植物酯酶提取工艺
酶抑制法快速检测蔬菜中有机磷农药残留
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江苏农 业科 学 ２ ０ ０ ６年第 ５期
在 １ ｉ 则基 本达 到稳 定 （ ９ 。 因此 ， 定 最 ０ｒｎ后 ａ 图 ） 确
出限为 ０ １ ｇｍ 。样品提取过程 中， ．３ ／ ｌ 分别采用加 入 １％的甲醇 、 ０ 乙醇和丙酮溶液 ， 结果显示（ １ ） 图 １ 有机溶剂 的加入 可有效提高农药 的提取效率 ， ３种 有机溶剂差异不是很 明显 ， 乙醇的提取液的 回收 但 率要略高于其他 ２ 种溶剂 ， 因此 ， 提取液确定为含有 １％乙醇的０ １ ｏ Ｌｐ ０ ． ｍ ｌ Ｈ值 ６５的磷酸缓冲液。 ／ ．
中植物酯酶活性 ， 优化 了植物酯酶提取条件 。同时系统地研究 了酶促反应条件 ， 建立 了酶抑制法快 速检测蔬菜 中 有机磷农 药残 留的方法 研究结果表 明， 以绿豆中提取的粗酶酶活最高 ， 提取条件 为 ： ０ １ｍ ｌＬｐ 以 ． ｏ Ｈ值 ６ ２的 ／ ． 磷酸缓冲液为提取剂 ， 按固液 比 １： （ Ｖ） 料 ， ４ ５ ｗ／ 加 在 Ｏ℃搅 拌 ２ ｉ， 滤。最佳 酶促 反应条 件为 ： ０ｒ ｎ 过 ａ 反应 体系 ０ １ｍ ＬＬｐ ． ０／ Ｈ值 ６０磷 酸缓 冲液 、 ． 反应时 间 １ ｉ、 ５ｒｎ 反应温度 ４ 显色时 间 １ ｉ、 ａ ０ｃ Ｃ、 ０ｒ ｎ 测定波长 ５０ｎ ａ ２ ｍ处吸收峰 值； 样品提取用 含 １ ％乙醇的 ０ １ｍ ｌＬｐ ０ ． ｏ Ｈ值 ６ ４的磷酸缓 冲液 超声 波振荡 １ ｉ； ／ ． ０ｒ ｎ 方法 的 回收率 为 ８ ． ％ ａ ６７
端 。近几年发展起来的酶抑制法具有 方法 简单 、 快 速、 适合现场检测和粗筛等优点 ， 但现行国标中采用 的乙酰胆碱酯酶价格较高。有报道采用植物酯酶替 代 乙酰胆碱酯酶 ， 由于植物酯酶酶源不同 ， 但 不同植 物对有机磷农药的敏感性 差异较大 ， 以筛选活性 所 高、 敏感性好 、 高效价廉的植物酯酶 ， 优化检测条件 ，
植物组织中脂肪的检测方法
植物组织中脂肪的检测方法
植物组织中脂肪含量的检测是研究植物营养和生理过程的重要手段之一。
准确测定植物组织中脂肪的含量可以帮助我们了解植物的能量储存和代谢过程。
以下是一些常用的植物组织中脂肪的检测方法：
1. 溶剂提取法：这是一种常见的脂肪提取方法，利用有机溶剂（如正己烷、乙醚等）将脂肪从植物组织中提取出来。
首先，将植物组织样品切碎并加入溶剂中，然后反复摇晃或搅拌，使脂肪溶解在溶剂中。
最后，通过离心将溶剂中的脂肪分离出来并干燥，得到脂肪含量的测定结果。
2. 比色法：这是一种常用的脂肪含量测定方法，可以利用底物在酶的作用下产生的色素与脂肪的含量成正比，实现对脂肪的定量测定。
常见的比色法包括乙酰丙酸酯酶法、甘油酸酯酶法等。
3. 气相色谱法：这是一种高效、准确的脂肪分析方法，常用于分析复杂的脂肪组分。
通过将植物组织样品中的脂肪转化为甲酯化脂肪酸，再通过气相色谱仪分析样品中各脂肪酸的含量和种类。
4. 超声波法：超声波法可以快速有效地破碎植物细胞膜，释放其中的脂肪。
该方法可以在不需要显微操作的条件下，提取植物组织中的脂肪，并利用其他方法进行后续的脂肪含量测定。
总结起来，植物组织中脂肪的检测方法主要包括溶剂提取法、比色法、气相色谱法和超声波法。
选择适合自己研究目的和样品特性的方法，能够准确测定植物组织中脂肪的含量，为进一步研究提供重要的数据基础。
常用酶制剂的生产方法
常用酶制剂的生产方法引言：酶是生物体内一类高效催化剂，具有高效催化、高度特异性和温和条件下反应等特点。
其广泛应用于医药、食品工业、环境保护等领域。
本文将讨论常用酶制剂的生产方法。
一、酶的筛选酶的筛选是酶制剂生产过程中的关键步骤。
常用的筛选方法包括传统筛选、分子筛选和基因工程筛选。
1.传统筛选：传统筛选基于酶催化反应产物的定量或定性分析。
通过观察反应产物的形成情况，筛选出具有高催化活性的酶。
传统筛选方法常用于挑选一些常见酶制剂，如蛋白酶、淀粉酶等。
2.分子筛选：分子筛选基于酶底物和产物的结合力。
通过制备一系列结构类似的化合物，分析它们与酶的结合力，从中选择出对目标底物具有高结合力的分子。
分子筛选常用于筛选特定底物的酶制剂，如酯酶、脱氢酶等。
3.基因工程筛选：基因工程筛选基于对酶基因进行改造，通过体外酶活性的分析来筛选出符合要求的酶制剂。
常见的基因工程筛选方法包括突变筛选、重组融合和高通量筛选。
二、酶的提取和纯化酶的提取和纯化是酶制剂生产的重要步骤，常用的方法包括固液分离、沉淀、超滤等。
1.固液分离：固液分离是将酶从固态生物质或液态培养基中分离出来的过程。
常见的固液分离方法包括离心、过滤和压滤等。
该方法适用于酶制剂生产中的初步提取。
2.沉淀：通过添加盐类或有机溶剂，使酶沉淀成块，然后通过离心或过滤将其分离出来。
此方法可用于酶的粗提和初步分离。
3.超滤：超滤是一种利用超过膜孔大小的压力将溶液中的大分子物质与溶剂分离的方法。
通过选择合适的膜孔大小，可将酶和低分子物质分离开来，达到酶的纯化目的。
三、酶的固定化酶的固定化是将酶以固定形式嵌入在载体上，提高其稳定性和循环使用性能。
常用的固定化方法包括吸附、交联和包埋等。
1.吸附：酶通过静电作用、吸附剂（如硅胶、活性炭等）的架桥作用，被吸附在载体表面。
吸附方法简单易行，适用于大分子酶制剂。
2.交联：酶通过与载体交联剂的共价结合，被固定在载体上。
交联固定化技术可以提高酶制剂的稳定性和催化效率。
复合磷酸酯酶两种提取工艺的比较
押权优先效力 的体现 。但抵押权人欲实现其抵 押权的优 先效力必须 满足两个 条件 ： 一是抵 押 权 有效成 立 ，若 为无 效之 抵押权 ，则 不得 实 行 ；二是债权 已届清偿期而未受清偿 ，即抵 押 权优 先效力 的实行不仅以债权的有效存 在为前 提 ，并且须有债务人给付迟延之事实方可。所 谓 给付迟延是指债务 已届履行期而 未为给付 。 倘 债权尚未届清偿期 ，则不得实行抵 押权的优 先效力 。即便 已届清偿期 ，而债务人如期清偿 者 ，则抵押权归 于消灭 ，故无实行抵押权优 先 效 力的可能 。因此 ，行使抵押权优先效力以给 付 迟 延 为必 要 条 件 。 ３ ． ２抵押权优先效力的实行方法 根据 《 担保 法》 第 ５ ３条第 １款之 规定 ， 债务履行期届满 ，抵押权人未受清偿 的 ，可 以 于抵 押人协议 以抵押物折价。抵押权人欲以抵 押 物折价 ，必须依据 其与抵押人之 间的协议 。 所谓 以抵押物折价 ，是指 以抵押权人所应受清 偿 的债权额作为价款之一部或全部，以取得抵 押物的所有权 。这是抵押权优先效力得 以实现
的。
２４损 害赔 偿金 。 它是 有代 替 给付 的性 ． 质 ，如果不包括在抵押权优先效力范 围内，实 难保护债权人 的利益。与违约金一样 ，损 害赔 偿金在办理抵押登记时无须登记 ，当然属 于抵 押权优先效力范围 。 ２５实现抵押权 的费用 。抵 押权人因为行 ． 使抵押权而 支出的费用 ，应 当由债务 人负担 ， 并受抵押担保的保障。实行 抵押权 的费用 ，包 括拍卖、变 价抵押物所必须支出的费用 ，即申 请费用，拍卖费用等。抵押权人若依照诉讼程 序请求法 院拍卖或变价抵押物的 ，法 院因强制 执行 而支 出的全部费用 ，应当由抵押物优先受 偿 ；抵押权人 以诉讼外的方法变价抵押物而支 出的费用 ，因为直接产生于抵押权 的行使 ，应 当由抵押物 的变价款优先受偿。因此 ，实 现抵 押权 的费用也应当在抵押 权优先效力范 围。 ２ 保 法》 在 规定 了以上 五种 抵押担 ． ６ 保的范 围外 ，另据意思 自治的原则 ，允许 当事 人在合 同中经合意所约定 的抵押物 应担保 的范 围 ，如债权人为实现其债 权而委托代理人 的代 理费用、公证费用等。 ３抵押权优先效力的实现 ３１ ．抵押权优先效力的实行条件 当债务履 行期届满 而抵押 权人未 受清偿 时 ，抵押权人可就抵押物优先受偿 ，这就是抵
脂肪酶的提取与分离纯化
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3.2.1 ATPS系统的选择
连接带长度的影响 ：
研究了不同的连接带长度在体积比维持在1左右时PEG/NA2HPO4系统的影响 。表3A代表在各自系统不同连接带长度下的脂肪酶分配情况。在MTCC5695脂 肪酶最大脂肪酶回收率为85.95％的情况下，高纯化因子为4.51，比活力为 4024.56U / mg，TLL为41.24％。超过41.24％，MTCC5695的脂肪酶产量下 降，从85.95％降至57.43％。 在任何一种情况下，分离更倾向于底相。 随着两 相成分组分的浓度增加，两相的自由体积减小。
金属离子
组特异 性试剂
修饰剂 温度
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3.1 MTCC5695脂肪酶活力的影响因素
PH
MTCC5695脂肪酶显示在pH值10.8的最佳活性表明它是碱性的。
