基因型鉴定 中科院版
反向点杂交法快速检测HPV基因型的临床应用
1998 ; 25 (1) 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys.
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7 型 HPV 质粒 DNA 经过 RDB 后 , 均与 其相应的探针产生阳性反应 , 呈现蓝紫色的清 晰斑点 , 而且背景着色极淡 (图 3) .
物进行 RDB 检测 , 获得了满意的结果. 图 4 为其 中 7 例 患 者 的 检 测 结 果. 总 的 结 果 见 表 2.
11213 将合成的 7 种探针通过碳二亚胺的介 导 , 固定在尼龙膜条上 , 形成 7 个点. 然后与 相应 7 型 HPV DNA 的 PCR 扩增产物杂交 , 具体步骤如下 : 用已固定有 7 种探针的膜条浸 入 2 ×SSC 液中 , 再加入 PCR 扩增产物 20μl , 于 100 ℃水浴中变性 10 min , 立即放入 52 ℃水 浴中振摇 30 min , 以完成杂交. 然后将膜条 用 015 ×SSC 液 (先预热至 52 ℃) 洗涤数次 后 , 转入链霉抗生物素蛋白2辣根过氧化物酶 溶液中 , 室温振摇 15 min. 膜条再经 2 ×SSC 液洗涤后 , 用 TMB 显色. 杂交用的尼 龙 膜 (Biodyne C) 购自美国 Pal HPV D NA 经 PCR扩增片段的 8 %聚丙烯酰 胺凝胶电泳图
1 : HPV6B ( 335 bp ) ; 2 : HPV11 ( 311 bp ) ; 3 : HPV16 ( 267 bp ) ; 4 : DNA/ Hind Ⅲ; 5 : HPV18 ( 240 bp ) ; 6 : HPV31 ( 234 bp ) ; 7 : HPV33
图 3 7 型 HPV质粒 D NA 在 PCR扩增后与其相应 探针的反向点杂交
我们收集了旧存的子宫颈癌组织的石蜡包 埋样本共 32 例 , 新鲜宫颈癌活检样本 6 例 , 下生殖道尖锐湿疣活检样本 20 例 , 总共 58 例. 按已确立的方法分别提取各样品的细胞 DNA , 再用 GP3 , GP4 , 和 GP5 三种不同引 物 分别对各样品DNA进行扩增 . 再将扩增产
细胞基因型鉴定
细胞基因型鉴定细胞基因型鉴定是一种通过分析细胞的基因组来确定个体基因型的技术手段。
细胞基因型鉴定在医学、生物学研究和法医学等领域有着重要的应用价值。
本文将介绍细胞基因型鉴定的原理、方法和应用。
一、细胞基因型鉴定的原理细胞基因型鉴定的原理基于DNA的序列差异。
DNA是构成基因的分子，不同个体的DNA序列存在差异，这些差异可以通过分子生物学技术进行检测和分析。
细胞基因型鉴定主要通过PCR扩增和DNA测序等方法来鉴定个体的基因型。
二、细胞基因型鉴定的方法1. PCR扩增：PCR是一种常用的DNA扩增技术，通过引物将目标DNA序列扩增为足够数量的DNA片段，为后续的分析提供充足的模板。
PCR扩增可以选择性地扩增目标基因片段，从而实现基因型鉴定。
2. DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的方法，通过测序仪将PCR扩增得到的DNA片段进行测序，可以得到DNA序列信息。
根据DNA序列的差异，可以判断个体的基因型。
三、细胞基因型鉴定的应用1. 医学领域：细胞基因型鉴定可以用于遗传病的筛查和诊断。
一些遗传病是由特定基因突变引起的，通过细胞基因型鉴定可以检测个体是否携带这些突变基因，从而提前预防和治疗。
2. 生物学研究：细胞基因型鉴定可以用于物种鉴定和亲缘关系分析。
通过比较不同个体的基因型，可以判断它们是否属于同一物种，以及它们之间的亲缘关系。
3. 法医学：细胞基因型鉴定在刑事侦查和亲子鉴定中有着重要的应用。
通过比对被鉴定个体的DNA序列与现场留下的DNA样本进行比对，可以确定个体的身份和亲子关系。
细胞基因型鉴定技术的发展为医学、生物学研究和法医学等领域提供了强有力的工具。
随着技术的不断进步，细胞基因型鉴定的精确性和灵敏度将进一步提高，为人类的健康和社会稳定做出更大的贡献。
肿瘤个体化治疗基因检测.doc
第一部分项目背景一、肿瘤临床转化医学背景21世纪伊始，人类基因组研究成果斐然，在循证医学的浪潮推动下，基因组学、RNA组学和反应组学等生命科学与医学领域交融，转化，率先在肿瘤个体化靶向治疗领域进入了NCCb和ASCO CSCO各种肿瘤临床治疗规范。
在一系列转化应用中，使患者明显获益，各种基于循证医学的肿瘤多中心、大样本、随机性双盲的前瞻性研究结果，共同提示基因检测用于肿瘤转化医学靶向治疗和个体化化疗，不仅是肿瘤医药学领域里程碑式的革命，也将诊断病理学科带入了分子病理、个体化治疗的新时代。
美国Kalorama In formation 公司在2007年发表了关于分子诊断的专题市场调查报告“分子诊断：全球主要市场”（Molecular Diag nostics: Major World Market ）。
报告预计从2006年到2016年分子诊断市场的平均年增长率达到41.5%。
药物基因组学在这10年间将有184%勺平均年增长率，预计癌症相关基因的检测平均年增长率将达到68%据我国卫生部统计，20世纪90年代我国肿瘤发病率已上升为127例/10万人。
近年来我国每年新增肿瘤患者160〜170万人，总数估计在600万人左右，肿瘤已经成为我国的第一死亡原因。
肿瘤患者对治疗有效性的提高需求迫切，2007年我国医院肿瘤用药销售额累计约为158.7亿元人民币，同比上一年增长高达61.2%，大大高于其它医疗药品的市场增长幅度。
但抗肿瘤药物广泛应用的同时，给患者带来严重的问题：治疗的有效率不高、针对性不强、副反应较多、费用昂贵等。
基于药物基因组学临床检测的肿瘤个体化治疗为上述问题解决带来曙光，美国ASCO已公布的多个临床实验已证实，通过检测肿瘤患者肿瘤组织中的基因突变靶点及基因SNP分型、mRNA基因定量表达，为临床提供靶向及个体化化疗的依据，能显著提高治疗的有效率，降低药物毒副作用。
如：2009年1月美国ASCO消化肿瘤会议总结：选择K-ras野生基因型患者应用EGFR单抗使美国2008年节约了601亿美金，并把这一晚期患者生存期提高了11.5个月。
H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠的鉴定及繁育
H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠的鉴定及繁育唐志元;王燕;吕靓;李林格;张华【摘要】目的饲养、繁殖和鉴定H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除小鼠,获得双纯合子H2-Eb1-/-+H2-Ab1-/-及双野生型H2-Eb1+/++H2-Ab1+/+小鼠,为深入研究H2-Eb1、H2-Ab1的基因功能奠定基础.方法基因敲除小鼠经适应性饲养2 w 后,分别将雌性杂合子和雄性杂合子小鼠合笼饲养并繁殖,提取鼠尾DNA,利用PCR 法鉴定其基因型.生产后代中的野生型和纯合子小鼠用于后续的生物学功能研究,杂合子小鼠用于繁殖及保种.结果小鼠成功繁殖,其中双纯合子H2-Eb1-/-+H2-Ab1-/-20只(20％),双野生型H2-Eb1+/++H2-Ab1+/+26只(26％),未鉴定出基因型54只(54％).成功获得H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除纯合子小鼠,并建立了饲养、繁殖和鉴定方法.结论采用雌性和雄性H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除杂合子小鼠交配,不仅可以获H2-Eb1+H2-Ab1双基因敲除纯合子小鼠,而且有利于长期饲养与繁殖.