克隆载体
常用的克隆载体
第一章 概 论 第二章 基因疫苗工作原理 第三章 基因疫苗抗原基因的筛选和克隆 第四章 基因疫苗的构建 第五章 基因疫苗制备第六章 基因疫苗免疫方法 第七章 基因疫苗免疫效果检测 第八章 影响基因疫苗免疫效果的因素第九章 基因疫苗安全性第十章 细菌病基因疫苗第十一章 病毒病基因疫苗第十二章 寄生虫病基因疫苗第十三章 肿瘤基因疫苗第十四章 控制动物生长性能的基因疫苗 四、常用的克隆载体克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制，从而获得大量克隆化片段的运载工具，常用的克隆载体种类很多，主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
其中，质粒是目前应用最为广泛的克隆载体。
下面简要介绍作为克隆质粒的特性和结构。
（一）质粒特性质粒是指在染色体外能够独立复制和稳定遗传的一类环状双链 DNA 分子。
有的质粒处于染色体外的游离状态，可以随着染色体的复制而复制，并且通过细胞分裂传递到子代。
有的质粒在一定条件下能够可逆地整合到寄主染色体上。
质粒的表示常根据 1976 年提出质粒命名原则，用小写字母 p 代表质粒，在 p 字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或者实验室名称。
例如质粒 pUCl8 ，字母 p 代表质粒， UC 是构建该质粒的研究人员的姓名代号， 18 代表构建的一系列质粒的编号。
质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于一些真核细胞中。
质粒相对分子质量范围为10 6 -2 @ 10 8 。
根据质粒在受体细胞内的数量将质粒分为严紧型质粒和松弛型质粒两种类型。
严紧型质粒在每个细胞只有 1 个至几个拷贝；松弛型质粒在每个细胞中有 10-200 个拷贝。
质粒可以分为三种构型，一种是呈现超螺旋的 SC 构型（ scDNA ），一种是开环 DNA（ ocDNA ），另一种是呈线形分子的 L 构型。
质粒 DNA 与一般 DNA 分子的理化性质相似，例如溶于水、不溶于乙醇等有机溶剂、能吸收紫外线、可嵌入溴乙锭染料等。
实验室常利用这些理化特性鉴定和纯化质粒。
克隆载体
谢谢
载体的分类
pBR322质粒载体
重组体的筛选
通过由转化子所显示出的抗生素抗性来鉴定出重组体，需要 用到阴影平板培养。
表达载体及其必须具备的条件：
1.载体能够独立的复制； 2.应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外 源基因的克隆、鉴定和筛选； 3.应具有很强的启动子，能被RNA聚合酶所识别； 4.应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才 能进行转录； 5.应具有很强的终止子，以使RNA聚合酶集中力量转录 克隆的外源基因，同时使很强的终止子所产生的mRNA 较为稳定；
突变的类型
(3) 倒位 (inversion) 或转位（translocation）
DNA重组使其中一段核苷酸倒置，或从一处迁移到另一处。
倒位或转位（transposition） 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。
克隆载体
质粒载体的设计 噬菌体载体
克隆载体（Cloning Vector）
M13噬菌体载体
概念：M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6.7kb的核 苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。
功能：该类噬菌体作为克隆载体，可以通过质粒提取技术在细菌培养物中获取。M13噬 菌体主要用于克隆单链DNA。
侵染对象： 只感染F+（含F质粒，能产生性菌毛）的大肠杆菌。 克隆特点：感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ， 用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。 目的片段插入RFDNA→感染感受态大肠杆菌细胞→从培养液中获得纯的噬菌体颗粒
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
第五章DNA克隆用载体
三、质粒的构建
（一） 质粒人工构建的方法 方法就是在天然质粒的基础上进行
DNA重组，拼拼接接，以改变其性 能。
（二） 质粒人工构建的目的
（1）加入合适的选择标记基因，如两个 以上，易于用作选择；
（2）增加或减少合适的酶切位点，便于 重组；
（3）缩短长度，切去不必要的片段，提 高导入效率，增加装载量；
质粒pBR322 DNA
pBR322 质粒图谱
多克隆位点
氨苄青霉素 抗性基因
四环素抗 性基因
pUC系列的质粒载体
pUC系列的质粒载体集中了当时载体的诸多优点。 包括4个部分： ①来自pBR322的复制起点(ori)； ②氨苄青霉素抗性基因(ampr)； ③大肠杆菌乳糖操纵子的调节基因(laci)启动子 (Plac)和β 半乳糖苷酶的α -肽(lacZ)； ④位于lacZ基因中靠近5′端的一段多接头，或称为 多克隆位点(MCS)。
