腺病毒载体构建精品PPT课件
合集下载
腺病毒ppt课件
20
疑似病例的诊断标准
1、发病前8天内与腺病毒感染确诊病例有过密切接触史，并出现发热、干咳等临床 症状
2、发病前8天内曾到过腺病毒感染流行地区，并出现发热、干咳等临床症状
疑似病例需进行医学隔离，隔离期一般为一周
21
发热、咳嗽不一定是腺病毒感染
发热、咳嗽是最常见的上呼吸道感染症状，引起发热咳嗽的病因有很多，如病毒、 细菌、支原体、衣原体、真菌等感染均可导致发热、咳嗽，因此出现这两种症状 并非就是腺病毒感染，不必草木皆兵
16
个人预防
1.了解防控知识，正确认识疾病，提高防范意识 2.尽量避免到人群聚集性场所，避免接触流感症状的患者 3.注意日常个人卫生，养成良好的卫生习惯 4.注意防寒保暖，提高免疫力 5.一旦出现发热、咳嗽、咽痛等异常症状，应及时报告班、排长，在采取有效防护
措施的情况下及时到卫生队就诊；
具体措施
5
什么是55型腺病毒 55型腺病毒是一种由人11型与14型腺病毒重组产生的新型病毒，与其他可导 致急性呼吸系统疾病的流感病毒类似。 55型腺病毒感染可导致上呼吸道感染和腺病毒肺炎，少数可发展为重症肺炎。
2012年2月，对于网络谣传的河北保定解放军252医院出现非典变异病毒的消息，卫生 部官方消息辟谣，排除是SARS ，确诊为腺病毒55型感染者
8
什么季节容易感染腺病毒 1、冬春季节气温较低，病毒存活时间更长 2、冬季人群常在室内聚集活动，居所大多通风不佳，易于病毒传播
冬春季容易出现腺病毒感染的暴发流行
9
典型临床表现
发症热状、明干显咳的、患咽者痛张等开上嘴呼便吸可道发感现染咽症部状“为一主片，红部”分，伴俗有称头为痛“、血乏盆力大、口恶”心这、 食是欲病缺毒乏侵等犯不咽适部感导，致大的便充每血天反2-应4次，，部呈分稀患水者样扁或桃糊体状会。增大，并可见白色分泌物。
腺病毒载体工艺平台介绍(PPT37张)
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2019/4/11
基因药物研发中心
14
新药申报三方面研究内容 • 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
2019/4/11
基因药物研发中心
15
药学研究主要内容 • • • • • • • 上游构建及鉴定 细胞/毒种研究及三级库建立 原液工艺研究 制剂工艺研究 检测方法及质量标准研究 稳定性研究 试制三批样品
2019/4/11
基因药物研发中心
11
管理制度 • 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
2019/4/11
基因药物研发中心
12
研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。 • 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。 • 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。 • 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
20211122?基因药物研发中心研发中心已完成申报临床所需药学研究的品种品种代号研究单位研究时间治疗性重组hbv腺病毒疫2004年3月至2005年11月治疗性hiv腺病毒载体疫苗h302005年12月至2007年8月治疗性重组腺病毒eb病毒潜伏膜抗原疫苗lmp2cdc病毒病所委托源兴承担药学研究2007年9月至2008年10月20211122?基因药物研发中心新药申报三方面研究内容安全评价20211122?基因药物研发中心药学研究主要内容试制三批样品20211122?基因药物研发中心细胞及毒种研究毒种检定代次及遗传稳定性研究20211122?基因药物研发中心建细胞库原始细胞细胞来源于atcc主细胞库质量控制工作细胞库质量控制细胞扩增细胞扩增20211122?基因药物研发中心工作种子批病毒扩增原始种子批主种子批鉴定检病毒扩增20211122?基因药物研发中心原液工艺流程参数及技术指标sepharosefastflow分子筛层析回收率3批平均重组腺病毒种子罐收获物超滤浓缩液source30q阴离子交换柱层析层析收集液6000rpm离心20min500k膜超滤浓缩10倍细胞种子细胞罐扩增5l罐细胞培养病毒扩增