%Objective To feed,breed and identify the H2-Eb1+H2-Ab1 double gene knockout mice,in or-der to get the double homozygote type of H2-Eb1 -/- + H2-Ab1 -/- mice and double wild type of H2-Eb1 +/+ +H2-Ab1 +/+ mice,thereby laying the foundation for the study of the H2-Eb1and the H2-Ab1. Methods After the adaptive feeding of the knockout mice for 2 weeks,the female heterozygote type mice and the male heterozygous type mice were mated.The DNA of rat tail was extracted;the genotyping was determined using PCR method.The wild type mice and the homozygous type will be used for the following biological function research;the heterozygous type mice will be used for reproduction and survive.Results After successful reproduction,There were 20 doublehomozygote type of H2-Eb1 -/- + H2-Ab1 -/- (20％), 26 double wild type of H2-Eb1 +/+ +H2-Ab1 +/+ (26％),54 of unidentified the genes (54％).the homozy-gous type double knockout mice of H2-Eb1+H2-Ab1 were successfully established,and the breeding,re-production and appraisal method were done expectedly.Conclusion Mating of the male and female of het-erozygous type of double knockout mice of H2-Eb1 + H2-Ab1,not only can give birth to he homozygous type double knockout mice of H2-Eb1 + H2-Ab1,but also good for the reproduction and breeding long-term.【期刊名称】《新疆医科大学学报》【年(卷),期】2017(040)010【总页数】4页(P1261-1264)【关键词】双基因敲除;小鼠;基因鉴定;繁育方法【作者】唐志元;王燕;吕靓;李林格;张华【作者单位】新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,乌鲁木齐 830054;新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,乌鲁木齐830054;新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科,乌鲁木齐 830054【正文语种】中文【中图分类】Q784Abstract: Objective To feed, breed and identify the H2-Eb1+H2-Ab1 double gene knockout mice, in order to get the double homozygote typeof H2-Eb1-/-+H2-Ab1-/- mice and double wild type of H2-Eb1+/++H2-Ab1+/+ mice, thereby laying the foundation for the study of the H2-Eb1and the H2-Ab1. Methods After the adaptive feeding of the knockout mice for 2 weeks, the female heterozygote type mice and the male heterozygous type mice were mated. The DNA of rat tail was extracted; the genotyping was determined using PCR method. The wild type mice and the homozygous type will be used for the following biological function research; the heterozygous type mice will be used for reproduction and survive. Results After successful reproduction, There were 20 double homozygote type of H2-Eb1-/-+H2-Ab1-/- (20%), 26 double wild type of H2-Eb1+/++H2-Ab1+/+(26%), 54 of unidentified the genes (54%). the homozygous type double knockout mice of H2-Eb1+H2-Ab1 were successfully established, and the breeding, reproduction and appraisal method were done expectedly. Conclusion Mating of the male and female of heterozygous type of double knockout mice of H2-Eb1+H2-Ab1,not only can give birth to he homozygous type double knockout mice of H2-Eb1+H2-Ab1, but also good for the reproduction and breeding long-term. Keywords: double knockout; mice; gene identification; reproduction; mating基因敲除小鼠是建立在胚胎干细胞技术与基因同源重组等技术上的一种定向改变生物活体遗传信息的转基因动物，是研究疾病的发病机制、分子基础及寻找合适药物靶标的重要工具[1-2]。
中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析
第52卷 第3期2024年3月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .3M a r .2024网络出版时间:2023-09-04 14:29 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.03.001网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20230831.1424.010中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析[收稿日期] 2022-12-14[基金项目] 国家自然科学基金面上项目(32172792);国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(C A R S -44-K X J 7);福建农林大学硕士生导师团队项目;福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)科研扶持项目;福建省省级大学生创新创业训练计划项目(202310389027,X 202310389084) [作者简介] 