PH值在7.0-12.0之间时酶呈现了稳定性。在强酸性环境下，活动完全丧失
了活性，pH值为6.0时，酶活性很弱。
温度
MTCC5695脂肪酶活性的最佳温度是40度。脂肪酶在30-70摄氏
最适宜的系统是磷酸氢二钠系统，其中恢复率为61.87%的脂肪酶具有特 异性活性417.43U/mg和净化因子2.62。对细胞内甘油醛-3-磷酸脱氢酶和小 麦面粉的植物酯酶被ATPS提取和纯化效果不错，净化因子(PF)为18.46倍，产 量为83.16%。
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3.2.1 ATPS系统的选择
相形成高聚物的影响
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3.2.2 双水相萃取技术的分离与超滤
底相的超滤作用下使得磷酸钠与MTCC5695脂肪酶分 离，从而将纯化因子从4.12提高到5.99，酶的回收率为 82.09%。纯度的增加可以归因于通过膜和磷酸钠进行的 污染物蛋白的渗透。超滤装置的使用促进了MTCC5695脂 肪酶的分离;这反过来又增加了浓度，而纯度却未受影响。 先前的研究报告说，膜处理(超滤)与ATPE的整合不仅促进 了相形成成分与产品的分离，而且也增加了蛋白的纯度。
酶的生产方法.ppt
（五）生产种子的制备
生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用 于发酵罐接种的大量菌体。
1、种子制备工艺过程
养
接种至发酵罐
（1 ）菌种活化
目的：保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接 种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下培养，以 恢复细胞的生命活动能力。
为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段 控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度 范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。
（3）温度的控制方法
一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有 足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。
4、酵母
啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。
假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢 酶等。
工业规模应用的微生物酶和它们的某些来源
酶 α-淀粉酶
产酶微生物
枯草芽胞杆菌 地衣芽胞杆菌
米曲霉
用途
淀粉液化，织物退浆，消化 助剂，加酶洗涤剂
米曲霉，黑曲霉， 制造葡萄糖，发酵、酿酒等
葡萄糖淀粉酶
此外石油产品中12碳—16碳的碳氢化合物已成功用作微生 物培养基的碳源。
注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的 碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。
2、氮源：提供氮元素。
来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的 副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；
②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、 NH4NO3 、NaNO3和（NH4）3PO4等。
玉米粉 8%
豆饼粉 4%
磷酸氢二钠 0.8%
硫酸铵
0.4%
氯化钙
0.2%
氯化铵
酯酶同工酶电泳技术
酯酶同工酶电泳酯酶是催化酯类化合物水解的酶系，目前已发现的酯酶至少有20种。
植物酯酶同工酶的分离技术多采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，主要操作步骤介绍如下。
一、试剂按表1配制贮液和工作溶液---表1 贮液和工作溶液配制用量注：贮液放在冰箱中一般可保存1～2月，3号贮液只能保存1周。
Acr=丙烯酰胺，Bis=甲叉双丙烯酰胺，TEMED=四甲基乙二胺，Tris=三羟甲基氨基乙烷。
二、制胶1、由于电泳槽的构造因厂家不同而有所差异，可按电泳槽所附说明书组装好胶板。
2、按上表配制好分离胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间，至板顶3cm即可；然后沿着玻璃板壁缓慢加入3～5mm蒸馏水层。
刚加水时看出有界面，后逐渐消失；等到再看到界面时表明凝胶已经聚合（一般约30分钟）；再静置30分钟使聚合完全。
3、用注射器吸去分离胶上的水层，用滤纸条吸去残留的水液。
按上表配制好浓缩胶工作液，快速混匀，立即用带长针头的注射器吸取一定量的胶液，沿着玻璃板壁加入胶板间以冲洗分离胶的顶部。
迅速吸出，立即灌注浓缩胶，当灌至凹型玻璃口3mm处停灌，立即插入样品梳，使凝胶液面高出玻璃1～2mm。
然后在距日光灯管10cm处照射进行光聚合。
当看到浓缩胶显乳白色（一般6～7分钟），表明聚合开始。
继续半小时，使聚合完全。
三、电泳1、样品提取取烟苗0.2克，加0.5毫升提取缓冲液（含0.075M Tris-HCl，pH7.5，0.01M KCl，0.01M MgCl，0.001EDTA，5%蔗糖，0.1%巯基乙醇，5%PVP-2聚乙烯基吡咯烷酮），冰块上研磨成匀浆，低温下12000rpm离心15分钟，取上清液置于冰箱中备用。
提取缓冲液种类较多，这里介绍的提取缓冲液本实验室曾采用过，可据需要参看其他提取方法。
2、点样拔出样品梳，吸取样品槽中的水分。
用微量移液器加入适量样品液（一般50微升左右）。
用移液器缓慢加入电极缓冲液，以覆盖样品。
三种不同来源(植物、细菌和真菌)蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇
三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究共3篇三种不同来源（植物、细菌和真菌）蛋白酶的纯化、性质及应用研究1蛋白酶是一类具有水解蛋白质能力的酶，广泛存在于细胞中并参与多种生物学过程。
在生物制药等领域，蛋白酶的纯化、性质及应用研究具有重要的现实意义。
本文将重点介绍来自植物、细菌和真菌三种不同来源的蛋白酶在纯化、性质和应用方面的研究进展。
一、植物蛋白酶的纯化、性质和应用植物蛋白酶主要存在于种子、果实、根茎等植物组织中，其中的大多数是半胱氨酸蛋白酶。
植物蛋白酶的纯化主要采用柱层析法和电泳法等技术。
研究表明，植物蛋白酶的氨基酸序列存在着相似性和区别性，其中一些同源物可以分为家族或亚家族。
此外，植物蛋白酶的活性受到温度、pH值和抑制剂等因素的调节。
植物蛋白酶在食品加工和医药制品等方面可发挥重要作用。
例如，灵芝多肽可以被植物蛋白酶水解成具有生物活性的多肽物质，这对于灵芝多肽的生产具有重要意义。
另外，复合酶制剂SiOpro可以通过作用于面团中的酯酶、氧化酶和蛋白酶等多种酶的协同作用，达到改善松软度、延长保质期等目的。
二、细菌蛋白酶的纯化、性质和应用细菌蛋白酶主要可分为内质网蛋白酶和外源性蛋白酶两种。
前者在细胞内、后者在菌体周围均有分布。
细菌蛋白酶的纯化常常采用柱层析技术和亲和层析技术等，具有高效、快速、经济等优势。
细菌蛋白酶在医药、食品及皮革制品等方面应用广泛。
例如，基于外源性蛋白酶的制剂Accutase是用于脱离培养细胞的酶，具有无细胞毒性、操作简单等特点；生产蛋白药物方面，葡萄球菌的外源性蛋白酶已被用于制备重组蛋白；在食品加工过程中，外源性蛋白酶可以提高油脂的提取效率和品质。
三、真菌蛋白酶的纯化、性质和应用真菌蛋白酶可分为胶原酶和无胶原酶两大类。
前者主要用于胶原的加工，后者则广泛应用于食品加工、纸张制品、色谱等领域。
真菌蛋白酶的纯化方法有很多种，包括柱层析、电泳、反向相色谱法等。
真菌蛋白酶在pH值、温度、金属离子和阻碍剂等条件下均表现出不同的活性和特异性。
从植物中提取有效成分的方法
从植物中提取有效成分的方法
从植物中提取有效成分的方法有多种，以下是一些常见的方法：
1. 溶剂提取法：将植物材料粉碎后，放入适合的容器内，加入数倍量溶剂，可采用浸渍、渗漉、煎煮、回流和连续提取法进行提取。
2. 超声波提取法：利用超声波的振动和空化作用，使植物细胞壁破裂，从而释放出有效成分。
3. 微波提取法：利用微波的能量使植物细胞中的水分和有机溶剂迅速蒸发，形成高压，使细胞壁破裂，释放出有效成分。