【医学ppt课件】腺病毒
亦可用直接或间接免疫荧光方法，检测临床诊断疑 为腺病毒肺炎的婴幼儿鼻咽部脱落细胞中的腺病毒抗原。
➢血清学诊断
采取患者早期和恢复期双份血清做CF试验、HI试验 及NT试验。恢复期血清抗体滴度比早期增长4倍以上有诊 断意义。其中CF试验最为疫苗和 减毒活疫苗。但因腺病毒对新生地鼠有致癌作 用，人们对于疫苗的作用难免有疑虑。最近有 人研制腺病毒衣壳亚单位疫苗，可解决疫苗的 安全性问题。
➢抵抗力
腺病毒对理化因素的抵抗力较强，耐酸并能耐 受蛋白酶及胆汁的作用。在室温中可存活10d 以上，56℃30min灭活。
➢致病性
致病性和免疫性
腺病毒经呼吸道、消化道或眼结膜侵入人体，在扁 桃体、增殖腺、肠系膜淋巴结等局部淋巴组织中增殖， 不形成病毒血症。
腺病毒主要感染儿童，大多无症状。相关的临床病 症主要是小儿急性咽炎、急性呼吸道感染和病毒性肺炎 等。 某些型别腺病毒可引起婴儿腹泻，称肠道腺病毒。 此外，还能导致其它一些临床疾病，如小儿的急性出血 性膀胱炎。
纤维状刺突 (antennal fiber,or fiber)：
纤突对哺乳类动物的细胞有毒性作用。腺 病毒具有血凝性。
共同抗原：CF 特异性抗原： NT/HI
➢培养特性：
生物学性状
人类腺病毒无敏感动物，也不能在鸡胚中生长。 但能在来源于人的多种细胞培养中增殖，引起 明显CPE：细胞肿胀变圆、集聚成葡萄串状， 并可在感染的细胞核内形成嗜碱性包涵体。
其中腺病毒肺炎是我国北方儿童的一种常见病， 1958年曾有过大流行。A组腺病毒在体外具有转化细胞的 性质，并能对新生地鼠致癌。但迄今尚未见在人体致癌 的报告。
致病性和免疫性
➢免疫性
腺病毒感染后，产生特异性抗体，对同 型病毒的感染有保护作用，免疫力持久。
➢血清学诊断
采取患者早期和恢复期双份血清做CF试验、HI试验 及NT试验。恢复期血清抗体滴度比早期增长4倍以上有诊 断意义。其中CF试验最为疫苗和 减毒活疫苗。但因腺病毒对新生地鼠有致癌作 用，人们对于疫苗的作用难免有疑虑。最近有 人研制腺病毒衣壳亚单位疫苗，可解决疫苗的 安全性问题。
➢抵抗力
腺病毒对理化因素的抵抗力较强，耐酸并能耐 受蛋白酶及胆汁的作用。在室温中可存活10d 以上，56℃30min灭活。
➢致病性
致病性和免疫性
腺病毒经呼吸道、消化道或眼结膜侵入人体，在扁 桃体、增殖腺、肠系膜淋巴结等局部淋巴组织中增殖， 不形成病毒血症。
腺病毒主要感染儿童，大多无症状。相关的临床病 症主要是小儿急性咽炎、急性呼吸道感染和病毒性肺炎 等。 某些型别腺病毒可引起婴儿腹泻，称肠道腺病毒。 此外，还能导致其它一些临床疾病，如小儿的急性出血 性膀胱炎。
纤维状刺突 (antennal fiber,or fiber)：
纤突对哺乳类动物的细胞有毒性作用。腺 病毒具有血凝性。
共同抗原：CF 特异性抗原： NT/HI
➢培养特性：
生物学性状
人类腺病毒无敏感动物，也不能在鸡胚中生长。 但能在来源于人的多种细胞培养中增殖，引起 明显CPE：细胞肿胀变圆、集聚成葡萄串状， 并可在感染的细胞核内形成嗜碱性包涵体。
其中腺病毒肺炎是我国北方儿童的一种常见病， 1958年曾有过大流行。A组腺病毒在体外具有转化细胞的 性质，并能对新生地鼠致癌。但迄今尚未见在人体致癌 的报告。
致病性和免疫性
➢免疫性
腺病毒感染后，产生特异性抗体，对同 型病毒的感染有保护作用，免疫力持久。
Get格雅 重组腺病毒理论 ppt课件
An ideal gene delivery should include:
Protecting DNA against nuclease degradation; Transporting DNA to the target cells; Facilitating transport of DNA across the plasma membrane; Promoting the import of DNA into the nucleus.