郭思佳(1998-),女,四川什邡人,在读硕士,主要从事蜜蜂分子生物学研究㊂E -m a i l :g u o s i j i a 1998@163.c o m [通信作者] 付中民(1972-),男,河北唐山人,副教授,主要从事蜜蜂科学研究㊂E -m a i l :z m f @f a f u .e d u .c n郭 睿(1987-),男,安徽六安人,副教授,主要从事昆虫-病原互作研究㊂E -m a i l :r u i gu o @f a f u .e d u .c n 郭思佳1,张凯遥1,荆 欣1,高旭泽1,冯佩林1,邹培缘1,张浩宇1,陈大福1,2,郭 睿1,2,付中民1,2(1福建农林大学动物科学学院(蜂学学院),福建福州350002;2福建省蜂疗研究所,福建福州350002)[摘 要] ʌ目的ɔ系统鉴定和分析中华蜜蜂(A pi s c e r a n a c e r a n a )吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础㊂ʌ方法ɔ基于前期已获得的高质量中华蜜蜂纳米孔长读段测序数据,通过B l a s t 工具将全长转录本比对N r 数据库筛选出吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本㊂利用g f f c o m p a r e 软件将全长转录本与东方蜜蜂(A pi s c e r a n a )参考基因组上注释的转录本进行比较,鉴定未注释的新基因和新转录本㊂利用T A P I S p i p e l i n e 预测和分析吞噬与包囊作用相关基因的可变多聚腺苷酸化(a l t e r n a t i v e p o l y a d e n yl a t i o n ,A P A )位点,并通过T B t o o l s 软件鉴定A P A 位点上游的基序(m o t i f )㊂使用A s t a l a v i s t a 软件鉴定可变剪接(a l t e r n a t i v e s p l i c i n g ,A S )事件,并通过I G V 浏览器进行结构可视化㊂通过R T -P C R 验证A S 事件的真实性㊂ʌ结果ɔ共鉴定到中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关的基因66个和全长转录本395条,发掘出东方蜜蜂参考基因组未注释的2个新基因和303条新转录本㊂对参考基因组已注释的34个基因进行了结构优化,分别延伸了18个基因的5'端和12个基因的3'端,同时延长了4个基因的5'端和3'端㊂共鉴定到含有1个及以上A P A 位点的吞噬与包囊作用相关基因47个,其中多于5个A P A 位点的基因最多,为32个㊂在A P A 位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:G R B G C N K S D A A C A A Y T R B -G C B M R N G G B Y A Y T A YW C N VWN G G ㊂共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件296次,其中包括131次可变3'端剪接(a l t e r n a t i v e 3's pl i c e s i t e ,A 3S S )㊁85次内含子保留(i n t r o n r e t e n t i o n ,I R )㊁70次可变5'端剪接(a l t e r n a t i v e 5's p l i c e s i t e ,A 5S S )和10次外显子跳跃(e x o n s k i p p i n g,E S )㊂R T -P C R 结果显示,扩增的目的片段大小符合预期,证实了随机选择的2次A S 事件的真实性㊂ʌ结论ɔ系统鉴定了中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本以及A S 事件和A P A 位点,优化了东方蜜蜂参考基因组注释的吞噬与包囊作用相关基因的结构㊂[关键词] 中华蜜蜂;吞噬作用;包囊作用;全长转录本;纳米孔测序;可变剪接;可变多聚腺苷酸化[中图分类号] S 895.137[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)03-0001-10I d e n t i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s o f f u l l -l e n g t h t r a n s c r i p t s o f ge n e s r e l a t i v e t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a G U O S i j i a 1,Z H A N G K a i y a o 1,J I N G X i n 1,G A O X u z e 1,F E N G P e i l i n 1,Z O U P e i yu a n 1,Z H A N G H a o y u 1,C H E N D a f u 1,2,G U O R u i 1,2,F U Z h o n gm i n 1,2(1C o l l e g e o f A n i m a l S c i e n c e s (C o l l e g e o f B e e S c i e n c e ),F u j i a n A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,F u z h o u ,F u ji a n 350002,C h i n a ;2A p i t h e r a p y R e s e a r c h I n s t i t u t e o f F u j i a n P r o v i n c e ,F u z h o u ,F u ji a n 350002,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔS y s t e m a t i c i d e n t i f i c a t i o n a n d i n v e s t i g a t i o n o f g e n e s a n d f u l l -l e n g t h t r a n s c r i pt sa s s o c i a t e d w i t h p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A p i s c e r a n a c e r a n a w e r e c o n d u c t e d,a i m i n g t o p r o v i d eb a-s i s f o r f u r t h e r f u nc t i o n a l s t ud y o n re l a t e d g e n e s a n d i s of o r m s.