液相色谱_紫外检测法测定蜂蜜中的_呋喃果糖苷酶活性_张其安

２０１２年０４～０６月中旬刊第６３卷 中国蜂业 ＡＰＩＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
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4℃保存。 1.6 衍生化反应条件 将1.3中反应液稀释10倍，取50μL，加入 100μL衍生剂，充分混匀，于70℃恒温水浴中衍 生60min，冷却后用水定容至2 mL。流动相稀释 50倍，以0.45μm的微孔滤膜过滤后备高效液相 色谱仪测定。 1.7 色谱条件 色谱柱：Globalsi SP-120-5-APS-P柱 （4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈+水 (0.01mol/L磷酸二氢钠)=80+20；流速：0.8mL/ min；检测波长：303nm；柱温：40℃；进样量： 20μL。 2 结果与分析 2.1 色谱条件优化结果 由于单糖、二糖为高度亲水性化合物，在 C18柱上保留时间较短且不能得到较好的分离， 高效液相色谱法分析糖类物质时一般需专用的氨 基柱。实验中考察了Globalsi SP-120-5-APS-P柱 （4.6mm×150mm，5μm）、SHIMADZU VPODS C18柱（4.6mm×150mm，5μm）为分离色 谱柱对蜂蜜中蜜二糖的分离效果。结果表明，蜂 蜜中的还原糖经过衍生后局部结构有所改变，在 C18柱上保留有所改善 ，C18柱可以分离蜂蜜中
作者简介：张其安（１９６６－），男，会计师，本科，研究方向为蜂产品加工与检测。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｄｈｋｆｙ＠１２６．ｃｏｍ。通讯作者杨少波（１９７８－），男，硕 士，研究方向为蜂产品加工与检测。Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｂｏｙｇ＠１２６．ｃｏｍ
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中国蜂业 ＡＰＩＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＣＨＩＮＡ ２０１２年０４～０６月中旬刊第６３卷
[文章编号]0412-4367（2012）06-92-05
液相色谱－紫外检测法测定蜂蜜中的β－ 呋喃果糖苷酶活性
张其安１ 张庆娜２ 吕祝章２ 卢德梅１ 杨少波１
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硝基水杨酸（DNS）法和测总还原糖和葡萄糖联 用法操作复杂、误差较大。薄层色谱法、高效液 相色谱法是基于对β-呋喃果糖苷酶催化蔗糖水解 反应体系中果糖含量的变化的测定反映酶的转移 活力。但是，蜂蜜基质中含有多种单糖及寡糖严 重影响了该方法的准确性。因此，以上方法均不 适于蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶活力的测定。离子色 谱脉冲安培法用于单糖、二糖、小分子寡糖的测 定，可准确测定酶促反应体系中各种糖含量的变 化，具有灵敏度高、选择性好等特点。但是，离 子色谱对试剂、进样样品要求较高，样品前处理 步骤要求严格，而且需要专门的离子色谱和脉冲 安培检测器 ，不易在国内中小型蜂蜜生产企业 内普及。 β-呋喃果糖苷酶可专一的催化蜜三糖水解 为蜜二糖和果糖（图 1）。蜜二糖是一种还原性 二糖，并且蜂蜜中不含有该糖。本文根据此原 理，以蜜三糖为反应底物，以对氨基苯甲酸对酶 促反应产物蜜二糖进行衍生化，通过高效液相色 谱-紫外检测法测定反应体系中蜜二糖的生成量， 准确计算β-呋喃果糖苷酶的活性。该方法准确、 可靠，操作简单，可以满足蜂蜜中β-呋喃果糖苷 酶活性测定的要求。
1.4 样品处理 分别准确称取1.2中标准曲线工作液和待测样 品1g，置于50mL离心管中，加入1mL10%的蜜三 糖溶液，充分震荡使样品完全溶解，于恒温振荡
培养箱中60℃反应15h。 1.5 衍生剂的配制 称取0.7g对氨基苯甲酸、1g冰乙酸、0.1g氰 基硼氢化钠于具塞试管中，以10 mL甲醇定容，
图1 β-呋喃果糖苷酶催化蜜三糖水解反应
图2 蜜二ＬＴＵＲＥ ＯＦ ＣＨＩＮＡ ２０１２年０４～０６月中旬刊第６３卷
图3 空白蜂蜜样品色谱图
图4 蜂蜜样品添加蜜二糖色谱图