In vivo gene transfer for ocular diseases. A. An aAAV) vector is injected into the subretinal space using a surgical procedure. B. Gene transfer of RPE-65 (色素表皮细胞特异的65kDa蛋白)to the retina restored light sensitivity in patients with Leber's congenital amaurosis (LCA) (from Proc Natl Acad Sci USA 105(39):15112-7,2021. C. A similar protocol for AAV-mediated Lopsin corrected color blindness in squirrel monkeys.
DNA: large molecular weight; Sensitive to nucleases
The key problem remains gene delivery
DNA entering to cell, three major obstacles
腺病毒载体构建-文档资料
2021/4/21
3
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞
基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
2021/4/21
9
几种病毒载体的区别
2021/4/21
10
2021/4/21
11
7
2021/4/21
8
AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染 性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
E2蛋白涉及AdDNA复制
E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统
E4蛋白调节有效的晚期基因转录
2021/4/21
4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广 泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）
〖医学〗重组腺病毒载体的构建
BTEB2简介
基本转录元件结合蛋白2－转录因子 功能：促进VSMC增殖和表型转化
外源性基因的制备
VSMC中提取总RNA RT－PCR得到BTEB2 cDNA 体会：从目的基因丰度高的组织或细胞
中提取。
重组穿梭质粒的构建－－将 PCR产物克隆到穿梭质粒
用BamH I 和 EcoR I 双酶切穿梭质粒 pDC315及BTEB2 cDNA
用T4连接酶将BTEB2 cDNA反向连接到 穿梭质粒 定向克隆
体会：设计引物时引入需要的酶切位点 可使基因定向克隆的程序简化
重组穿梭质粒的鉴定
酶切鉴定：用BamH I 和 EcoR I 双酶切 重组穿梭质粒pDC315ASBTET2，电泳
目的片段测序
重组腺病毒的制备
脂质体介导重组穿梭质粒和腺病毒基因组质粒 共转染293细胞
腺病毒载体的包装细胞
HEK293细胞的培养 高糖型DMEM 10%FBS（构建），10%NBS（扩增）
HEK293细胞的传代次数与腺病毒载体构 建和扩增 构建：＜20代－－构建成功的关键 扩增：无特殊要求
重组原理
重组腺病毒载体构建
以反义BTEB2腺病毒表达载体为例 介绍重组腺病毒载体的构建过程
重组腺病毒的鉴定
病变293细胞于液氮、37°C反复冻融， 离心
取上清提取重组病毒DNA 用目的片段引物和病毒基因组特征片段
引物作PCR
病毒滴度测定
24孔培养板每孔接种1×105个293细胞 培养24小时后，取病毒转染液0.2ml加
PBS至总量2ml，混匀后作10倍比稀释至 第8管，每孔加入不同稀释度的病毒液 0.2ml。 37°C 5%CO2培养1小时后，每孔补加 1.5ml培养液，继续培养36－48小时
腺病毒载体的构建
腺病毒载体的构建第四章SOCS2腺病毒载体的构建 1腺病毒载体的构建由第三章结果可知，基础状态下SOCS2在脂肪细胞中的表达⽔平较低，但是GH 可以诱导SOCS2稳定⾼表达。