4. 超临界流体提取法：利用超临界流体（如二氧化碳）的特殊性质，在高压下使植物细胞壁软化，从而释放出有效成分。
5. 酶提取法：利用酶反应使植物细胞壁分解，从而释放出有效成分。
6. 膜分离技术：利用膜的渗透性，使不同分子量的有效成分通过膜，从而达到分离和纯化的目的。
7. 分子蒸馏技术：利用分子蒸馏技术将植物中的有效成分进行分离和纯化。
这些方法各有优缺点，应根据植物的种类和有效成分的性质选择合适的方法。
酸性磷酸酯酶的提取实验报告
酸性磷酸酯酶的提取实验报告酸性磷酸酯酶基础实验实验一酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
图酶反应进程曲线[试剂和器材]1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。
酶的提取和分离纯化
酶分离纯化的工艺流程设计
设计时需要考虑的因素：
酶源材料 前期工艺过程 产品对纯度的要求 酶存在的状态 设备条件 动力、原料成本及工时费用
酶分离纯化的工艺流程设计
合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时 又提高产品纯度和质量为前提。
对一个方法好坏的评价标准是： 1.酶的回收率 2.酶产品的比活力
此法效率较低
机械破碎法
3.匀浆法
利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破 碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也 可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来 破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小 的组织细胞。
此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较 少，但难于在工业生产上应用。
11.2.2 物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因素的 作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物 理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎
所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法 可浓缩并去除部分杂质，此外，浓缩的方 法有 （1）蒸发法 （2）反复冻融法 （3）胶过滤 （4）超滤法
2.初步提纯
除去大分子的核酸和粘多糖 （1）加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或
MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。 （2）常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性
材料选择及其前处理
动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织 植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种
子用乙醚等脱脂 微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离 胞外酶
酶 胞内酶 结酶 溶酶
11.2 细胞破碎
除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之 外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分 离纯化前须将进行细胞的破碎。 破碎细胞的方法有:
剂等处理解决，有时也用酶。
经过初步提纯，余下来的大分子为酶与杂蛋白， 分离纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作， 就是将酶从杂蛋白中分离出来。
植物酶
《植物酶生物酶提取工艺技术配方及其应用》时间：2009-9-2 10:33:57 点击：119植物酶生物酶提取工艺技术配方及其应用1、编码植物脱氧海普赖氨酸合成酶的DNA,植物真核起始因子5A,转基因植物和控制植物衰老和程序性细胞死亡的方法2、植物GMP合成酶3、增强了蔗糖磷酸酯合成酶表达的转基因产纤维植物4、一种以大豆为原料酶法生产植物蛋白胨的方法5、植物蛋白水解复合酶及其制备方法6、生物酶法制造植物油脂肪酸甲酯的新方法7、脂肪酸去饱和酶基因,含该基因的载体,用该基因转化的植物,以及产生该植物的方法8、用木聚糖酶处理植物材料9、食用菌激活植物原浆酶发酵的方法及其产品10、用于表达植物中导入的基因的乙酰羟酸合成酶启动子11、亚麻或其它可浸解植物的分批酶促浸解法12、含谷胱甘肽Ｓ-转移酶基因的除莠剂耐性植物13、编码具有除莠剂抗性的植物乙酰乳酸合酶的核酸片段14、氨基酸"珍珠"饴植物酶法新工艺15、表达原核生物铵依赖性天冬酰胺合成酶的转基因植物16、经引入编码草酸氧化酶的基因生产抗桑条菌核病核盘霉攻击的植物17、一种丝兰植物碱性蛋白酶18、桄榔植物蛋白酶19、一种用植物提取超氧化物歧化酶的方法20、多酶体系制备植物胚芽乳汁和干粉的方法21、高效复合植物β-淀粉酶22、植物油的酶脱胶方法23、腐胺N-甲基转移酶,编码腐胺N-甲基转移酶的重组DNA分子,生物碱含量减少的转基因烟草植物24、能提供植物对病毒抗性的多核酶和产生这种多核酶的抗性植物25、几丁质酶、编码它的DNA及含有它们的植物26、编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的DNA,含所述DNA的重组载体和转化的植物27、具有可耐低温丙酮酸磷酸双激酶活性的多肽与将其编码的DNA和含有该DNA的重组载体以及转型植物28、应用复合酶处理植物秸秆加工精饲料的方法29、植物中蔗糖磷酸化酶的表达30、表达动物细胞来源(2'－5')寡腺苷酸合成酶和核糖核酸酶L的抗病毒植物及其构建方法31、表达C4植物光合酶的C3植物32、羟苯丙酮酸双加氧酶基因的DNA序列以及含有羟苯丙酮酸双加氧酶基因的抗特定除草剂植物的获得33、用曲霉属磷脂酶对植物油脱胶的酶方法34、突变的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶,编码此蛋白的基因以及含有此基因的转化的植物35、植物谷胱甘肽S-转移酶启动子36、山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法37、对羟基苯丙酮酸双加氧酶的植物基因38、葡萄糖氧化酶基因在培育抗病转基因植物中的应用39、表达纤维素分解酶的转基因植物40、芽孢杆菌核糖核酸酶基因植物花药特异性表达载体41、来源于植物原卟啉原氧化酶基因的启动子42、编码植物原卟啉原氧化酶及其抑制剂抗性突变体的DNA分子43、棉子糖合成酶基因、棉子糖的制备方法及其转化的植物44、植物氨基酸生物合成酶45、在转基因植物中表达果糖1,6二磷酸醛缩酶46、编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的DNA序列及其于植物中的超量生产47、果实中植物蛋白质酶钝化方法48、突变芽胞杆菌RNA酶基因及其转化植物49、编码植物镁螯合酶CHLD亚基的DNA序列及用于测定植物镁螯合酶活性的方法50、含有木聚糖降解碱性酶和非植物细胞壁降解酶的洗涤组合物51、植物脂肪酸环氧化酶及其用途52、用过氧化物酶编码序列赋予单子叶植物昆虫抗性的方法53、快速测定有机磷农药的植物酯酶片54、突变的羟基苯丙酮酸双氧化酶、基DNA序列和含该基因且耐除草剂的植物的分离55、植物碱性和中性蔗糖酶56、植物酶激活剂57、饲料制剂中的热稳定性植酸酶及植物表达58、携带新黄素裂解酶基因的转基因植物59、在植物中降低Bowman－Birk蛋白酶抑制剂的水平60、受体样蛋白激酶RKN以及用其增加植物生长和产量的方法61、编码α－葡糖苷酶的核酸分子,合成一种改性淀粉的植物,植物的产生,其应用和改性淀纺62、编码β－淀粉酶的核酸分子,合成一种改性淀粉的植物,制备方法及应用63、用于改变植物中酶和乙酰辅酶A水平的材料和方法64、割取万寿果乳液提取纯天然植物蛋白酶的方法65、植物脂肪酸去饱和酶启动子66、脂肪酸去饱和酶基因，含该基因的载体，用该基因转化的植物，以及产生该植物的方法67、来源于植物的二酯酰甘油酰基转移酶基因68、编码植物脂酶的DNA、转基因植物和控制植物衰老的方法69、用酵母生产具有绵羊、牛、山羊乳汁等凝固和蛋白水解活性的植物来源的天冬氨酸蛋白酶70、具有提高的淀粉蔗糖酶蛋白和提高的分支酶活性的遗传修饰的植物细胞和植物71、景天庚酮糖－1,7－二磷酸酶在转基因植物中的表达72、一种植物纤维原料酶降解制备低聚木糖的方法73