因此通过蓝白斑筛选可 以筛选、鉴定重组体与非重 组体载体。
pGEX-6P-1 质粒物理图谱
SV40， 猴空泡病毒40
巨细胞病毒 （CMV）
（二）不相容性
利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞 中，它们在复制及随后分配到子细胞的过 程中，就会彼此竞争，它们在单细胞中的 拷贝数也会有差异，拷贝多的复制更快， 结果在细菌繁殖几代之后，细菌的子细胞 中绝大多数都含有占优势的质粒，因而这 两种质粒中只能有一种长期稳定地留在细 胞中，这就是所谓的质粒不相容性。
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
病毒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞 动物细胞
环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状
第四章克隆载体的特征及类型
吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
基因克隆载体有什么用途
基因克隆载体有什么用途
1.基因表达载体：基因克隆载体被用来将感兴趣的基因克隆到表达主
机中。
通过将基因与适当的调控序列结合，如启动子、增强子和终止子等，可以实现对基因的调控和表达。
这种表达基因的载体在生物制药、蛋白质
生产以及基因治疗等领域有广泛的应用。
2.基因敲除载体：基因克隆载体可以用于基因敲除研究，即通过将目
标基因的编码序列替换或删除，实现对基因功能的研究和破坏。
这种方法
可以用来揭示基因在生物发育、生理过程和疾病发生中的作用和机制。
4. RNAi载体：基因克隆载体还可用于RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术研究。
通过将特定的RNA序列克隆到载体中，可以实现对目标
基因的特异性抑制，进而揭示基因功能和信号传导途径。
5.DNA库构建：基因克隆载体也可以用于构建DNA库，即将一组基因（如全基因组）克隆到载体中形成文库。
这种文库可以用来筛选和分析目
标基因，加快新基因发现和功能研究的进程。
此外，基因克隆载体还可以用于分子标记和荧光报告基因的构建，以
及基因转导、基因传递和转基因生物的制备等方面。
总的来说，基因克隆
载体是基因工程研究中的重要工具，可以实现对基因的调控、研究和应用，对生物学研究、生物技术开发和医学治疗等领域具有重要的推动作用。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
第一章 克隆载体
宿主细胞中λ噬菌体的包装过程 宿主细胞中 噬菌体的包装过程
头部: 头部 E蛋白占72%：头部主要组成成分 琥珀突变导致尾部蛋白积累 D蛋白占20%: DNA进入头部前体以及头部 成熟作用 琥珀突变导致头部蛋白积累
D基因缺失突变株(D-): 基因缺失突变株 基因缺失突变株 溶原菌菌株BHB2690
pMB1的特点: 含有ColE1的松弛型复制起始位点 缺少好的选择标记基因 缺少较好的克隆位点
pBR322的构建 的构建 (1)保留ColE1的松弛型复制起始位点 (2)pSF124中Apr (3)pSC101中Tcr 在抗性基因中带入合适的酶切位点 (4)缺失迁移蛋白mob基因，但保留了bom位点
筛选主要是营养缺陷型
YAC 载YAC平均插入片段一般为100～350kb
构建基因组时,只需要较少的克隆数便可以覆盖整 个基因组,使构建高等生物基因组遗传图谱和物理图谱 成为可能,基因组计划得以顺利实施。
IPTG(异丙基-β-D硫代半乳糖苷)诱导下， 作用底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚－β-半乳 糖苷) ,使菌落呈蓝色
2.农杆菌Ti质粒克隆载体构建 Ti质粒(tumer inducing plamid): 根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含 有的一种质粒，当农杆菌与植物接触时， 会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤) 双链DNA分子，大小在200-250kbp之间
定位整合克隆载体的几种模式: 定位整合克隆载体的几种模式 (1)内源平台双交换置换克隆载体 (2)外源平台双交换置换克隆载体 (3)内源平台双交换插入克隆载体 (4)内源平台单交换插入克隆载体
定位整合克隆载体的定位整合效率
(1)受体细胞 (2)同源DNA片断长短
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
动物基因工程—基因克隆载体
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
克隆载体的基本特征
克隆载体的基本特征
在基因工程领域中，克隆载体起着至关重要的作用。
克隆载体是将外源DNA序列复制并存在于细胞内的一种工具，它具有多种基本特征，下面就让我们依次来了解一下。
一、线性结构
克隆载体通常采用环状DNA结构，但也可以是线性结构。