ʌM e t h o dɔB a s e d o n p r e v i o u s l yg a i n e dhi g h-q u a l i t y N a n o p o r e l o n g r e a d s e q u e n c i n g d a t a f r o m A p i s c e r a n a c e r a n a,t h e m a p p i n g o f f u l l-l e n g t h t r a n-s c r i p t s t o N r d a t a b a s e w a s c o n d u c t e d b y B l a s t t o o l t o i d e n t i f y f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s r e l a t i v e t o p h a g o c y t o-s i s a n d c a p s u l a t i o n.T h e f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e a n n o t a t e d o n r e f e r e n c e g e n o m e u s i n g t h e g f f c o m p a r e s o f t w a r e t o i d e n t i f y u n a n n o t a t e d n o v e l g e n e s a n d f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s.P r e d i c t i o n a n d a n a l y s i s o f a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o n(A P A)s i t e s w e r e c o n d u c t e d w i t h T A P I S p i p e l i n e,f o l l o w e d b y i d e n t i f i c a t i o n o f m o t i f s u p s t r e a m o f A P A s i t e s b y T B t o o l s s o f t w a r e.A s t a l a v i s t a s o f t w a r e w a s e m p l o y e d t o i d e n t i f y a l t e r n a t i v e s p l i c i n g(A S)e v e n t s f o l l o w e d b y s t r u c t u r a l v i s u a l i z a t i o n b y I G V b r o w s e r.R T-P C R w a s p e r f o r m e d t o v a l i d a t e t h e a u t h e n t i c i t y o f A S e v e n t s.ʌR e s u l tɔA t o t a l o f66g e n e s a n d395f u l l-l e n g t h t r a n-s c r i p t s r e l e v a n t t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A p i s c e r a n a c e r a n a w e r e d i s c o v e r e d,i n c l u d i n g2n e w g e n e s a n d303n e w t r a n s c r i p t s u n a n n o t a t e d o n t h e r e f e r e n c e g e n o m e o f A p i s c e r a n a.T h e s t r u c t u r e o f34 a n n o t a t e d g e n e s o f t h e r e f e r e n c e g e n o m e w a s o p t i m i z e d,a m o n g w h i c h5'e n d s o f18g e n e s a n d3'e n d s o f12 g e n e s w e r e e x t e n d e d,a n d5'e n d s a n d3'e n d s o f4g e n e s w e r e p r o l o n g e d.A d d i t i o n a l l y,47g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n w e r e i d e n t i f i e d t o c o n t a i n o n e o r m o r e A P A s i t e s.T h e n u m b e r o f g e n e s w i t h m o r e t h a n5A P A s i t e s w a s32.M u l t i p l e m o t i f s w e r e i d e n t i f i e d i n u p s t r e a m o f A P A s i t e s,a n d t h e c o n s i s t-e n t s e q u e n c e w a s G R B G C N K S D A A C A A Y T R B G C B MR N G G B Y A Y T A YW C N VWN G G.I n t o t a l,296A S e v e n t s w e r e i d e n t i f i e d,i n c l u d i n g131a l t e r n a t i v e s3's p l i c e s i t e s(A3S S),85i n t r o n r e t e n t i o n(I R),70a l t e r-n a t i v e5's p l i c e s i t e s(A5S S)a n d10e x o n s k i p p i n g(E S).R T-P C R s h o w e d t h a t t h e s i z e s o f a m p l i f i e d f r a g-m e n t s w e r e c o n s i s t e n t w i t h e x p e c t e d s i z e s,c o n f i r m i n g t h a t t h e a u t h e n t i c i t y o f t h e2r a n d o m l y s e l e c t e d A S e v e n t s.ʌC o n c l u s i o nɔG e n e s a n d f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s r e l a t i v e t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A p i s c e r-a n a c e r a n a a n d A S e v e n t s a s w e l l a s A P A s i t e s w e r e s y s t e m a t i c a l l y i d e n t i f i e d,a n d s t r u c t u r e s o f p h a g o c y t o-s i s a n d c a p s u l a t i o n-a s s o c i a t e d g e n e s w e r e o p t i m i z e d.K e y w o r d s:A p i s c e r a n a c e r a n a;p h a g o c y t o s i s;c a p s u l a t i o n;f u l l-l e n g t h t r a n s c r i p t s;N a n o p o r e s e q u e n-c i n g;a l t e r n a t i v e s p l i c i n g;a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o n蜜蜂是自然界最重要的授粉昆虫,在生态平衡和粮食安全方面发挥举足轻重的作用㊂中华蜜蜂(A p i s c e r a n a c e r a n a),简称中蜂,是东方蜜蜂(A p i s c e r a n a)的指名亚种,也是我国养蜂生产中使用的主要蜂种之一,经过长期的适应性进化已高度适应我国地理环境,具有重要的生态和经济价值[1]㊂近年来,以牛津纳米孔(N a n o p o r