、在组成型植物V－ATP酶启动子控制下的植物基因表达74、垃圾用植物酶解杀菌生产有机肥料的方法75、植物二氢乳清酸酶76、编码参与淀粉合成的酶的植物核酸分子77、植物脂肪酸去饱和酶基因78、防治植物病害的碱性果胶解聚酶制剂及其使用方法79、用作为脂酶抑制剂的源自植物提取物的药物制剂80、一种用转基因植物联产纤维素酶及其它酶的方法81、一种表达植酸酶的转基因植物的制备方法82、一种直接酶解植物秸秆发酵生产2.3-丁二醇的方法83、蚯蚓活动在垃圾堆肥基质草坪中对草坪植物抗氧化酶调控上的应用84、植物镁螯合酶H亚基的新用途85、利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK03提高植物耐冷能力86、无溶剂系统中固定化全细胞酶催化生产植物甾醇酯的方法87、凝集素样蛋白激酶胁迫相关多肽和在植物内使用的方法88、以植物多酚类物质为底物酶法合成黑色素89、酶催化、分子蒸馏提取天然维生素E、植物甾醇、脂肪酸甲酯新方法90、植物内淀粉合酶的过量表达91、编码新型异戊二烯基蛋白酶的植物多核苷酸92、一种利用转基因植物生产植酸酶的方法93、植物性有机肥稀酶速效转化发酵剂及其制备方法94、用于生物转化的植物酶95、一种盐生植物的ω3脂肪酸去饱和酶基因及其表达载体和用该基因转化的植物细胞及植株96、棉花漆酶转基因植物及其应用97、通过改进丙酮酸磷酸二激酶提高植物光合作用速度的方法98、编码植物脱氧8-羟-2,7,10 -三氨基癸酸合酶、植物真核生物翻译启始因子5A的DNA、转基因植物以及控制植物衰老程序性细胞死亡99、分离自展叶剑叶藓的C Y P 7 4酶家族之丙二烯氧化物合酶和二乙烯基醚合酶和编码这些合酶的核苷酸序列以及产生病原体抗性植物的方法100、植物环丙烷脂肪酸合酶基因、蛋白质及其用途101、编码植物脱氧海普赖氨酸合成酶的DNA，植物真核起始因子5A，转基因植物和控制植物衰老和程序性细胞死亡的方法102、割取万寿果乳液提取纯天然植物酶的方法103、用蛋白酪氨酸激酶抑制剂涂覆或浸渗的血管斯坦特固定模或移植物及其使用方法104、具有降低的α-D-半乳糖苷酶活性的咖啡植物105、无致敏原植物蛋白饲料用的复合酶配方及其应用106、包括表达植物分裂素氧化酶的修饰植物形态学、生物化学和生理学的方法107、植物型黑色素酶法合成108、一种单子叶植物胆碱单加氧酶基因及其所编码的蛋白质109、植物韧皮部和淀粉鞘特异表达的蛋白酶抑制剂基因启动子110、小麦高光效和抗逆相关的苹果酸脱氢酶、其编码基因及培育抗逆植物的方法111、植物胸苷激酶及其用途112、利用植物酶制取玉米氨基酸珍珠浆的方法113、GNTIII(UDP-N乙酰葡萄糖胺:β-D-甘露糖苷β(1,4)-N-乙酰葡萄糖胺基-转移酶III)在植物中的表达114、植物核苷酸糖焦磷酸酶/磷酸二酯酶( N P P酶)、及其生产方法、在制造测试装置中的用途、和在生产转基因植物中的应用115、两个相思树纤维素合酶基因及提高植物纤维素含量的方法116、使用动物和/或植物酶但完全不用石灰和硫化物的去毛方法117、在转基因植物中表达耐热植酸酶118、红树甜菜碱醛脱氢酶基因以及提高植物耐盐性的方法119、一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法120、蔗糖合成酶的基因表达在植物组织中的修饰及其用途121、编码植物脂酶的DNA、转基因植物和控制植物衰老的方法122、具有抗血管生成和基质金属蛋白酶抑制活性的包含蜂花属植物叶提取物的组合物123、烟胺合成酶基因的用途和通过转基因植物提高植物耐逆性的方法124、用于S-腺苷L-甲硫氨酸:茉莉酮酸羧基甲基转移酶的基因以及应用该基因开发抗病原体和抗不利因素的植物的方法125、一种植物果糖1，6－二磷酸醛缩酶编码基因保守区的克隆方法126、酶解技术生产改性植物蛋白127、油料作物种籽中蛋白水解酶的激活及植物蛋白的水解128、具有降低的腺苷酸激酶活性并表现淀粉积累增加的转基因植物129、一种经植物蛋白酶水解制作小分子牛奶的方法130、一种以植物为生物反应器生产治疗艾滋病药物人溶菌酶的方法131、表达纤维素分解酶的转基因植物132、垃圾用植物酶解杀菌生产有机肥料的方法133、糜蛋白酶抑制剂在预防和/或治疗动-静脉移植物失效中的应用134、用于抑制催泪成分合成酶基因表达的DNA及其载体、使用该DNA及其载体抑制催泪成分合成酶基因表达的方法以及催泪成分合成酶基因的表达被抑制的植物135、编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的表达盒和包含它的除草剂耐受植物136、利用内源蛋白酶同时生产豆类淀粉与植物分离蛋白的方法137、一种动植物和微生物细胞壁溶解酶反应液及其应用138、多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的应用139、一种植物纤维原料制浆前的酶处理方法140、天然有机植物蛋白酶助燃除碳剂及其制备方法141、植物中λ整合酶介导的重组142、植物过氧化物歧化酶的快速测定、定位方法143、多磷酸肌醇6-/3-激酶基因在植物抗盐中的应用144、改善植物油的酶促脱胶和减少下游加工设备结垢的方法145、一种植物超氧化物歧化酶富氧催化大规模生产方法146、用于改变植物中酶和乙酰辅酶A水平的材料和方法147、转基因植物中GOX蛋白的酶联免疫检测方法及其专用试剂盒148、植物纤维生物酶降解剂149、多种淀粉磷酸化酶活性增加的植物150、具有增加的淀粉磷酸化酶活性的植物151、植物纤维生物酶降解剂以及降解制浆方法152、人苍白杆菌及其在降解植物秸秆或重要酶的制备中的应用153、药用植物大戟3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶蛋白编码序列154、表达蚓激酶转基因植物的生产方法及产品155、通过表达过氧化物酶在转基因植物中增加病原体抗性的方法156、一种利用废弃动植物油脂制备生物柴油的生物酶酯化的制备方法157、重组蔗糖合酶的生产方法、及其在生产蔗糖测定试剂盒中的应用、生产腺苷二磷酸葡糖的方法和获得具有积累了高浓度的腺苷二磷酸葡萄糖和淀粉的叶片和储藏器官的转基因植物的方法158、表达用于自动水解纤维素成分的纤维素酶的转基因植物和产生可溶的糖的方法159、包括在种子中表达细胞分裂素氧化酶的改变植物形态学、生物化学和生理学的方法160、衍生自壳斗植物的糖酶抑制剂及其应用161、酶工业品在高植物蛋白食物中的应用方法162、抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法163、水稻凝集素样受体激酶1（OsLRK1）,一个参与植物发育的基因164、一种含有辅酶Q10和植物精华的乳剂及其制备方法165、利用碳酸酐酶活力鉴定喀斯特适生植物的方法166、一种植物花粉细胞破壁分解专用复合酶167、表达右旋葡聚糖蔗糖酶和合成改性淀粉的转化植物168、表达Na+泵ATP酶的维管植物169、一种来源于植物秸秆料的纤维素酶解助剂170、增强了蔗糖磷酸酯合成酶表达的转基因产纤维植物171、利用水稻蛋白激酶基因OsCIPK15提高植物耐盐能力172、酪蛋白激酶胁迫相关多肽及其用于植物的方法173、表达齿斑葡聚糖蔗糖酶并合成改性淀粉的转化植物174、一种植物超氧化物歧化酶的制备方法175、植物通过选择性抑制海藻糖-6-磷酸磷酸酶的胁迫耐性176、编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法177、适用于改变产油植物及酵母中多不饱和脂肪酸水平的△15脂肪酸去饱和酶178、从植物中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂有效成分的方法179、利用小鼠一氧化氮合成酶基因提高植物的抗旱性180、转基因植物中新霉素磷酸转移酶基因的传感器检测方法181、生产具有增强的植物纤维降解酶的液体曲的方法，通过所述方法获得的液体曲及其应用182、植物细胞壁降解酶之间的融合蛋白及其用途183、抗除草剂的向日葵植物、编码抗除草剂的乙酰羟酸合酶大亚基蛋白的多核苷酸和使用方法植物蛋白质提取方法总汇点击次数：136 作者：lsk 发表于：2008-07-21 00:00转载请注明来自丁香园来源：互联网一、植物组织蛋白质提取方法1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
三相法提取猪肝酯酶及其在制备D灢7灢ACA中的应用
