过表达CCR3的人胃癌细胞株的建立

过表达CCR3的人胃癌细胞株的建立

目的建立过表达CCR3人SGC7901胃癌细胞细胞株，为后续CCR3在胃癌转移的研究奠定基础。方法分离正常人外周血单个核细胞，提取总RNA，PCR 扩增CCR3基因CDS序列，连接至质粒pEFP-N1，进行CCR3基因的克隆，构建含有CCR3基因的pEFP-N1-CCR3重组质粒。重组质粒通过脂质体转染法对人SGC7901胃癌细胞进行转染。结果Realtime-PCR及Westernblot证实CCR3基因能够在人SGC7901胃癌细胞中正确表达。结论成功建立稳定表达CCR3基因的SGC7901胃癌细胞株，为研究CCR3在胃癌细胞株转移中的机制奠定了基础。

标签：CCR3；SGC7901细胞；胃癌转移

趋化因子受体（Chemokine receptor）是表达在一些特定的细胞表面的G蛋白偶连的七跨膜域受体[1]。这些受体与细胞外的配体趋化因子结合。与特异的趋化因子结合后，趋化因子受体引发钙离子内流而产生细胞趋化反应，从而诱导细胞到生物体的特定部位。CCR3在胃癌远端迁移上到底扮演什么样的角色也未完全清楚。目前，将外源性CCR3基因转入人胃癌细胞使其过度表达未见报道。本实验尝试构建含有CCR3的重组质粒pEFP-N1-CCR3并转染至人SGC7901胃癌细胞，并检测转染后SGC7901细胞CCR3的表达情况。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1质粒菌株和慢病毒包装细胞pEFP-N1慢病毒穿梭载体，psPAX2和pMD2G包装质粒，大肠杆菌DH5。人SGC7901胃癌细胞，生长培养基为高糖DMEM培养基，含10%胎牛血清。

1.1.2 主要试剂及引物Lipofectine2000转染试剂盒；T4连接酶；质粒抽提试剂盒；限制性内切酶EcoRI和BamHI；胎牛血清；CCR3一抗；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG。

1.2人SGC7901胃癌细胞的培养人SGC7901胃癌细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖的完全培养基中，置于37℃，5%CO2孵育箱中贴壁培养，

0.25%胰酶3d传代换液一次。

1.3 pEFP-N1-CCR3的构建及鉴定

1.3.1 CCR3的CDS序列扩增取健康人外周血，淋巴细胞分离液分离单个核细胞并抽提总总RNA，在Pubmed中的nucleotide上查询CCR3的CDS编码区并设计克隆引物，并在克隆引物中加入BglII和EcoRI酶切位点，用taq聚合酶扩增CCR3的CDS序列，

1.3.2 重组载体构建和鉴定将PCR反应电泳回收产物和pEFP-N1质粒用限制性内切酶BglII和EcoRI 37℃双酶切1h。取5uL酶切好的PCR片段与5uL酶切好的质粒DNA反应液混合并加入T4连接酶及其连接酶缓冲液，4℃连接过夜。将连接产物加入DH5感受态细胞，将转化的DH5感受态细胞涂抹到含100μg/ml Kana 抗性的LB固体培养基上，放置室温至液体吸收，并在37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单克隆菌落并加入含100μg/ml Kana 抗性的LB液体培养基上摇菌过夜，抽提LB液体培养基中的重组质粒，并用BglII和EcoRI限制性内切酶双酶切后行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性菌落送上海生工生物公司进行测序分析，以鉴定pEFP-N1-CCR3质粒中是否正确插入CCR3的CDS片段。

1.4转染CCR3的SGC7901细胞中CCR3表达的检测

1.4.1 Real-Time PCR检测CCR3mRNA表达根据GenBank的人CCR3基因序列，设计荧光定量PCR引物并合成。上游引物序列：5′TGGCATGTGTAAGCTCCTCTC 3′，下游引物序列：5′ CCTGTCGATTGTCAGCAGGATTA 3′，设计并合成内参照β-actin引物，上游引物序列：5′CTCCATCCTGGCCTCGCTGT3′，下游引物序列：5′GCTGTCACCTTCACCGTTCC 3′。在lipofection瞬时转染4d后提取细胞总RNA，逆转录后进行real-time PCR。反应条件：95℃维持10min；95℃15 s、60℃50 s；共35个循环。各组mRNA同内参基因相比得到相对表达量。

1.4.2 Western blotting检测CCR3蛋白表达lipofection转染4d后，用细胞裂解液裂解细胞提取蛋白。用蛋白浓度测定试剂盒调整各组蛋白浓度后并加入蛋白上样缓冲液，95℃变性5 min再进行PAGE蛋白电泳。将转移蛋白的PVDF膜用脱脂奶粉封闭0.5h，分别加入CCR3和β-actin一抗4℃孵育过夜。次日用1×TBST 洗膜3次，5min/次，充分洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，室温孵育0.5h，用1×TBST洗膜3次，最后加入定影液和显影液，在Bio-Rad成像仪上显影。

2 结果

2.1 CCR3基因的提取与鉴定根据GenBank的CCR3基因编码区（CDS）设计相应引物，PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，可见1067bp的特异条带，与GenBank一致。

2.2 重组pEFP-N1-CCR3质粒的筛选和鉴定挑取LB固体培养基阳性克隆菌摇菌并抽提质粒进行测序，发现与GenBank中CCR3基因序列比对完全正确，无任何碱基突变。

2.3 Real Time PCR检测mRNA结果CCR3-人SGC7901胃癌细胞组CCR3mRNA表达量明显高于GFP-人SGC7901胃癌细胞组，差异有统计学意义（P=0.0084）。

2.4 Western blotting检测蛋白表达两组均在约55kDa（CCR3）、42kDa （β-actin）处见到特异性条带，发现CCR3-SGC7901组条带颜色相比GFP-SGC7901组颜色明显较深（圖6）。经过分析，显示CCR3-SGC7901组转染的细胞中CCR3蛋白表达量明显升高，表明CCR3可以正确在SGC7901细胞中表达。

3 讨论

通过慢病毒pEFP-N1穿梭载体，将CCR3和GFP基因融合表达在一起，这将有利于转染后对目标细胞进行示踪研究，达到GFP和CCR3的融合表达。为了验证所构建重组质粒pEFP-N1-CCR3的活性，本实验成功构建了人CCR3和GFP基因融合表达的重组质粒pEFP-N1-CCR3，具有良好的表达活性，并且能够在人SGC7901胃癌细胞正确表达。