e)长读段测序技术为代表的第三代测序技术不断革新㊁突飞猛进,在组装染色体级别基因组和揭示转录组复杂性等方面应用广泛㊂由于具有超长读长的显著优势,牛津纳米孔测序技术已成功应用于可变剪接体(i s o-f o r m)㊁可变剪切(a l t e r n a t i v e s p l i c i n g,A S)和可变多聚腺苷酸化(a l t e r n a t i v e p o l y a d e n y l a t i o n,A P A)位点等的精确鉴定和分析[2-3]㊂目前,基于牛津纳米孔测序技术的全长转录组研究已见诸于橄榄果蝇(B a c t r o c e r a o l e a e)[4]㊁亚洲飞蝗(L o c u s t a m i g r a t o-r i a)[5]和椰蛀犀金龟(O r y c t e s r h i n o c e r o s)[6]等昆虫中㊂东方蜜蜂的全长转录组研究报道迄今仅有2例,L i u等[7]对长白山东方蜜蜂越冬期抗寒性的全长转录本进行了分析,确定了5941个完整的O R F 序列;蔡宗兵等[8]在中华蜜蜂中肠中鉴定到265个与细胞色素P450相关的全长转录本㊂此前,本课题组利用牛津纳米孔测序技术对蜜蜂的2种真菌病原蜜蜂球囊菌(A s c o s p h a e r a a p i s)和东方蜜蜂微孢子虫(N o s e m a c e r a n a e)进行了较为系统的全长转录组研究[9-14],但中蜂的全长转录组研究总体上仍较为滞后㊂作为无脊椎动物,蜜蜂等昆虫缺乏获得性免疫,但拥有包括细胞免疫和体液免疫在内的天然免疫系统㊂当侵入昆虫血淋巴的病原体被宿主细胞识别后,宿主的细胞免疫随即被激活,进而合成与分泌抗菌肽,抵御病原侵染[15]㊂吞噬和包囊作用是昆虫的2种重要细胞免疫反应,吞噬能直接杀死真菌孢子和外源小分子,而包囊能抵御如寄生虫等无法被吞噬的入侵者[16]㊂W a n g等[17]研究发现,棉铃虫(H e l i c o v e r p a a r m i g e r a)20E-H a E c R-H a U S P复合物刺激血淋巴中H a C T L1基因的表达,进而提高2西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷H a C T L1蛋白的合成与分泌,并促进细胞吞噬和包囊作用,抵抗中华卵索线虫(O v o m e r m i s s i n e n s i s)的侵袭㊂在果蝇(D r o s o p h i l a)中,TM9S F4基因突变可引起吞噬与包囊作用缺失,导致果蝇对革兰氏阴性菌更加敏感[18]㊂P a r k等[19]利用二代测序技术组装和注释了东方蜜蜂的参考基因组,但由于二代测序产生的读段较短,故该版本参考基因组仅组装到重叠群(c o n t i g)水平,东方蜜蜂参考基因组仍需要进一步完善㊂目前,人们对中蜂吞噬与包囊作用的认识非常有限,对其相关基因和全长转录组缺乏深入的研究㊂前期研究中,本课题组已利用牛津纳米孔测序技术对中华蜜蜂工蜂幼虫肠道组织进行了测序,获得了高质量的长读段数据[8]㊂在此基础上,本研究对中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本进行了系统鉴定,对东方蜜蜂参考基因组已注释的吞噬与包囊作用相关基因进行结构优化,进而发掘和分析吞噬与包囊作用相关基因的A P A位点和A S事件,并对A S事件进行分子验证,以期丰富中华蜜蜂吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本的相关信息,为深入开展相关基因和剪接体的功能研究奠定基础㊂1材料与方法1.1细胞吞噬与包囊作用相关基因与全长转录本的筛选与分析本课题组前期已完成中蜂幼虫4,5和6日龄肠道样品(A c4组㊁A c5组和A c6组)制备㊁R N A提取㊁c D N A建库及牛津纳米孔测序㊂A c4㊁A c5和A c6组测序结果分别获得了7338627,7003419和7434233条原始读段,其N50分别为1276,1306和1404b p,平均读长分别为1126,1126和1166 b p,最大长度分别为16628,12808和14359b p,质量值均达到Q12[8]㊂高质量的长读段测序数据可用于本研究中中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本的鉴定及分析㊂使用B l a s t工具(参数为默认设置)将鉴定到的所有全长转录本序列比对到G O(h t t p://g e n e o n t o l o g y.o r g/)㊁K E G G(h t t p s:// w w w.k e g g.j p/)和N r(h t t p s://f t p.n c b i.n l m.n i h.g o v/b l a s t/d b/F A S T A/)数据库,再根据注释信息筛选细胞吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本㊂1.2东方蜜蜂参考基因组中已注释细胞吞噬与包囊作用相关基因的结构优化按照本课题组已建立的技术流程[12,20],利用g f f c o m p a r e软件(参数为默认设置)将本研究中鉴定到的细胞吞噬与包囊作用相关全长转录本与中蜂参考基因组(A C S N U-2.0)上已注释的转录本进行比较,以发现未注释的新基因和转录本,并对已注释基因进行结构优化㊂如果在原有基因边界之外的区域有比对读段(m a p p e d r e a d s)支持,则将基因的非翻译区向上㊁下游延伸,以修正基因的边界㊂1.3细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A位点鉴定与分析参照杜宇等[11]报道的方法,利用T A P I S p i p e-l i n e[21]鉴定细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A 位点,参数设置为:-n o r c㊁-m e m e-m i n w6㊁-m e m e-m a x w6㊁-s p a m o-s k i p㊁-f i m o-s k i p㊂通过T B t o o l s软件[22]对细胞吞噬与包囊作用相关基因A P A位点上游50b p的序列特征进行分析,以鉴定基序(m o-t i f)㊂1.4细胞吞噬与包囊作用相关基因的可变剪接分析参照陈华枝等[13]和杜宇等[11]报道的方法,使用A s t a l a v i s t a软件[23]鉴定中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S事件类型,其中包括互斥外显子(m u t u a l l y e x c l u s i v e e x o n,M E E)㊁内含子保留(i n-t r o n r e t e n t i o n,I R)㊁外显子跳跃(e x o n s k i p p i n g, E S)㊁可变3'端剪接(a l t e r n a t i v e3's p l i c e s i t e,A3S S)和可变5'端剪接(a l t e r n a t i v e5's p l i c e s i t e,A5S S)㊂参数为默认设置㊂根据预测结果统计以上可变剪接类型数量㊂1.5细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S事件验证中蜂幼虫取自福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)蜜蜂保护课题组的实验蜂群㊂参照本课题组已建立的技术流程[24-26],从蜂群中提取巢脾,在实验室中将2日龄幼虫移至干净的48孔培养板,放入恒温恒湿箱,在温度为35ħ㊁相对湿度(R H)为90%的条件下饲养,分别剖取4,5和6日龄幼虫肠道组织,液氮速冻后迅速转移到-80ħ超低温冰箱保存,备用㊂为验证细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S事件准确性,以β-a c t i n为内参基因,随机选择2种A S 类型(A3S S㊁I R)的1个基因进行R T-P C