第39卷第1期2024年2月安 徽 工 程 大 学 学 报J o u r n a l o fA n h u i P o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y V o l .39N o .1F e b .2024文章编号:1672-2477(2024)01-0008-07收稿日期:2023-04-20基金项目:安徽省高等学校自然科学研究项目(K J 2021A 0512)作者简介:张呈彦(1998-),男,浙江金华人,硕士研究生㊂通信作者:魏胜华(1972-),男,安徽蚌埠人,副教授,博士㊂三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-A C A 中的应用张呈彦1,程瑶纳1,王雨轩1,王堃宁1,魏胜华1,2,3*(1.安徽工程大学生物与食品工程学院,安徽芜湖 241000;2.微生物发酵安徽省工程研究中心,安徽芜湖 241000;3.安徽省工业微生物分子育种工程实验室,安徽芜湖 241000)摘要:酯酶广泛存在于动物㊁植物和微生物中,具有作用范围广㊁底物特异性高等特点㊂该酶能够催化许多含有酯㊁酰胺㊁硫酯或乙酰基的化合物的水解与合成,在生物催化领域具有重要的用途㊂对来源于猪肝中的酯酶采用三相分离的方法进行了提取,并利用猪肝酯酶的水解特性,研究了其催化7-氨基头孢烷酸(7-A C A )脱乙酰基制备去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D -7-A C A )的过程㊂主要研究结果:确立了三相法分离提取猪肝酯酶的方法,考察了有机溶剂种类㊁有机溶剂用量㊁硫酸铵浓度以及体系的p H 和提取温度等条件对三相法分离提取猪肝酯酶的影响㊂实验结果表明在硫酸铵质量分数为45%㊁异丁醇与水相之比为1∶1㊁pH 7.0㊁温度为30℃的条件下,酶活回收率为54.84%,纯化倍数为6.32倍㊂以猪肝酯酶为催化剂,研究了猪肝酯酶催化7-A C A 脱乙酰基制备D -7-A C A ,在p H 7.5㊁温度35℃㊁底物浓度2%㊁酶添加量30U /m L 的反应条件下,7-A C A 转化率达到94.33%㊂关 键 词:猪肝酯酶;三相法;7-氨基头孢烷酸;去乙酰基-7-氨基头孢烷酸中图分类号:T Q 654.2 文献标志码:A猪肝酯酶(P L E ,E C3.1.1.1)是一种哺乳类动物羧酸酯酶类,在其催化的活性位点具有G l y -G l u -S e r -A l a -G l y 的一致序列,属于丝氨酸型酯酶[1]㊂过去的几十年来,P L E 主要用作水解酶来生产各种羧酸㊁醇和二醇衍生物,其水解能力强大,表面活性剂聚山梨酯㊁增塑剂邻苯二甲酸二(2-乙基己酯)和一些药物都可以被P L E 所水解,这也显示该酶是肝脏具有解毒功能的基础;同时,猪肝酯酶在催化过程中表现出较高的区域选择性和立体特异性,使其成为制备手性化合物的有吸引力的生物催化剂[2-4]㊂猪肝酯酶具有多种同工酶,可以由α㊁β和γ随机组成,每个亚基的分子量在60K D a 左右[5],目前商品化的猪肝酯酶是多种同工酶的混合物㊂高效㊁简便的酶制备方法是决定其能否在生物催化领域产业化应用的关键㊂目前,一种采用三相法(T h r e e -p h a s eP a r t i t i o n i n g ,T P P )分离制备生物大分子的技术日益引起研究人员的重视[6],已在多糖[7]㊁油脂[8]和蛋白[9]等的分离提取以及制备中广泛应用㊂将盐和有机溶剂加入到含有目标物的溶液中,混匀,静置后分层形成三相,其中最上层为有机相(包含非极性化合物),中间相为酶蛋白的固体层,最下层为水相(包含极性化合物),使得不同成分得以有效地分离㊂该方法具有简单㊁快速和易于放大的优点,所获得的酶蛋白可以直接用于后续的催化反应[10]㊂去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D e a c e t y l -7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i cA c i d ,D -7-A C A )是合成绝大多数头孢类抗生素的中间体,市场需求量大[11]㊂D -7-A C A 的制备主要是通过去除7-氨基头孢烷酸(7-A m i n o c e p h -a l o s p o r a n i cA c i d ,7-A C A )的3-位的乙酰基而获得[12],其过程见图1㊂乙酰基的去除可以采用化学法和酶法[13]㊂化学法一般是在低温和强碱的条件下对7-A C A 进行水解,显而易见,该方法存在能耗高㊁副产物多以及对环境有污染等不利因素[14];酶法制备是以脱乙酰基酯酶为催化剂,直接水解7-A C A 生成D -7-A C A ,具有反应条件温和㊁底物选择性强㊁副产物少㊁操作流程简便以及过程安全环保等优点[15-16]㊂本研究以猪肝为原料,首先采用三相法提取其酯酶,优化了酯酶的提取条件,建立起一种能够规模化制备猪肝酯酶的工艺;然后利用酯酶所具有的强大水解功能,用其作为催化剂水解7-A C A 制备D -7-A C A ,考察了影响7-A C A 水解的因素㊂本研究不仅进一步扩展了猪肝酯酶的新用途,而且提供了一种转化7-A C A 生成D -7-A C A 的新方法㊂水解7-A C A 制备D -7-A C A 示意图如图1所示㊂图1 水解7-A C A 制备D -7-A C A 示意图1 材料与方法1.1 材料与仪器原材料:新鲜猪肝,购自当地农贸市场㊂试剂:异丙醇㊁叔丁醇㊁异丁醇㊁正戊醇1-萘酚㊁乙酸-1-萘酯和固蓝B 盐等药品,均为分析纯,购自国药集团上海化学试剂有限公司;7-A C A ㊁D -7-A C A ,均为分析纯,购自上海麦克林生化科技股份有限公司㊂仪器:高效液相色谱仪2695(美国W a t e r s 公司);台式高速离心机64R (美国贝克曼公司);可见分光光度计723(上海仪电科学仪器股份有限公司);料理机J Y L C 020(九阳股份有限公司)㊂1.2 实验方法(1)猪肝丙酮粉的制备㊂将新鲜猪肝剥去脂肪和结缔组织,切成薄片状,置于-30℃冰箱中预冷冻后真空冷冻干燥24h ,然后用料理机将冻干的猪肝粉碎成末㊂取一定量的猪肝粉末加入预冷的丙酮(4℃),在烧杯中搅拌2~3m i n ,用布氏漏斗抽滤,滤纸上的滤渣再用丙酮洗涤1次,自然风吹干丙酮,收集滤纸上的过滤物,即为猪肝丙酮粉㊂(2)三相法提取猪肝酯酶㊂称取1.0g 丙酮粉,加入80m L 的磷酸盐缓冲液(0.05m o l /L ,p H 5.0),在25℃下浸提30m i n ,在4℃条件下8000r /m i n 离心10m i n ,上清液即为猪肝酯酶粗提取液;取一定体积的粗酶提取液置于50m L 离心管中,加入一定量的硫酸铵,充分震荡使其溶解;然后加入一定体积的有机溶剂,混匀后在室温下静置一段时间后,在4℃条件下8000r /m i n 离心10m i n ,酶蛋白沉淀在中间形成薄片状的固相层;用移液枪移走上层的有机相和下层的水相,所剩的中间沉淀相即为提纯得到的猪肝酯酶㊂(3)猪肝酯酶催化7-A C A 转化制备D -7-A C A ㊂称取一定质量的7-A C A 粉末,溶解于自来水中,加入少量浓度10%的氨水,使7-A C A 充分溶解,待7-A C A 充分溶解后,加入一定量猪肝酯酶溶液,将反应液置于通有30℃温水的夹套烧杯中,加入转子不断搅拌进行反应㊂在反应的过程中,7-A C A 水解产生D -7-A C A 和乙酸,导致反应体系的p H 降低,不利于反应的快速稳定,因此利用p H 控制器,加入浓度10%的氨水,保证反应体系的p H 控制在7.0左右,反应过程中定时取样,用高效液相色谱仪测定7-A C A 的含量㊂1.3 分析方法猪肝酯酶的酶活测定采用比色法[17],酶活的定义为:在30℃㊁p H 7.0条件下,猪肝酯酶催化α-乙酸萘酯,每分钟产生1μm o l 的α-萘酚所需的酶量,定义为单位P L E 活力㊂蛋白含量采用B a r d f o r d 法[18]进行测定㊂7-A C A 和D -7-A C A 检测采用高效液相色谱法进行检测[19],色谱柱:S u pi l s e rQ C -18(4.6mm×250mm ,5μm );流动相:V (5g 磷酸二氢钾和5g 磷酸氢二钾,去离子水定溶至1000m L ,磷酸调p H 至6.0)∶V (乙腈)=92∶8;流速:0.5m L /m i n ;柱温:35℃;检测波长:235n m ;进样量:20μL ㊂2 结果与分析2.1 三相法分离提取猪肝酯酶(1)不同有机溶剂对三相分离提取效果的影响㊂不同有机溶剂对三相分离提取效果的影响如图2所示㊂由图2可以看出异丁醇作为有机溶剂的提取效果最好,纯化倍数达到了1.41,酶活回收率为65.71%㊂使用其他有机溶剂时,酶活回收率和纯化倍数㊃9㊃第1期张呈彦,等:三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-A C A 中的应用㊃01㊃安 徽 工 程 大 学 学 