SOCS2⾼表达的同时，GH诱导的脂肪细胞分化因⼦和脂质代谢基因表达发⽣了变化。
为了研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响，需要通过⼀种途径实现SOCS2在脂肪细胞中持续⾼表达。
细胞导⼊外源基因是⽬前常⽤的⽅法，但是保证外源基因的⾼效表达需要合适的表达系统。
⽬前常⽤的有质粒、逆转录病毒、蔓病毒、腺病毒等外源基因表达系统。
质粒载体可以导⼊外源基因，但是质粒的转染效率很低，如何把⽬标基因导⼊靶细胞转录产物是质粒系统的最主要的问题。
逆转录病毒可以把⽬标基因整合到靶细胞基因组永久表达，但是逆转录病毒只能感染增殖期的细胞。
蔓病毒本⾝对脂肪细胞的感染率⼜⽐较低。
⽽腺病毒滴度⾼，适合外源基因⼤量表达，并且可插⼊较⼤的⽬的⽚段，对细胞类型限制较⼩，可感染⾮分裂期的细胞(V orburger SA and Hunt KK 2002)。
另外腺病毒载体系统中pAdEasy系统操作⽐较简单(Luo JY et al. 2007)。
本章克隆SOCS2基因，采⽤pAdEasy系统构建pAd-SOCS2载体，为SOCS2在脂肪细胞中⾼效表达，研究SOCS2对GH调控脂肪细胞分化与脂质代谢的影响奠定基础。
4.1材料4.1.1 样品、菌株、质粒及细胞株脂肪组织取⾃6周龄昆⽩⼩⿏，⼩⿏购⾃第四军医⼤；E.coli DH5α菌株由本实验室保存；pAdTrack-CMV和pAdEasy-1质粒，E.coli BJ5183菌株由猪脂肪沉积与肌⾁发育实验室赠送；⼈胚肾细胞株HEK293购于中国科学研究院上海细胞资源中⼼。
4.1.2 主要试剂限制性内切酶BglⅡ、XhoⅠ和蛋⽩Marker购⾃Fermentas公司；内切酶PmeI和PacI购⾃NEB公司；pMD TM18-T克隆载体、碱性磷酸酶CIPA购⾃Takara公司；穿梭质粒⼩提试剂盒购⾃Omega公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购⾃Bioflux公司；λ/Hin dIII Marker购⾃天根公司；OptiMem优化培养液购⾃Gibico公司；脂质体Lipofectamine TM 2000购⾃Invitrogen公司。
医学：重组腺病毒载体的构建
02
重组腺病毒载体的构建涉及多个步骤，包括选择合适的腺 病毒血清型、设计外源基因的插入位点、构建重组质粒、 转染腺病毒生产细胞等。这些步骤需要精确的操作和严格 的质量控制，以确保重组腺病毒载体的安全性和有效性。
03
重组腺病毒载体的构建过程中，需要注意选择适当的腺病 毒血清型，以确保与宿主细胞的良好亲和力和低免疫原性 。同时，需要对外源基因进行适当的修饰和优化，以提高 其在重组腺病毒载体中的表达效率和稳定性。
医学重组腺病毒载体的构建
目录
• 重组腺病毒载体概述 • 重组腺病毒载体的构建过程 • 重组腺病毒载体的应用研究 • 重组腺病毒载体的安全性及挑战 • 参考文献
01 重组腺病毒载体概述
腺病毒的特点
01
02
03
宿主范围广
腺病毒对多种细胞类型具 有感染能力，包括人体细 胞。
基因容量大
腺病毒载体可以携带较大 的基因片段，适合用于基 因治疗和疫苗研发。
02 重组腺病毒载体的构建过 程
目的基因的获取与。
目的基因的处理
对目的基因进行限制性酶切、修饰、 纯化等处理，以便于后续的克隆和鉴 定。
载体的选择与处理
载体的选择
根据实验需求选择适合的载体，如腺病毒载体、质粒载体等。
载体的处理
重组腺病毒载体的构建过程简介
选择合适的腺病毒血清型
根据应用需求选择对特定细胞类型感染力强、 免疫原性弱的腺病毒血清型。
构建重组质粒
将目的基因插入腺病毒载体的转移质粒中， 形成重组质粒。
转染与筛选
将重组质粒转染进包装细胞，筛选出能够产 生重组腺病毒的细胞克隆。
病毒扩增与纯化
在筛选出的细胞克隆中扩增重组腺病毒，并 进行纯化和浓缩。
病毒载体PPT课件
33
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
32
第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
13