R验证㊂根据上述基因的核酸序列设计跨剪接位点的特异性引物,交由生工生物(上海)公司合成(表1)㊂以肌动蛋白基因β-a c t i n(L O C107999330)作为内参基因,将上述制备的4,5和6日龄幼虫肠道的R N A等物3第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析质的量混合后进行反转录,获得c D N A ㊂以得到的c D N A 作为模板进行P C R 扩增,反应体系和程序参照蔡宗兵等[8]的报道进行㊂P C R 产物经3%琼脂糖凝胶电泳后使用核酸凝胶成像仪进行检测和拍照㊂表1 本研究中使用的引物序列T a b l e 1 S e q u e n c e s o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d yA S 类型T y pe of A S 基因或基因I DG e n e o r g e n e I D预测的转录本号P r e d i c t e d t r a n s c r i pt n u m b e r 序列S e qu e n c e I RL O C 107999286O N T.6127.13(444b p ),O N T.6127.3(341b p)F :5'-C T C A C G G A A C T A C C A C G G -3'R :5'-G G G A T A T T C G C C A C A A C A -3'A 3S S L O C 107999764O N T.6364.6(362b p ),O N T.6364.2(425b p)F :5'-A G A A A G A G C A T T A G G A G A -3'R :5'-G G A G T A C G T T G A A T A G G A -3'-β-a c t i n -F :5'-T T A T A TG C C A A C A C T G T C C T T T -3'R :5'-A G A A T T G A T C C A C C A A T C C A -3'注:括号中的数据为片段长度㊂N o t e :D a t a i n t h e b r a c k e t s i s t h e l e n g t h o f t r a n s c r i pt .2 结果与分析2.1 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因和全长转录本的鉴定与分析试验共鉴定到吞噬相关的基因65个和全长转录本391条,包囊作用相关的基因1个和全长转录本4条,其中包括东方蜜蜂参考基因组上未注释的2个新基因和303条新转录本㊂对鉴定到的基因进行K E G G 和G O 注释,结果有62个基因注释到22条K E G G 通路(图1);有65个基因注释到53个G O 条目,其中P 值排序前20的条目见图2㊂图中数据为注释到的基因数及其占比㊂图2同D i g i t s i n d i c a t e n u m b e r s o f g e n e s a n n o t a t e d a n d i t s r a t i o .F i g.2i s t h e s a m e 图1 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的K E G G 注释F i g .1 K EG G a n n o t a t i o n s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 4西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷图2 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的G O 注释F i g .2G O a n n o t a t i o n s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l e i n A pi s c e r a n a c e r a n a 2.2 东方蜜蜂参考基因组已注释细胞吞噬与包囊作用相关基因的结构优化试验共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的34个细胞吞噬与包囊作用相关基因的结构进行了优化,其中正链结构优化的基因为17个,负链结构优化的基因为17个;5'端延长的基因有18个,延长长度介于4~5512b p;3'端延长的基因有12个,延长长度介于1~3218b p;3'和5'端均延长的基因有4个,分别为L O C 107999172,L O C 107999330,L O C 108000752和L O C 108003556(表2)㊂表2 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因结构优化的详细信息T a b l e 2 D e t a i l e d i n f o r m a t i o n o f s t r u c t u r a l o p t i m i z a t i o n o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 基因I DG e n e I D参考序列R e f e r e n c e s e qu e n c e 优化前的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s b e f o r e o pt i m i z a t i o n 优化后的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s a f t e r o pt i m i z a t i o n 正负链P o s i t i v e o r n e ga t i v e s t r a n d 末端E n d L O C 107998143NW _016019219.11777187-17784171771675-1778417+5'L O C 108003298NW _016019863.197472-9977891999-99778-5'L O C 107995660NW _016017456.11776644-18069261774455-1806926+5'L O C 107999172NW _016019319.1419590-429628417412-429628+5'L O C 107997445NW _016019153.11089494-11037821087610-1103782-5'L O C 107999159NW _016019319.117703-2478016575-24780-5'L O C 107994640NW _016018544.15265-71014277-7101-5'L O C 107999790NW _016019364.180049-8323779245-83237-5'L O C 107994136NW _016018344.11816913-18226661816182-1822666-5'L O C 107999764NW _016019364.1946296-958611945624-958611-5'L O C 108000406NW _016019441.1709872-713105709245-713105-5'L O C 107997632NW _016019175.11062418-10727961061901-1072796-5'L O C 108000577NW _016019442.1960650-965211960161-965211-5'5第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析表2(续) T a b l e 2(c o n t i n u e d)基因I DG e n e I D参考序列R e f e r e n c e s e qu e n c e 