报第39卷都相对较低,无法达到类似于异丁醇和叔丁醇的效果㊂而作为三相法中常用的有机溶剂,叔丁醇效果略低于异丁醇,可能是异丁醇的分子大小及其分子结构对猪肝酯酶的蛋白质结构影响较小,与猪肝酯酶的特异性较强,有利于保持猪肝酯酶的活性,并且虽然经过丙酮萃取,脱去了猪肝中的大部分,但粗酶提取液中还留有未能完全去除的少部分脂质,会影响三相分离的效果,由于脂质微溶于异丁醇,因此分离效果较好㊂叔丁醇作为亲水性有机溶剂除了与猪肝酯酶有较强的特异性,与其他蛋白质也能保持很好的连接,因此纯化效果不如异丁醇㊂其他有机溶剂分子量较大或者结构较为复杂,中间沉淀相的形成效果相对差,不利于维持猪肝酯酶的结构,在体系中容易降低猪肝酯酶的活性㊂综合考虑下,选择异丁醇作为三相分离纯化猪肝酯酶的最佳有机溶剂㊂(2)硫酸铵浓度对三相分离提取效果的影响㊂在采用三相法分离提取猪肝酯酶的过程中,硫酸铵作为无机盐电解质进行盐析纯化时,由于带电离子的作用,蛋白质胶体颗粒表面的一部分电荷被中和,胶体颗粒之间互相排斥的力量减弱,胶体颗粒就会相互聚集,最后沉淀出来㊂因此,硫酸铵浓度影响蛋白质的沉淀,同样影响分离的效果㊂由图3可以看出,随着硫酸铵浓度逐渐增加,猪肝酯酶的酶活回收率先增高后降低,纯化倍数逐渐降低㊂当硫酸铵浓度达到50%时,猪肝酯酶的酶活回收率最高,达到45.4%;硫酸铵浓度超过50%后,猪肝酯酶的酶活回收率有所下降,而纯化倍数随着硫酸铵浓度的增大而逐渐降低㊂说明在一定程度上,增加硫酸铵浓度可以提高酶蛋白的盐析效率,提高了酶活回收率,但是随着硫酸铵浓度的增大,越来越多的杂蛋白被硫酸铵盐析出来,导致猪肝酯酶的纯化倍数降低,此外高浓度的硫酸铵在水相中不能完全溶解,会影响三相分离效果㊂图2 不同有机溶剂对三相分离提取效果的影响图3 硫酸铵浓度对三相分离提取效果的影响(3)异丁醇用量对三相分离提取效果的影响㊂由图4可知,异丁醇用量较低时,随着异丁醇用量增加,猪肝酯酶的纯化倍数和酶活回收率都逐渐上升,浸提液与异丁醇的体积比为1∶1时纯化倍数达到最大值2.81,酶活回收率为45.80%,可能是因为三相分离时异丁醇与硫酸铵的协同作用随异丁醇用量的增加而更加明显㊂当异丁醇用量继续增加时,由于有机溶剂浓度过高,三相体系含水量较低,破化了酶的立体结构,导致酶蛋白变性失活㊂所以纯化倍数和酶活回收率均逐渐下降㊂因此,选取猪肝浸提液与异丁醇的体积比为1∶1时,三相分离纯化猪肝酯酶能够达到较好的效果㊂(4)温度对三相分离提取效果的影响㊂由图5可知,在提取过程中,随着温度的上升,猪肝酯酶的纯化倍数和酶活回收率随之上升㊂当温度上升到30℃时,猪肝酯酶的纯化倍数最大,达到了1.93倍,而酶活回收率则在25℃时最高,为59.52%;当温度继续上升时,猪肝酯酶的酶活回收率和纯化倍数分别有不同程度降低㊂虽然25℃与30℃的酶活回收率和纯化倍数有一些差别,但是30℃的纯化效果更加明显,并且25℃与30℃的酶活回收率相差不是很大㊂因此,选择30℃作为三相法分离纯化猪肝酯酶的最适温度㊂(5)p H值对三相分离提取效果的影响㊂图6显示了体系的p H值对三相分离提取效果的影响,由图6可知,从p H4.0到6.0,猪肝酯酶的纯化倍数和酶活回收率在逐步升高,在p H7.0时,酶活回收率达到最高,为64.23%,但纯化倍数在p H6.0时最高,达到2.35倍㊂之后,随着p H值的不断升高,猪肝酯酶的纯化倍数和酶活回收率不断下降㊂体系p H过低或过高对酶的结构造成影响,容易导致猪肝酯酶活性的丧失,不利于酶活回收和分离纯化㊂综合考虑猪肝酯酶在弱酸条件下有相对较高的酶活回收率和纯化倍数,因此,在进行三相法分离纯化猪肝酯酶时,应将p H 调节到6.0左右㊂图4 有机溶剂比例对三相分离提取效果的影响图5 温度对三相分离提取效果的影响图6 p H 对三相分离提取效果的影响2.2 分离纯化结果分析在以上优化的结果基础上进行了三相分离的操作,结果显示酶活回收率为54.84%,纯化倍数为6.32倍㊂分离效果如图7所示,从图中可以看出,在异丁醇-硫酸铵盐溶液的体系中形成了以酶蛋白固体为中间固相,有机溶剂为上相,水为下相的三相形态,作为中间层固相的酶饼很容易从体系中取出㊂分别将处理前的猪肝酯酶浸提液和三相法优化后的猪肝酯酶提取液进行S D S -P A G E 电泳分析,结果如图8所示,从图8中可以看出,纯化后酶液图7 猪肝酯酶的三相分离的S D S -P A G E 蛋白条带较浸提液明显减少,分离纯化后的酶液中主要含有分子量为60k D a 左右和35k D a 的酶蛋白㊂根据猪肝酯酶的亚基的分子量在60k D a 左右,确定其为猪肝酯酶,而35k D a的酶蛋白则是杂蛋白,三相法对其纯化效果不明显,其余条带则为未纯化干净残留的少量杂蛋白㊂三相分离后的猪肝酯酶电泳条带相比较浸提液,目的蛋白条带未明显变化,而其余多数条带明显减少,说明去除了多数杂蛋白,达到了分离纯化的目的㊂2.3 猪肝酯酶转化7-A C A 制备D -7-A C A (1)p H 对转化的影响㊂反应环境下的p H 值是影响酶促反应速率的重要条件之一,较低或较高的p H 值都会影响环境中的质子数量,对酶蛋白分子的结构和性质造成影响,降低酶促反应速率;并且底物7-A C A 在酸性环境下溶解度极低,在碱性环境下易分解㊂图9显示了p H 对7-A C A 转化的影响,由图可以看出随着p H 的逐渐变大,转化率逐渐提高,当p H 在7.0~7.5的区间时,转化率基本保持在50%左右,其中在p H 7.5时略高,因此选择p H 7.5为反应的最适p H 值㊂(2)温度对转化的影响㊂图10显示了温度对转化的影响,从图中可以看出,随着温度逐渐升高,7-A C A 的转化率先升高后下降,在35℃的时候达到最大值㊂酶转化能力与温度密切相关,在最适反应温度下,酶活催化效率才能最大显现出来㊂当温度低于最适反应温度时,酶分子活性较低,会导致反应速率降低,当温度高于最适温度时,容易破坏酶结构,导致酶变性失活,也会导致反应速率降低㊂因此,最终选择35℃作为反应的最佳温度㊂(3)底物浓度对转化的影响㊂图11显示了底物浓度对于转化的影响,当底物浓度在0.5%~2%时,7-A C A 的转化率变化不明显,底物浓度为2%时,7-A C A 的转化率为63.65%,而当底物浓度提高至4%时,7-A C A 的转化率仅有21.96%㊂推测结果产生的原因可能是猪肝酯酶蛋白含量有限,当底物浓度达到2%,酶蛋白上的活性结㊃11㊃第1期张呈彦,等:三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-A C A 中的应用注:1.M a r k 蛋白;2.猪肝酯酶浸提液;3.三相法纯化后的猪肝酯酶㊂ 图8 猪肝酯酶SD S -P A GE 电泳分析合位点基本饱和,随着底物浓度的继续增大,反应体系中的7-A C A 浓度也迅速增大,反而会导致转化率降低㊂在考虑高效转化7-A C A 且避免浪费的前提下,最终确定的反应最佳底物浓度为2%㊂(4)酶活对转化的影响㊂从图12中可以看出,随着酶浓度的增加,反应体系中的单位酶活也随之升高,7-A C A 的转化率逐渐增大㊂当单位酶活达到27.78U /m L 时,2h 的时候7-A C A 的转化率达到97.05%,基本完全反应㊂因此,最终确定猪肝酯酶催化7-A C A 水解制备D -7-A C A 的最佳单位酶活在30U /m L 左右㊂(5)酶转化7-A C A 生成D -7-A C A 的过程㊂猪肝酯酶催化7-A C A 制备D -7-A C A 的过程曲线如图13所示㊂由图13可以看出,在反应开始阶段7-A C A 的转化率上升较快,在反应120m i n 时基本达到平衡,7-A C A 的转化率为94.33%,而在反应240m i n 时,7-A C A 的转化率相较于120m i n 时仅提高了3.9%,因此以反应120m i n 作为反应结束时间㊂韩云宾[20]以粘红酵母为催化剂全细胞转化7-A C A 生成D -7-A C A ,结果表明在30%的菌体浓度下,底物浓度为15%,210m i n 后7-A C A 基本完全转化㊂虽然在底物浓度和转化率方面有所差距,但是本反应时间仅有120m i n ,并且采用酶转化,杂质含量少㊂图14㊁15分别为反应结束后的液相色谱图及7-A C A 和D -7-A C A 混合标准品液相图,通过对比可知,转化液中绝大部分为D -7-A C A ,以及少量未反应完的7-A C A ㊂图9 p H 对7-A C A 转化的影响图11 底物浓度对7-A C A转化的影响图10 温度对7-A C A 转化的影响图12 酶活对7-A C A 转化的影响3 结论研究表明采用三相法能够有效从猪肝中分离提取获得猪肝酯酶㊂考察了不同有机溶剂对分离效果的影响,最终选择异丁醇作为分离纯化过程中的有机溶剂;采用三相法提取猪肝酯酶的工艺条件确定为:硫㊃21㊃安 徽 工 程 大 学 学 报第39卷图13 猪肝酯酶催化7-A C A 制备D -7-A C A 的过程曲线酸铵质量分数45%,异丁醇与水相之比为1∶1,p H 7.0,温度30℃,测得的酶活回收率为54.84%,纯化倍数为6.32倍㊂以三相法分离纯化得到的猪肝酯酶作为催化剂,催化7-A C A 水解制备D -7-A C A ,通过实验优化了猪肝酯酶催化水解7-A C A 制备D -7-A C A 的条件㊂当反应体系的p H 保持在7.5左右,温度控制在35℃,底物浓度为2%时,在反应体系中添加30U /m L 左右的猪肝酯酶,经过2h 的反应,7-A C A 转化率能够达到95%左右㊂本研究设计了一种从猪肝中高效㊁低成本提取猪肝酯酶的方法,并利用猪肝酯酶水解7-A C A 制备D -7-A C A ,不仅开拓了猪肝酯酶的新用途,也为制备D -7-A C A 发掘了新的酶源㊂图14转化液的高效液相色谱图15 7-A C A 和D -7-A C A 标准品的高效液相色谱参考文献:[1] B O R N S C H E U E R U T.M i c r o b i a l c a r b o x y l e s t e r a s e s :c l a s s i f i c a t i o n ,p r o p e r t i e s a n d a p p l i c a t i o n i nb i o c a t a l ys i s [J ].F E M S M i c r o b i o l o g y R e v i e w s ,2002,26(1):73-81.