线性结构克隆载体的优点在于可以很好地进行基因编辑和引导组装，因为我们可以精确地将某个基因插入到DNA链中的任何一个点。
二、多克隆位点
多克隆位点是指克隆载体上多个限制酶切位点，它使得我们可以对载体进行切割和连接操作，使得新的DNA序列可以仿佛“搭积木”一样拼接在载体上，便于我们对其进行进一步的操作。
三、选择标记
克隆载体拥有选择标记，这是一种特殊的DNA序列，它可以帮助我们筛选特定类型的细胞，在细胞培养过程中对于有选择地优异细胞进行筛选。
一般选择标记的方法有抗生素抗性，酵母元素和抑制素敏感性等。
四、维护元素
维护元素是指克隆载体中的特定DNA序列，在细胞内起着非常重要的
作用。
维护元素可以帮助载体与某些DNA蛋白相互作用，防止修饰酶的降解，避免载体丢失，保持在细胞内的稳定状态。
五、操纵元件
操纵元件是指克隆载体中的特定DNA序列，可以控制表达外源基因的时间和数量，包括启动子、增强子和转录终止序列等，操纵元件的调节对于外源基因的表达水平和时间都有至关重要的影响。
以上就是克隆载体的基本特征，这些特征都是为了更好地进行基因工程和生物学研究所必不可少的。
当然，不同的克隆载体可能具有不同的特征，因此在使用的时候我们需要仔细选择适合自己实验的载体。
克隆载体
青霉素抗性检测、蓝白斑筛选(重组表型检测标记)
15
三个显著区别：
1. 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更 高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）
2. 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利 用-互补原理进行蓝白筛选
3. 多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成
第一节 载体简介 第二节 克隆载体* 第三节 人工染色体载体 第四节 表达载体
概念：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和 表达的工具称载体（Vector）;即用于克隆、运载和转移目的基 因并能自我复制的DNA分子
一个DNA片段只有与合适的载体DNA连接构成重组 DNA后，才能高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增
3. 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标 记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标 记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等
4. 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 5. 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子
8/4/2019
11
4363bp
8/4/2019
12
Ampr
3. 加装选择标记
如加入lacZ’ 使受体细胞在裂解之后形成蓝色透明圈
8/4/2019
29
B. λ噬菌体载体分类
1. 插入型载体: 仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如λgt系列 只能插入较小的外源DNA片段（小于10kb）
cos
cos
LA
RA
EcoRI
2. 替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点
噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25％仍不失活， 这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
第三章 基因克隆载体
基因克隆载体(gene cloning vector): 能承 载外源基因，将其带 入受体细胞得以稳定 维持的DNA 分子。
克隆载体的功能
运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
克隆载体具备的条件：
载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
② 双抗菌素抗性选择标记
插入失活，分两次先后选择：
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
插入失活筛选法
pBR322质粒载体的筛选
③ 高拷贝数
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
OC
SC
L
1.1.2 质粒的分类
1）根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有
一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先 不存在该质粒的受体菌中。
简称phage 。
蛋白质外壳内包裹着 DNA（双链、单链、 线性、环状等）。