图5 阳性样品（市售蜂蜜样品2号）色谱图
(1 山东华康蜂业有限公司，日照 276500；2 日照职业技术学院，日照 276826) 摘 要：建立了一种高效液相色谱法测定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）活性的 方法，以浓度为10%的蜜三糖为反应底物，对氨基苯甲酸（p-AMBA）衍生化后，紫外检测法测蜜二 糖的生成量，计算β-呋喃果糖苷酶活性。结果表明：该方法检出限为10U/kg，线性范围为20～240 U/ kg，r≥0.9988；回收率为85.6%～115.5%，RSD为2.2%～4.5%，该方法准确、灵敏，适用于蜂蜜中β呋喃果糖苷酶活性的测定。 关键词：高效液相色谱；紫外检测；蜂蜜；β-呋喃果糖苷酶
[9]
1 材料与方法 1.1 材料与试剂 纯蜂蜜样品 山东华康蜂业有限公司养蜂基地 自产；对照样品 购自超市。 对氨基苯甲酸 上海化学试剂供应站试剂厂； 氰基硼氢化钠 德国Emerck公司；D-(+)-蜜三糖 （Raf，≥98%）和-(+)-蜜二糖（Mel，99%） 上 海化学试剂公司；β-呋喃果糖苷酶（酶活性为 333U/mg） 美国SIGMA公司。甲醇、乙腈、冰乙 酸（均为色谱纯）天津市光复精细化工研究所； 磷酸氢二钠（分析纯） 天津市科密欧化学试剂开 发中心；水为超纯水。 1.2 仪器与设备 岛津LC-10AVP Plus高效液相色谱仪（配有 SPD-10AVP紫外检测器、DGU-20A3在线脱气 机、LC-20ATXL泵、CTO-10ASVP柱温箱、手动 进样器、LC-Solution数据处理软件） 日本岛津公 司；DZKW-D-2型恒温水浴锅 北京市永光明医疗 仪器厂；SHIMADZU AUY220型分析天平 日本岛 津公司；DHZ-DA恒温振荡培养箱 太仓市豪诚实 验仪器制造有限公司。 1.3 标准液的配制 准确称取β-呋喃果糖苷酶（333U/mg），用 超纯水配制成酶活力为2000U/kg的中间标准液， 然后稀释成240 U/kg、160U/kg、80U/kg、40U/ kg、20U/kg、10U/kg标准曲线工作液。
2.3 方法的回收率和精密度实验 用不含β-呋喃果糖苷酶的蜂蜜进行添加回 收和精密度试验，样品中分别添加β-呋喃果糖 苷酶至样品含量为80U/kg、40U/kg、20U/kg、 10U/kg，充分混匀。在上述优化好的反应条件及 高效液相色谱条件下，进行添加回收率和精密度 实验，结果见表2。结果表明：本方法回收率在 85.6%～115.5%之间，室内四个水平相对标准偏
。然而，蜂蜜是一种极易掺假的产品，在利益
的驱使下，有些不法者向蜂蜜中掺入一些糖类物 质制造假蜂蜜，以天然蜂蜜的形式销售，严重的 损害了消费者利益和我国天然蜂蜜的产品信誉。 β-呋喃果糖苷酶又称转化酶，是一种蔗糖 酶，主要来自真菌、酵母菌和细菌等微生物，可 催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖
[3-4]
。通过β-呋喃
表1 回归方程、相关系数、检出限及线性范围 成分 回归方程 β－呋喃果糖苷酶 Ｙ＝３３６．８Ｘ－２５．３１３ ｒ ０．９９８８ 检出限 （Ｕ／ｋｇ） １０ 线性范围 ２０ Ｕ／ｋｇ－２４０ Ｕ／ｋｇ
表2 方法加标回收率和精密度试验（%）
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蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露， 与自身分泌物结合后，在巢脾内转化、脱水贮存 至成熟而成的天然甜物质，国家相关标准规定不 得添加或混入任何淀粉类、糖类、代糖类物质
2] [1-
果糖苷酶水解淀粉以及甜菜、甘蔗等含糖植物的 蔗糖产生的转化糖的主要成分是葡萄糖和果糖， 在蜂蜜中掺入这种转化糖而生产的掺假蜂蜜产品 在感官指标和部分理化指标与天然蜂蜜极为相 似，即使已颁布的国标也难以辨别其真伪 [5]。从 2009年开始，我国出口欧盟的蜂蜜全部都要检测 β-呋喃果糖苷酶活性，以此来判定中国产蜂蜜是 否掺假。β-呋喃果糖苷酶活力的检测方法主要有 3,5-二硝基水杨酸（DNS）法、测总还原糖和葡 萄糖联用法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高 效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法[6-8]等。3,5-二