[2] WA L L E R TS ,D R A U ZK ,G R A Y S O NI ,e t a l .I o n i c l i q u i d s a s a d d i t i v e s i n t h e p i g l i v e r e s t e r a s e (P L E )c a t a l y s e ds y n -t 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t o t h r e e p h a s e p a r t i -t i o n i n g (T P P ):S t r u c t u r e so fn a t i v ea n dT P P -t r e a t e dl i p a s e f r o m T h e r m o m y c e s l a n u gi n o s a [J ].S u s t a i n a b l eC h e m i c a l P r o c e s s e s ,2015,3:14-24.[10]P A N A D A R EDC ,R A T HO D V K.T h r e e p h a s e p a r t i t i o n i n g fo r e x t r a c t i o no f o i l :a r e v i e w [J ].T r e n d s i nF o o dS c i e n c e ㊃31㊃第1期张呈彦,等:三相法提取猪肝酯酶及其在制备D -7-A C A 中的应用㊃41㊃安 徽 工 程 大 学 学 报第39卷a n dT e c h n o l o g y,2017,68:145-151.[11]陈海龙,于沛.头孢类抗生素的新型中间体D-7-A C A[J].中国当代医药,2009,16(7):46-48.[12]MA X Q,D E N GSW,S UEZ,e t a l.O n e-p o t e n z y m a t i c p r o d u c t i o n o f d e a c e t y l-7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i c a c i d f r o mc e p h-a l o s p o r i nCv i a i mm ob i l i z e dc e p h a l o s p o r i nCa c y l a s ea n dde a c e t y l a s e[J].B i o c h e m i c a lE n g i n e e r i n g J o u r n a l,2015,95:1-8.[13]G O N ZÁL E Z M,R O D RÍG U E ZZ,T O LÓNB,e t a l.A na l 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n h u i P o l y t e c h n i cU n i v e r s i t y,W u h u241000,C h i n a;2.A n h u i E n g i n e e r i n g T e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r o fM i c r o b i a l F e r m e n t a t i o n,W u h u241000,C h i n a;3.A n h u i E n g i n e e r i n g L a b o r a t o r y f o r I n d u s t r i a lM i c r o b i o l o g y M o l e c u l a rB r e e d i n g,W u h u241000,C h i n a)A b s t r a c t:E s t e r a s e i sw i d e l y d i s t r i b u t e d i n a n i m a l s,p l a n t s,a n dm i c r o o r g a n i s m s.I t h a sw i d e s u b s t r a t e s p e-c i f i c i t y a n d c a n c a t a l y z e h y d r o l y s i s a n d s y n t h e s i s o f a v a r i e t y o f c o m p o u n d s c o n t a i n i n g e s t e r s,a m i d e s,s u l-f o n e s,o r a c e t y l g r o u p s.E s t e r a s e h a s i m p o r t a n t a p p l i c a t i o n s i n t h e f i e l d o f b i o c a t a l y s i s.T h i s p a p e r s t u d i e s t h e e x t r a c t i o no f t h e e n z y m o l o g y o f e s t e r a s e f r o m p i g l i v e r,a n d i t s a b i l i t y t o c a t a l y z e t h e d e a c e t y l a t i o n o f 7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i c a c i dt o p r o d u c ed e a c e t y l-7-a m i n o c e p h a l o s p o r a n i ca c i d.T h e m a i nr e s u l t sa r ea s f o l l o w s:E x t r a c t i o no fe s t e r a s ef r o m p i g l i v e rb y t h r e e-p h a s e p a r t i t i o n i n g h a sb e e ne s t a b l i s h e d.T h e e f f e c t s o fd i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t s,o r g a n i cs o l v e n t sd o s a g e,a mm o n i u m s u l f a t ec o n c e n t r a t i o n,a n dt h e p Ho f t h e s y s t e ma n d e x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e o n t h e t h r e e-p h a s e e x t r a c t i o n o f p i g l i v e r e s t e r a s e h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d.T h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s s h o w e d t h a t u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f a mm o n i u ms u l f a t em a s s f r a c-t i o n45%,i s o b u t a n o l t ow a t e r r a t i oo f1:1,p H7.0,a n d t e m p e r a t u r e30℃,t h e e n z y m e a c t i v i t y r e c o v