2 噬菌体载体
2.1 噬菌体的一般特性 2.2 λ噬菌体载体的构建 2.3 λ噬菌体载体的类型
2.1 噬菌体的一般特性
类型：
大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线
状体型。
核酸：
核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花
克隆载体的名词解释
克隆载体的名词解释克隆载体是分子生物学实验中常用的工具，用于携带并负载外源DNA片段，以实现基因克隆和基因工程。
克隆载体可由天然或人工合成的DNA构建而成，广泛用于基础研究、基因表达、基因治疗等领域。
本文将从克隆载体的定义、组成结构、常见类型以及应用等方面对其进行解释。
一、克隆载体的定义克隆载体是指用于将目标外源DNA导入到宿主细胞或有机体中，并在其中进行自主复制、表达和传递的DNA分子。
克隆载体具有一系列特定的序列和功能元件，包括起始子、终止子、选择标记、荧光蛋白等，以确保成功实现目标DNA的克隆和表达。
二、克隆载体的组成结构克隆载体通常由一个或多个元件组成，包括DNA序列、选择标记、表达载体以及复制起源，具体结构如下：1. DNA序列：克隆载体内含有目标外源DNA的序列，其大小和类型因实验需求而异。
DNA序列通常具有特定的限制性内切酶切位点，以便于将外源DNA片段定向插入到载体中的特定位置。
2. 选择标记：为了筛选成功克隆和转入宿主细胞的载体，克隆载体通常携带有选择标记基因，如抗生素抗性基因或荧光蛋白基因。
这些标记基因在宿主细胞中可以提供对抗生素的耐药性或特定荧光表达，从而方便筛选出含有目标外源DNA的成功克隆载体。
3. 表达载体：对于需要进行表达的克隆载体，其内部还包含有启动子、终止子以及表达宿主基因的相关元件。
这些元件协同作用，使得克隆载体能够在宿主细胞中进行基因的转录和翻译，从而实现目标基因的表达。
4. 复制起源：为了保证克隆载体能够在宿主细胞中独立复制，克隆载体通常还含有复制起源序列。
复制起源序列可以与宿主细胞的复制系统相互配合，使得克隆载体能够被复制并遗传到下一代细胞中。
三、克隆载体的常见类型克隆载体具有多种类型，根据其应用和特性的不同，常见的克隆载体包括质粒、噬菌体、合成DNA以及病毒载体等。
1. 质粒（Plasmid）：质粒是环状的双链DNA分子，常见于细菌和真核生物中。
质粒通常具有小分子大小（约1-10 kb），较容易复制和操纵。
克隆载体与表达载体介绍
（二）质粒载体的构建
天然质粒载体不易直接作为克隆载体，需要改造：
（1）选择合适的复制起始位点，松散型质粒复制起始位点； （2）加入合适的选择标记基因，主要有LacZ基因和抗生素抗性基因； （3）增加或减少酶切位点，组装多个单一的限制酶切位点即多克隆位点
（MCS); （4）缩短长度，通常重组DNA分子越小，转化效率越高。
（三）常用的质粒载体
1. pBR322质粒载体
2. pUC18和pUC19质粒载体
3. TA载体
二、噬菌体载体
（一） λ 噬菌体载体 1 λ 噬菌体的性质
λ噬菌体Βιβλιοθήκη 外壳蛋白 线性，全长48502bp
λDNA 5’端含12bp的黏性末端
2 λ 噬菌体的构建 构建λ 噬菌体的依据：
a.λ 噬菌体能够包装原λDNA长度的75%－105%的DNA片段 （36.4~51kb） b.有20kb的区域对λ噬菌体生长非必需。
该λ 噬菌体载体的最大装载容量为: 4.9+5.5+2.6+(51-48.5)=15.5kb
2.6kb
3 代表性λ 噬菌体
(1) 插入型载体
装载容量为：0-10.18kb
(2) 置换型噬菌体载体载体 克隆外源DNA片段范围为：9-23kb
（二） M13 噬菌体载体
1.M13噬菌体的增值
M13噬菌体是单链丝状噬菌体； 长6407bp， 507bp基因间隔区，含复制起始位点，同时可用于改造； M13 DNA在宿主细胞中以双链或单链形式存在，但释放到细胞外的 M13 噬菌体颗粒以单链形式存在。
2.M13噬菌体载体 1) 插入选择标记基因； 2) 组装合适的多克隆位点。
三、噬菌体-质粒杂合载体
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
克隆载体的基本结构
克隆载体是指在基因工程中用来携带和复制目标基因的一类DNA分子。
它具有以下基本结构：
1.起始子：克隆载体中通常包含一个起始子，用于启动基因表达。
起始子通常是一段特定的DNA序列，可以与细胞的转录因子相互作用，从而使目标基因开始转录。
2.复制起点与选择标记：克隆载体中含有复制起点，该起点可以被细胞内的DNA 复制酶识别并复制。
此外，常会在载体中引入选择标记，如抗生素抗性基因，用来筛选带有载体的细胞。
3.多克隆位点：多克隆位点是载体中用来接受目标基因的特定位置。
常见的多克隆位点包括限制性内切酶切割位点、连接酶切割位点等。
通过在多克隆位点插入目标基因，可以实现基因的克隆和表达。
4.报告基因：有时候，克隆载体中还会引入报告基因，用于检测目标基因的表达情况。
报告基因通常是一种易于观察或测量的基因，如荧光蛋白基因，它可以发出特定颜色的荧光。
总的来说，克隆载体的基本结构是由起始子、复制起点与选择标记、多克隆位点和报告基因等组成。
通过这些结构的设计和组装，可以方便地进行目标基因的插入、复制和表达。