优化前的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s b e f o r e o pt i m i z a t i o n 优化后的起止位置S t a r t a n d e n d s i t e s a f t e r o pt i m i z a t i o n 正负链P o s i t i v e o r n e ga t i v e s t r a n d 末端E n d L O C 107999330NW _016019330.11372267-13770341371781-1377034-5'L O C 108000587NW _016019442.1569024-569997568540-569997-5'L O C 108000752NW _016017512.1181972-183084181594-183084-5'L O C 107998213NW _016019219.12093759-21004742093552-2100474-5'L O C 107998677NW _016019275.1760522-765147760336-765147-5'L O C 107999232NW _016019330.1492630-495090492481-495090-5'L O C 108001305NW _016019552.1187553-189571187438-189571-5'L O C 107995080NW _016017456.1516106-518939516101-518939+5'L O C 108003556NW _016017567.12875991-28786182875987-2878618+5'L O C 107999330NW _016019330.11371781-13770331371781-1377034-3'L O C 107992565NW _016017856.1183783-185914183783-185924+3'L O C 108001195NW _016017512.1514991-517027514991-517058+3'L O C 108000752NW _016017512.1181594-182906181594-183084-3'L O C 107998372NW _016019231.11386200-13883801386200-1388790+3'L O C 107995099NW _016018567.1136406-140802136406-141304+3'L O C 107993924NW _016018256.1253448-258337253448-258848+3'L O C 107997332NW _016017457.1590209-593951590209-594488+3'L O C 108003264NW _016017556.1192600-196182192600-196785+3'L O C 107992702NW _016017899.1 211-1820211-2563+3'L O C 107999172NW _016019319.1417412-428815417412-429628+3'L O C 108000484NW _016019441.14376457-43802124376457-4381188+3'L O C 108003556NW _016017567.12875987-28772962875987-2878618+3'L O C 108002524NW _016017455.1845010-847931845010-849556+3'L O C 122719477NW _016017767.1310646-314815310646-318033+3'L O C 107995086NW _016018567.1848331-849310848331-849899+3'2.3 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A位点鉴定与分析试验共鉴定到含有1个及以上A P A 位点的细胞吞噬与包囊作用相关基因47个(图3),其中多于5个A P A 位点的基因最多,为32个;含有1个A P A 位点的基因次之,为6个;含有2个和3个A P A 位点的基因均为4个;含有4个A P A 位点的基因为1个㊂此外,在细胞吞噬与包囊作用相关基因的A P A 位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:G R B G C N K S D A A C A A Y T R B G C B M R N G G B Y -A Y T A YW C N VWN G G (图4)㊂图3 不同数量A P A 位点中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的分布F i g.3 D i s t r i b u t i o n o f d i f f e r e n t n u m b e r s o f A P A s i t e s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l e i n A pi s c e r a n a c e r a na 图4 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的一致性基序F i g .4 M o t i f s o f g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c y t o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 6西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷2.4 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件鉴定与分析试验共鉴定到细胞吞噬与包囊作用相关基因的296次A S 事件,其中数量最多的类型是可变3'端剪接(A 3S S ,131次),其次为内含子保留(I R ,85次)和可变5'端剪接(A 5S S ,70次),数量最少的类型为外显子跳跃(E S ,10次)(图5)㊂部分细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件详细信息见表3㊂表3 细胞吞噬与包囊作用相关基因的可变剪接事件(A S)详细信息(仅展示6个)T a b l e 3 D e t a i l i n f o r m a t i o n o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g e v e n t s o c c u r r e d i n p h a g o c yt o s i s a n d c a p s u l a t i o n r e l e v a n t g e n e s (s i x d i s p l a y e d o n l y)基因I DG e n e I D转录本I DT r a n s c r i pt I D A S 事件类型A S e v e n t t y pe 参考序列R e f e r e n c e s e q u e n c e 链属S t r a n d t y pe 区域R e gi o n L O C 107999286O N T.6127.13,O N T.6127.3I RNW _016019330.1C 3148146-3148035L O C 107999764O N T.6364.6,O N T.6364.2A 3S S NW _016019364.1C 949340-949306L O C 107999286O N T.6127.7,O N T.6127.2E SNW _016019330.1C3172740-3172667L O C 107995660O N T.309.1,O N T.309.2A 5S S NW _016017456.1W 1780668-1780704L O C 107995099O N T.3315.1,O N T.3315.3A 3S S NW _016018567.1W 137912-137926L O C 107992565O N T.1750.1,O N T.1750.2I R NW _016017856.1W183906-184992注:C 和W 分别代表负义链和正义链㊂N o t e :C a n d W r e p r e s e n t n o n s e n s e s t r a n d a n d s e n s e s t r a n d ,r e s p e c t i v e l y.