病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
• 而且，这些新技术也带来新的问题，主要是由辅 助病毒污染及载体的不稳定性所引起。
• 构建载体的一个因素是需要维持载体的正常大小 才能完成有效地DNA的包装。这个问题可以通过 “填充”DNA来完成，尽管这些填充DNA片段的 性能可以影响转基因的表达。
• 已经明确E4基因的部分保留有利于宿主细胞战胜 T细胞免疫反应从而有利于病毒生存，因此改造载 体时可以保留部分E4基因。
• 外源基因的容量增加了：14kb • 外源基因的表达时间比第一代病毒载体有所延长，
但仍然不能长期持续表达。 • 宿主的免疫反应仍然是影响外源基因持久表达的
主要障碍，特别是在发生重复感染的时候这种作 用尤其明显。
32
第三代重组腺病毒载体
第三代腺病毒载体的构建是将病毒的其他基因全部或接 近全部删除。这就是所谓的“空肠病毒”载体，它仅保留了 ITR和包装信号序列，因此需要辅助病毒和适当的包装细胞 用于病毒的繁殖，病毒的获得需要仔细的纯化。
生化中学习过核苷酸密码子，AAA编码 赖氨酸
AAA
lysine
7
1972年Berg等在一系列的研究中发展了第一 种建立在SV40基础上的重组病毒载体，并将λ噬 菌体部分DNA片段和大肠杆菌半乳糖操纵子连接 到 SV40 DNA中。
1976年，带有λ噬菌体DNA的重组SV40载体 在猴肾体用于基因治疗有以下优点： • 转移效率较高 • 在转化的细胞中将外源基因整合到染色体上或作
为染色体外的遗传物质进行表达，两种途径可供 选择 • 有可能将外源治疗基因置于病毒调节信号的控制 下进行表达 • 能够将外源基因作为病毒微染色体的一部分，并 能进行分离
13
病毒载体作为基因治疗的工具存在的问题： 尽管病毒载体介导的基因转移在临床上已经取
腺病毒载体构建(共10张PPT)
第二第页二页，，共共101页0。页。
பைடு நூலகம்
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通过 受体介导的内吞作用进入(jìnrù)细胞内，然后腺病毒基 因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入 (jìnrù)宿主细胞基因组中.
第三第页三页，，共共101页0。页。
腺病毒的基因(jīyīn)及其功能
二早期、表小达的的穿E梭1区质蛋粒腺白，（病其甚带至毒有包括基目E的2因区基蛋因组白的编）表是达码腺盒病数以毒及十基(因y个ǐ组jí)复表腺制达、病盒病两毒毒侧包的的装与和结大其构质他蛋粒和白上表功的达目能翻的译蛋基所因必白拟须，插的，入分但部其位为对同细早源胞序期毒列性表（(dú左达x右ìn和ɡ臂)也）晚是很期强表的。达。
二、小的穿梭质粒，其带有 目的基因的表达盒以及(yǐjí) 表达盒两侧的与大质粒上的 目的基因拟插入部位同源序 列（左右臂）
第第七七页页，，共共1100页页。。
第八第八页页，，共共110页0页。 。
AdEasy腺病毒载体(zàitǐ)系统
稳定性 高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
体内表达周期可早达期4表周。达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的 载体。 表达。
体内表达周期可达4周。
它 组 早期通中表.过达受的必体E须1介区早的导蛋期，的白表但（内达甚其吞的至作对包E用细1括进区胞E入2蛋毒区(j白性蛋ìnr白（(ùd)）ú甚细是x胞至ì腺n内包ɡ病)，括也毒然E基是后2因很区腺组强蛋病复的白制毒。、）基病因是毒组腺包转病装移毒和至其基细他因胞蛋组核白复内表制达，翻、保译病持所在毒必染包须色装的体和，外但其，其他不对蛋细整白胞合表毒进性达入(d(翻júìn译xrìùn所)ɡ宿)也主是细很胞强基的因。
பைடு நூலகம்
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它通过 受体介导的内吞作用进入(jìnrù)细胞内，然后腺病毒基 因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入 (jìnrù)宿主细胞基因组中.