（１ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｈｕａｋａｎｇ Ｈｏｎｅｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏ． Ｌｔｄ， Ｒｉｚｈａｏ ２７６５００， Ｃｈｉｎａ；２ Ｒｉｚｈａｏ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ， Ｒｉｚｈａｏ ２７６８２６， Ｃｈｉｎａ）
Abstract: Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ １０％ ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ａｓ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ． ｐ－ＡＭＢＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｐｒｅ－ｃｏｌｕｍｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｌｙｔｅｓ． Ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ β－ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｓ ｏｆ ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ β－ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ １０Ｕ／ｋｇ， ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅｓ ｉｓ ２０～２４０ Ｕ／ｋｇ． Ｔｈｅ ｓｐｉｋｅｄ ｒｅｃｏｖｅｒｉｓ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ８５．６％～１１５．５％， ＲＳＤ ｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ２．２％～４．５％． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ａｃｃｕｒａｔｅ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ． Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ β－ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｏｎｅｙ． Key words: ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ； ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ； ｈｏｎｅｙ； β－ｆｒｕｃｔｏｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ
[10]
的葡萄糖和果糖，但是无法将蜜二糖衍生物与蜂 蜜中其它成分分开。Globalsi SP-120-5-APS-P柱 为NH2-柱，能将蜜二糖与蜂蜜中其它还原糖很好 的分离，因此选择Globalsi SP-120-5-APS-P柱为 该方法的分离色谱柱。 本文以乙腈-水体系作为流动相，考察了不 同配比乙腈-水体系对蜂蜜中蜜二糖的分离情况。 结果表明，乙腈+水体=80+20的流动相配比可将 蜜二糖衍生物与其它成分分开。但是在测定过程 中发现各个峰在Globalsi SP-120-5-APS-P柱上的 保留时间会随进样次数逐渐提前。排除因色谱柱 过载等原因，可能是因样品成分过于复杂，样 品、流动相、固定相之间的分配不平衡导致。在 流动相中添加0.01mol/L磷酸二氢钠，改变流动 相极性，利于样品在流动相、固定相间的分配平 衡，可解决保留时间提前的问题。 2.2 方法的线性范围和检出限 将1.2中标准曲线工作液在以上优化后的反 应条件及高效液相色谱条件下分析。以标准峰面 积对标准工作液的浓度进行线性回归，做标准曲 线，并进行线性回归。结果表明：β-呋喃果糖苷 酶活性在20～240 U/kg 的线性回归方程和相关系 数以及检出限（以S/N=3计），结果见表1。