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分子克隆质粒载体去磷酸化实验方法步骤对单酶切后的产物去磷酸化是指5‘端的磷酸基团，（3’端是-OH）。
用CIAP去磷酸化，它能将5‘端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。
单酶切的末端能够发生载体自连。
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，简称CIAP，中文名称为小牛肠碱性磷酸酶，是一种可以催化DNA、RNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸水解释放5′末端或3′末端磷酸基团的酶。
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase也可以脱去蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的磷酸基团。
经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团，在进行基因克隆时为避免质粒发生自连，可以使用Calf Intestinal Alkaline Phosphatase去除5'末端磷酸基团。
脱去5′末端磷酸基团的质粒不能发生自连。
用途：去除DNA、RNA 5′或3′末端的磷酸基团；通过去除载体或DNA片断5′末端的磷酸基团，防止载体或DNA片断自连；通过5′末端脱磷，为5′末端磷酸化放射性标记准备模板；用于蛋白质丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的去磷酸化。
载体单酶切过夜，然后65度失活，直接加CIAP去磷酸化后，建议用酚、氯仿抽提或者用胶回收后做连接，因为CIAP去磷酸化酶在螯合剂存在下，经65度30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活（根据反应条件不同有时也有外），用胶回收可以除去酶蛋白。
最好做个对照，检验你的去磷酸化是否成功。
--------------------------------------------------------------------------------前些天才做完载体单酶切连接，现将自己的经验介绍如下：1. 载体单酶切三个小时足以，时间长并不一定好。
2. 如果不需要连接效率的话，可以不用去磷酸化，但载体单酶切纯化后最好马上与你新制备的具相同粘末端的目的片段进行连接反应，也就是说一定要保持单酶切后的载体与目的片段的“新鲜”。
3. 载体和目的片段单酶切后建议直接用柱纯化，我用的promega的柱，回收率很高。
我的目的片段2KB，载体13KB。
4. 连接反应目的片段与载体的摩尔比要高，最好10-20:1，因为单酶切后的载体与目的片段具有相同的粘末端容易出现自连，过量的目的段可以促进两者的反应，有利于出现重组子。
5. 我的单酶切的载体没有去磷酸化，单酶切目的片段也没有磷酸化，4度24小时连接，挑24个单菌落有3个重组子。
分子克隆载通常在基因工程中选作载体的有：①质粒——环状双链小型DNA 分子，种类甚多，有的可在细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。
例如：根瘤土壤杆菌所携带的Ti 质粒常用作植物细胞基因工程的载体。
人工改造的质粒常用的有pBR322天然质粒，派生质粒pmB1，psC101等②噬菌体——常用的是λ噬菌体。
经构建后，常用于细菌细胞。
常见的有Mu噬菌体载体。
③病毒——例如猿猴空泡病毒SV40 常用作动物细胞基因工程的载体。
④粘粒（cosmid,装配性质粒），由质粒和Mu噬菌体的cos位点u或膜等构建而成的一种大容量克隆载2、平末端的连接：可先生成粘性末端，在带平头末端的DNA片段的3’-末端加上多聚核苷酸的尾巴，在载体上加上互补的尾巴，然后用DNA连接酶连接。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
1．理想载体应具备的基本条件(1)必须具有自主复制的能力。
(2)有适宜的限制酶切点，最好对多种限制酶有单一切点。
(3)具有选择性遗传标记。
若有对重组体DNA进行选择的标记，更为理想。
(i)检测载体是否接上了目的基因。
(ii)检测重组体是否进入受体细胞。
(4)载体的分子量应小，可以携带外源DNA的幅度较宽2．载体的种类(1)质粒载体及其改造。
如pBR322（已根据需要改建）有5个独特的酶切位点和2个抗生素耐性基因。
能独立复制。
(2)噬菌体载体及其改造。
易入转移到宿主细胞。
如λ噬菌体改造成charon载体。
这种噬菌体的中央部分不是必需的可以切除。
插入较大的外源DNA片段（2.2×104bp）。
可根据噬菌斑直接判断是否有外源DNA插入，有较强的启动子，能增强外源DNA的表达。
(3)科斯质粒（cosmid）载体，又称粘粒。
是由λDNA和细菌质粒DNA重组而构成的杂种质粒，它有质粒的很多优点，又可包装到噬菌体头部，便于进入宿主细胞。
(4)真核细胞的克隆载体。
