植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

〖实验目的〗

1．了解创建烟草突变体库的方法；

2．理解每种方法的基本原理；

3．掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。

获得，生物诱变

内容，

人，

关系，

转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

筛选T2，获突变子，应为3:1分离

确定T-DNA与突变型共分离的个体

产生纯合后代

克隆T-DNA两侧的植物DNA（TailPCR)

利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因

基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）

图实验4-1T-DNA标签克隆基因的基本流程

TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特

T-DNA

草，以

（三）试剂

1.2×CTAB提取液

100mmol/LTris-HClpH8.0

2％（w/v）CTAB

1.4mol/LNaCl

40mmol/Lb-巯基乙醇

20mmol/LEDTA

2.TE缓冲液

10mmol/LTris-HClpH8.0

1mmol/LEDTA

3.50′TAE电极缓冲液1000ml

Tris54g

硼酸27.5g

7.溶液I

9.

摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL5mol/LNaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积

为1升，121℃高压灭菌20分钟。

11.MS基本培养基

大量元素mg/L微量元素mg/L有机营养mg/L

NH4NO31650KI0.83甘氨酸2.0

KNO31900H3BO36.2烟酸0.5

CaCl2·2H2O440MnSO4·4H2O22.3盐酸吡哆醇（Vb6）0.5

MgSO4·7H2O370ZnSO4·7H2O8.6盐酸硫胺素（Vb1）0.l

KH2PO4170NaMoO4·2H2O0.25肌醇100

CoCl2·6H2O0.025

CuSO4·5H2O0.025

FeSO4·7H2O27.8

配制方法

碘化钾44mg；

12.0.6%琼

其中6-BA取25mg用少量1MNaOH溶解后定容到50mL；

NAA取25mg用少量1MNaOH溶解后定容到50mL；

2,4-D取50mg用少量1MNaOH溶解后定容到100mL；

以上激素母液均为0.5mg/mL

13.筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L6-BA＋0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧

苄青霉素

14.抗生素母液的配制

KANA（50mg/mL）1gKANA溶于20mL蒸馏水；

RIF（50mg/mL）0.25gRIF溶于少量乙醇再定容至50mL；

STR（30mg/mL）0.6gSTA溶于20mL蒸馏水；

羧苄青霉素（100mg/mL）2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。

潮霉素B（50mg/mL）可以直接购买

1.70％

酒精中

。将无2.

1.、

RIF、

2.70％

酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用6mm打孔器凿成圆盘。

3.愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的

菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。

4.共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培

养3天。

5.筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素

和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。

Ⅲ转基因烟草的检测

1.剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入0.5mL65℃

2.

3.

（7）弃上清，70%乙醇洗沉淀；

（8）空气干燥，20ml蒸馏水溶解，-20℃贮存。

7.对提出的基因组DNA进行PCR扩增；

引物和扩增体系同上述的PCR步骤；

GFP引物

GFP-F:5’-GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’，