e r y r a t ew a s65.79%,a n d t h e p u r i f i c a t i o n f a c t o rw a s2.31.W i t h p i g l i v e r e s t e r a s e a s a c a t a l y s t,t h e p r e p a r a-t i o no f D-7-A C Ab y d e a c e t y l a t i o n o f7-A C A w a s s t u d i e d.T h e c o n v e r s i o n r a t e o f7-A C Ar e a c h e d94.33% w h e n t h e p r e p a r a t i o nc o n d i t i o n sw e r e p H7.5,t e m p e r a t u r e35℃,s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n2%a n de n-z y m e a d d i t i o nw a s30U/m L.K e y w o r d s:p i g l i v e r e s t e r a s e;t h r e e-p h a s e p a r t i t i o n i n g;7-A C A;D-7-A C A。
一种羧酸酯酶活力的检测方法与流程
一种羧酸酯酶活力的检测方法与流程
一种羧酸酯酶活力的检测方法和流程主要包括以下几个步骤：
第一步：制备样品
从微生物或动植物中提取羧酸酯酶，并将其纯化至一定程度。
可
以采用各种方法提取和纯化酶，如超声波破碎、离心、柱层析等。
第二步：准备反应体系
将提取得到的酶加入含有特定底物的反应体系中，底物通常为p-
硝基苯酯、碱式酯等。
反应体系需要保证酶和底物的浓度和pH值等参
数合适，以确保反应的可靠性和准确性。
第三步：进行反应
将反应体系加热至一定温度，保持一定反应时间。
在反应过程中，底物被酶催化剂水解，产生相应的产物。
反应后，可以通过各种方法
检测产物的生成量，如分光光度法、荧光法、比色法、质谱法等。
第四步：计算酶活力
根据反应产物的生成量计算酶的活力，通常以酶单位（enzymatic unit，U）表示。
酶活力的计算与反应体系的参数、反应时间等有关。
通过以上几个步骤，就可以检测并计算出羧酸酯酶的活力。
这种
方法可以广泛应用于各种生物样品中的酶活力检测，有助于深入了解
各种生物中的基本代谢过程。
苜蓿酯酶的提取分离及性质测定
低廉的苜蓿中提取植物酯酶，进行分离、纯化， 并系统地对该酯酶的动力学特性及农药检测效果 进行研究，为寻求植物酯酶新酶源提供依据。 1 仪器与试剂 1.1 仪器 UV-2802PCS型紫外可见分光光度计：上海 尤尼柯仪器有限公司；高速冷冻离心机：法国 JOUAN；电子天平：上海梅特勒-托利多仪器有限 公司；HH-(S)6数显恒温水浴锅：金坛市友联仪器 研究所。 1.2 试剂 硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢钠等：国产分
紫 花 苜 蓿 素 有 “ 牧 草 之 王 ” 的 美 誉 [1]， 它 是世界上栽培最早、分布面积最广的一种优 质 豆科牧草。苜蓿中富含蛋白质、维生素、无 机盐及促生长因子，其鲜草中粗蛋白质含量为 4.5%~5.9%，干草中蛋白质含量约为15%~25%， 比玉米高1~1.5倍[2]。 近年，由于食用农药残留超标的蔬菜而引起 食物中毒的事件时有发生，为了阻止有毒蔬菜进 入市场，在蔬菜上市前进行农药残留快速检测是 比较可行的办法。目前，快速检测农药残留用植 物酯酶都是以粮食作物如小麦[3]、大豆[4]、荞麦、 豌豆、玉米[5]等为酶源，检测成本虽然比动物酶源 低，但毕竟需要消耗粮食。本文试验从价格更加
Abstract: The esterase is extracted from medicago sative. After purification, the effects of the pH value, temperature, the species and the concetration oft shows: the activity of esterase is the highest at 40 ℃ in phosphate buffered solution (with the pH of 7.0). Key words: medicago sative; esterase; extract
豌豆酯酶的纯化和酯酶活性表征及其对农药的敏感性
豌豆酯酶的纯化和酯酶活性表征及其对农药的敏感性黄嫒;马志强;王玮;宋燕飞;李荣;陈强;陈祥贵;杨潇【摘要】由于食品和环境中的农药残留对人体健康构成威胁,使得发展农残快速检测方法显得十分重要,从植物中发现新的酶源有助于降低酶抑制法快速检测农药的成本.实验从豌豆中分离纯化豌豆酯酶,并进行了酶类鉴别、特性表征和农药敏感性研究.纯化后的豌豆酯酶分子质量约为26.0 kDa,具有较高的酯酶活性.通过底物和抑制剂特异性试验,将豌豆酯酶分类为羧酸酯酶.豌豆酯酶在质量浓度为0.45μg/mL,缓冲液pH 6.5和反应温度40℃时,表现出最好的催化活性.豌豆酯酶可以被有机磷和氨基甲酸酯类农药抑制.豌豆酯酶属于B型酯酶,可用于酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留,且经过纯化的豌豆酯酶满足大多数农药最大残留限值(MRL)检测的要求.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2019(045)011【总页数】7页(P78-84)【关键词】植物酯酶;豌豆;酶活表征;有机磷和氨基甲酸酯类农药;酶抑制法【作者】黄嫒;马志强;王玮;宋燕飞;李荣;陈强;陈祥贵;杨潇【作者单位】西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039;西华大学食品与生物工程学院,四川成都,610039【正文语种】中文农药的大规模广泛使用虽然促进了农业的发展，但是残留问题也造成了严重安全风险[1]。
据统计，中国每年农药中毒人数高达上万人，其中70%以上是有机磷农药中毒[2]。
因此采用快速农残检测方法普查食品和环境中的农药残留是农残监管的重要措施，而目前广泛应用的农残快检方法为酶抑制法。
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植物酯酶提取工艺：
（1）酶活测定条件的优化，如pH值，时间，底物浓度，显色剂用量及浓度等。
（2）植物酯酶或胆碱酯酶的溶剂提取条件的确定如：溶液的种类、固液比、温度、时间等。
（3）纯化条件如超滤、凝胶、离子交换等条件的确定。
（4）经纯化后的纯酶的酶学性质如：热稳定性、pH稳定性、金属对酶活性的影响。
1、标准曲线的绘制
称取0.0036gα-萘酚（分子量：144.17），溶解于无水乙醇中，定容至100mL，得0.25mmol/L溶液。
分别移取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mLα-萘酚溶液，用磷酸缓冲液稀释至10mL。
在各比色管中分别加入0.5mL0.08%固兰B盐3.6%SDS显色剂，置于30℃恒温水浴5min后做光谱扫描，并在最高吸收峰测吸光度。
用测得的结果做标准曲线。
1）PH的影响
磷酸缓冲液：6、6.5、7、7.5、8
比较：以缓冲液为空白作基线，固兰B盐+缓冲液扫描，求出A0，比较大小。
不同PH条件下，各最大吸收波长偏移情况，及A值大小。
不同pH条件下，其标准曲线线性
2）固兰B盐的浓度影响
1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.08%、0.02%等，求出A0，以缓冲液为空白作基线
不同浓度下，做标准曲线
将固兰B盐放置，每天测A。
，估计能放置保存天数。
3）加入SDS浓度
0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、3.6空白，A0
取一中间浓度的扫描求最大吸收波长，及A
于冰箱及常温下放置，求A、A0
确定最佳浓度及固兰B盐能放置的时间。
取0.5mL稀释酶液，加入4.5mL缓冲液（可定容至5mL），加入0.5mLα-
乙酸萘酯溶液，30度，反应5min，缓冲液定容至10mL，加入0.5mL固兰B盐，置于30℃恒温水浴5min
1)乙酸萘酯乙醇溶液浓度影响
0.04、0.02、0.015、0.0005等测（萘酯+显色剂）A0，及A，最大吸收波长
2）加入乙酸萘酯溶液体积的影响
4）最后恒温水浴时间、温度的选择
5）初始缓冲液pH选择
6）酶液的稀释倍数
于固液比（1：7）水,于35度，150rpm ,振荡30min提取，4度，
1）固液比
2）温度选择
3）反应时间
4）提取液的种类（水、不同pH）5）转速。