第三第页三页，，共共101页0。页。
腺病毒的基因(jīyīn)及其功能
二早期、表小达的的穿E梭1区质蛋粒腺白，（病其甚带至毒有包括基目E的2因区基蛋因组白的编）表是达码腺盒病数以毒及十基(因y个ǐ组jí)复表腺制达、病盒病两毒毒侧包的的装与和结大其构质他蛋粒和白上表功的达目能翻的译蛋基所因必白拟须，插的，入分但部其位为对同细早源胞序期毒列性表（(dú左达x右ìn和ɡ臂)也）晚是很期强表的。达。
二、小的穿梭质粒，其带有 目的基因的表达盒以及(yǐjí) 表达盒两侧的与大质粒上的 目的基因拟插入部位同源序 列（左右臂）
第第七七页页，，共共1100页页。。
第八第八页页，，共共110页0页。 。
AdEasy腺病毒载体(zàitǐ)系统
稳定性 高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
体内表达周期可早达期4表周。达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的 载体。 表达。
体内表达周期可达4周。
它 组 早期通中表.过达受的必体E须1介区早的导蛋期，的白表但（内达甚其吞的至作对包E用细1括进区胞E入2蛋毒区(j白性蛋ìnr白（(ùd)）ú甚细是x胞至ì腺n内包ɡ病)，括也毒然E基是后2因很区腺组强蛋病复的白制毒。、）基病因是毒组腺包转病装移毒和至其基细他因胞蛋组核白复内表制达，翻、保译病持所在毒必染包须色装的体和，外但其，其他不对蛋细整白胞合表毒进性达入(d(翻júìn译xrìùn所)ɡ宿)也主是细很胞强基的因。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
无，病毒基因组游 有，病毒基因组整 有
离于宿主基因组之 合到宿主基因组，
外，瞬时表达外源 长时间、稳定表达
基因
外源基因
高水平表达
中
中
快（1-2天）
慢（2-4天）
快（1-2天）
分裂和不分裂细胞 1012
分裂和不分裂细胞，分裂cell，但在干 适用于难转染细胞 细胞中表达效率低
109
109
不可以
TET-ON,TET-OFF
1
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分 离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微 米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感 染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到 细胞核。
• 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具 有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感 冒症状、呼吸系统不适等。
2
腺病毒 是一种大分子线性双链无包膜DNA病毒。它 通过 受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病 毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整 合进入宿主细胞基因组中.
第二代腺病毒载体：一般将E2A或E4基因缺失的腺病毒载体成为二代
载体。产生的免疫反应较弱，其安全性和载体容 量有所改进，但病毒包装难度和出毒滴度下降厉 害，应用局限。
第三代腺病毒载体：缺失了全部的（无病毒载体等）或大部分腺病毒
基因，仅保留ITR和包装信号序列。这一载体系 统需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒。
5
腺病毒载体大多以5型（Ad5）、2型（Ad2）为基础
重组系统由2种质粒 构成：一、包含全 部（或右侧大部分） 腺病毒基因组DNA 的大质粒，即骨架 质粒
6
二、小的穿梭质粒，其带有
目的基因的表达盒以及表达
盒两侧的与大质粒上的目的
基因拟插入部位同源序列
（左右臂）
7
8
AdEasy腺病毒载体系统
稳定 性高
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在 连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范 可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广ห้องสมุดไป่ตู้
于分裂状态的细胞。
感染 性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可 以 在呼吸道内繁殖。
包装容量 改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb， 大 腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
3
腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚 期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并 且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒 包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
安全性好 无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞 基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小。
9
病毒基因组组成 载体容量 基因整合功能
表达丰度 表达时间 感染细胞类型 滴度U/ml 四环素诱导系统 毒性作用
腺病毒表达系统 慢病毒表达系统
逆转录病毒
双链DNA <8kb
单链RNA <8kb
单链DNA <6kb
不可以
细胞毒性
遗传毒性
遗传毒性
10
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
11
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
Learning Is To Achieve A Certain Goal And Work Hard, Is A Process To Overcome Various Difficulties For A Goal
E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
4
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较 强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用， 体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广 泛 ，一般常用Ad5型腺病毒）