200 个 TCID50 、 20 个 TCID50 、 2 个 TCID50 、 0.2 个 个不同浓度。 TCID50 4个不同浓度。 96孔细胞培养板放入 37℃ 孔细胞培养板放入37 将 96 孔细胞培养板放入 37℃ 5%CO2 培养箱中作用 45min-60min 45min-60min min
1:16（10-1.2） （ 1:32（10-1.5） （ 1:64（10-1.8） （
1:128（10-2.1） 4 （
距离比例= 高于50 的保护率-50% 50% 距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/ 高于50 的保护率—低于50%的保护率） 50% 低于50 （高于50%的保护率 低于50%的保护率） 66. 16. =（66.7-50）/（66.7-16.7） 66. 50） = 0.33
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
感作完成后每孔加入100 l 细胞悬液， 感作完成后每孔加入 100µl 细胞悬液 ， 继续 100 培养箱培养， 37℃ 置 37℃ 5%CO2 培养箱培养 ， 逐日观察并记录 结果，一般要观察5 结果，一般要观察5-6天。 结果计算， 按 Reed-Muench 两氏法或 Karber 两氏法或Karber 结果计算 ， Reed-Muench两氏法或 法进行。 法进行。
TCID50的操作步骤 在青霉素瓶或离心管中将病毒作连续10倍的稀释， 在青霉素瓶或离心管中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-8。 10倍的稀释 将稀释好的病毒液( 接种到96 孔微量培养板中， 96孔微量培养板中 将稀释好的病毒液 (10-3-10-8 ) 接种到 96 孔微量培养板中 ， 每一 稀释度接种一纵排共8 每孔接种100µl。 100µl 稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100µl。 制备细胞悬液： 制备细胞悬液： 取长满单层的细胞一瓶（100ml细胞瓶） 倾去培养液。 取长满单层的细胞一瓶（100ml细胞瓶），倾去培养液。 ml细胞瓶 加入2 胰酶消化液， 37℃培养箱放置几分钟， 加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞 间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。 间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。 加入生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞。 加入生长液，反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞。补 加生长液至20 25ml 20- ml。 加生长液至20-25ml。 在每孔加入细胞悬液100µl（细胞量为2 /ml） 在每孔加入细胞悬液100µl（细胞量为2-3×105个/ml） 100µl 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液 。（100µl 设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液 +100µl细胞悬液）。逐日观察并记录结果 一般需要观察4 细胞悬液）。逐日观察并记录结果， +100µl细胞悬液）。逐日观察并记录结果，一般需要观察4-5天
第五节 中和试验
第十一章血清学试验第五节中和试验根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。
中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的检测等。
中和试验可在体内进行也可在体外进行。
体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。
常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。
体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。
根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。
根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。
毒素和抗毒素也可进行中和试验。
其方法与病毒的中和试验基本相同。
一、终点法中和试验终点法中和试验（Endpoint neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。
有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。
(一)固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。
1.病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100％死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD50)作为毒价单位，而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。
以感染发病作为指标的，可用半数感染量(ID50)。
用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID50)。
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一.毒价滴定
毒价单位: MLD:最小致死量 LD50:半数致死量 ID50:半数感染量 RD50:半数反应量 ELD50:鸡胚半数致死量 EID50:鸡胚半数感染量 TCID50:组织培养半数感染量 毒价的表示: 通常以每毫升(克)含有多少个LD50(或TCID50) 来表示.如某毒素的毒价为105.2TCID50/ml.
累计结果
无CPE 数 0 1 5 11 CPE率 13/13 7/8 2/7 0/11 % 100 88 29 0
注:CPE为细胞病变
免疫学原理与技术
计算方法(内插法): lg10-5-lgTCID50 88%-50%
=
lg10-5-lg10-6 88%-29% lgTCID50=-5.64 TCID50=10-5.64,0.1毫升 上述病毒价为每毫升含106.64TCID50
免疫学原理与技术
空斑减少法中和试验 病毒稀释液 100PFU/0.5毫升 病毒加Hanks液对照 55PFU 血清稀释 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 10-1 10-1.3 10-1.6 10-1.9 10-2.2 10-2.5 中和后空斑数 5 11 15 29 40 50 中和比值 50/55 44/55 40/55 26/55 15/55 5/55 血清中和价(lg)=L+d(S-0.5) =-1-0.3(3.4-0.5) =-1.87 中和价为 10-1.87=1/74
免疫学原理与技术
半数计量的计算: 将病毒液10倍稀释,选择4-6个稀释度接种 试验动物(细胞培养物,鸡胚),每组3-6只(管),观 察一定时间内的死亡(或细胞病变)情况,绘制 表格,计算半数计量.
病毒毒价滴定(接种计量0.1毫升)
病毒稀 释
10-4 10-5 10-6 10-7
观察结果
CPE数 6 5 2 0 无CPE 数 0 1 4 6 % 100 83 33 0 CPE数 13 7 2 0
免疫学原理与技术
中和指数>50为阳性,10-49为可疑,<10为阴性 3.空斑减少试验 本法应用空斑技术,使空斑数减少50%的血 清稀释度作为中和滴度. 先将病毒稀释成每一接种计量含100空斑 单位(PFU),加等量稀释的血清,37℃1小时.每一 稀释度接种3个已形成单层细胞的空斑瓶,同时 用同样稀释的病毒加等量的Hanks液作为对照.
10-1 10-1.3 10-1.6 10-1.9 10-2.2
保护比值:3/3 3/3 3/3 0/3 0/3 带入公式:lgPD50=L+d(S-0.5)
免疫学原理与技术
S为保护比值之和(3/3+ 3/3+ 3/3+0/3+0/3) L为最低稀释度的系数(lg10-1) D为组距(lg10-1.3-lg10-1) 中和价为10-1.75=1/60 2.固定血清稀释病毒法(定性,定量) 将病毒原液作10倍稀释,分装两列试管,第 一列加等量正常血清(对照),第二列加等量待 检血清,混合后37℃1小时,分别接种3-6只试验 动物(或鸡胚,细胞培养),分别计算LD50和中和 指数. 中和指数=中和组LD50/对照组LD50
第十一章 中和试验
病毒或毒素与相应的中和抗体结合后,可使 其失去致病能力,此种中和反应有严格的种,型 特异性,而且还可以定量,所以可以定性,定量检 测病毒,毒素或抗体. 中和试验是以病毒或毒素对生物系统的毒 力为基础的,所以首先根据病毒,毒素特性选择 合适的细胞,鸡胚或试验动物,测病毒,毒素对其 毒价,再测抗体中和后的毒价,如果毒价有较明 显的变化,说明抗原,抗体发生了反应,即抗体对 病毒或毒素发生了中和.而且还可以根据毒价 的变化,来判断血清中抗体中和病毒或毒素的 能力—中和价(抗体的定量)
免疫学原理与技术
定病毒稀释血清法(定性,定量) 先滴定病毒的病毒价,然后将其稀释成每一 单位计量含200LD50(或EID50,TCID50),与等量 的递进稀释的待检血清混合,混合后37℃1小时, 每一稀释度接种3-6只试验动物(或鸡胚,细胞 培养),用与计算毒力相似的方法(Karber法),计 算PD50(半数保护量),即该血清的中和价. 血清稀释:1/10 1/20 1/40 1/80 1/160