(i)SV40 猿猴病毒，小的共价闭合环状DNA分子。
既能整合到染色体上，也能独立自主复制。
由SV40衍生的SVGT-5已成功地应用于猴肾细胞内克隆β-珠蛋白等哺乳动物基因。
(ii)Ti质粒。
根瘤农杆菌的质粒，可以转化植物细胞。
3．DNA片段和载体的连接(1)粘性末端连接连接酶(2)平整末端连接连接酶(3)同聚末端连接在末端转移酶作用下，可以在DNA的3'-OH端合成低聚多核苷酸。
(4)人工接头分子连接人工合成寡聚核苷酸片段应用连接酶把目的基因与合适的载体相连，重新组合的DNA片段称为重组DNA或简称重组体，又称异源嵌合体。
重组体必须引入受体细胞，才能进行增殖表达。
4．重组体导入宿主细胞(1)常用方法a．转化：将重组质粒DNA分子引入到受体细胞称为转化。
b．转染：将重组噬菌体或重组病毒DNA引入受体细胞，这里所用的噬菌体DNA并没有包上它的外壳（transfection）。
c．转导：用噬菌休作载体的方法。
这里所用的噬菌体DNA被包上了它的外壳。
但这是离体包装。
不是感染过程中包上的。
d．注射：如果宿主是比较大的动植物细胞则可用注射方法把重组DNA分子导入。
(2)成功的关键：受体细胞应处于感受态。
即处于最适于摄取和容忍外源DNA的生理状态。
转化率应达到10-7以上。
可采用氯化钙处理受体细胞。
4℃温育。
42℃短时脉冲冲击。
使呈感受态。
先用酶除去细胞壁，形成原生质体后再用CaCl处理。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
实验原理一.重组质粒的构建T质粒载体重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。
连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。
pUCm-T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。
这样，pUCm-T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组载体。
连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。
但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。
因此采取折中的温度，即12-16℃，连接12-16h （过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
二. 感受态制备原理细菌在0°C CaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的感受态。
三. β-半乳糖甘酶显色反应选择法LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。
β—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。
现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有β—半乳糖核苷酶的调控序列和β—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的表达。
另外，常用的大肠杆菌带有β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段），的编码序列。
在各自独立的情况下，这些质粒与大肠杆菌各自编码的β—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。
只有当携带α肽编码信息的克隆载体成功进入宿主细胞，在培养基诱导物IPTG的诱导下，载体质粒能够合成β—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这样就与宿主细胞合成的β—半乳糖核苷酶C端部分序列（β肽段）互补，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。
而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成lacZ 基因不能表达，从而不能合成β—半乳糖核苷酶；而对于空载体，lacZ基因正常表达，通过α互补合成β—半乳糖核苷酶，分解培养基里的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。
编辑本段实验准备清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培养皿，3个小试剂瓶，接种环，涂布棒0.1mol/LCaCl2：取0.11098g氯化钙固体定容至10mlAmp（100mg/ml）：溶解0.1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至1ml，用0.22μm滤膜过滤除菌.编辑本段实验过程（一）.目的基因片段与载体连接器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面离心管架，台式离心机，干式恒温气浴。