图5 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件类型F i g .5 T y p e s o f A S e v e n t s i n g e n e s r e l a t e d t o p h a g o c yt o s i s a n d c a p s u l a t i o n i n A pi s c e r a n a c e r a n a 2.5 中蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件验证随机选择2种A S 事件类型进行R T -P C R 验证,结果(图6)显示,L O C 107999764基因可检测到2条转录本,大小分别约为425和362b p ,与基于测序数据预测出的O N T.6364.2和O N T 6364.6的大小(表1)一致;L O C 107999286基因可检测到2条转录本,大小分别约为444和341b p,与基于测序数据预测出的O N T.6127.3和O N T.6127.13的大小(表1)一致㊂上述结果表明,本研究鉴定到的A S 事件真实可靠㊂A ,C .A 3S S 和I R 的可变剪接事件类型示意图,方框表示外显子,直线表示内含子,箭头表示转录方向;B ,D.L O C 107999764和L O C 107999286扩增产物的琼脂糖凝胶电泳A a n d C s h o w t y p e s o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g e v e n t s o c c u r r e d i n A 3S S a n d I R ,r e c t a n g l e s r e p r e s e n t e x o n s ,a n d b l a c k l i n e s r e pr e s e n t i n t r o n s ,a r r o w i n d i c a t e d i r e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n ;B a n d D s h o w a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s f o r a m pl i f i e d pr o d u c t s f r o m L O C 107999764a n d L O C 107999286图6 中蜂2个基因可变剪接事件的P C R 验证F i g .6 P C R v a l i d a t i o n o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g e v e n t s o c c u r r e d i n t w o g e n e s i n A pi s c e r a n a c e r a n a 7第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析3讨论此前,P a r k等[19]利用二代测序技术组装和注释了东方蜜蜂的参考基因组(A C S N U-2.0),该版本的基因组大小约为238M b,共包含10651个编码基因,其中注释到吞噬作用的基因和转录本数目分别为95个和182条,注释到包囊作用的基因和转录本数目分别为1个和1条㊂基于已获得的高质量牛津纳米孔测序数据,本研究共鉴定到中蜂吞噬作用相关的基因65个和全长转录本391条,包囊作用相关的基因1个和全长转录本4条,其中包括参考基因组上未注释的新基因2个和新转录本303条㊂这为持续深入开展中蜂吞噬与包囊作用相关基因和i s o-f o r m的研究提供了宝贵的材料㊂U T R主要通过顺式调节元件和R N A结合蛋白(或小R N A反式作用因子)之间的动态相互作用来调节特定的m R N A的代谢和翻译[27]㊂3'U T R 参与m i R N A或以蛋白质为基础的m R N A的降解机制,而5'U T R影响m R N A的翻译效率[28]㊂本研究共对东方蜜蜂参考基因组上已注释的34个吞噬与包囊作用相关基因结构进行优化,延长了18个基因的5'U T R(延长长度介于4~5512b p)和12个基因的3'U T R(延长长度介于1~3218b p),同时延长了4个基因的5'U T R和3'U T R㊂这为进一步开展上述中蜂吞噬与包囊作用相关基因表达调控的深入研究提供了重要基础㊂A P A通过产生编码序列或3'U T R不同的异构体,从而调节目标R N A的功能㊁稳定性㊁定位和翻译效率,促进转录组的复杂性[29]㊂哺乳动物基因组中有50%~80%的基因发生A S和A P A,进而产生数量众多的剪接异构体[30];在人(H o m o s a p i e n s)中,至少有70%的基因含有A P A位点[31-32];在小鼠(M u s m u s c u l u s)中,32%的表达基因经历A P A[33];在水稻(O r y z a s a t i v a)中,约48%的基因含有A P A 位点[34];在小麦(T r i t i c u m a e s t i v u m)中,有31%的基因含有A P A位点[35];在拟南芥(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a)中,超过60%的基因含有A P A位点[36]㊂本研究鉴定到中蜂吞噬与包囊作用相关的66个基因,其中有47(约71.2%)个基因含有1个及以上的A P A位点,表明中蜂吞噬与包囊作用相关的基因多数发生A P A㊂其中,多于5个A P A位点的基因最多,这与他人对热带爪蟾(X e n o p u s t r o p i c a l i s)[37]和蜜蜂球囊菌[11]等物种的研究报道一致㊂但在高粱[38]和草地贪夜蛾(S p o d o p t e r a f r u g i p e r d a)[39]等物种中,含2个A P A位点的基因最为丰富㊂上述结果表明,不同物种中,A P A位点数的分布规律存在差异㊂此外,在吞噬与包囊作用相关基因的A P A 位点上游鉴定到多个基序,一致性序列为:G RB G C-N K S D A AC A A Y T R B G C B M R N G G B Y A Y T A YW-C N VWN G G㊂人类基因的A P A位点上游存在1个经典m o t i f(A A U A A A),该基序同样存在于果蝇基因A P A位点上游[40]㊂M a等[35]在小麦基因的A P A位点上游鉴定到多个基序,其中出现频率最高的是A A U A A A㊁A U A U A U和U A U A U A㊂玉米(Z e a m a y s)基因的A P A位点上游出现频率前3位的基序为:A A U A A A㊁A U A U A U和U A U A U A[41]㊂本课题组在东方蜜蜂微孢子虫基因的A P A位点上游发现3个基序:A A U A A A㊁U G A U G C和G C G A C G[13],在蜜蜂球囊菌基因的A P A位点上游鉴定到4个基序:A U G A U A A㊁C A U G A A C㊁G U U C A A U和U C A U C A U[42]㊂以上结果表明,A P A上游基序具有一定的种属特异性㊂W a n g等[30]研究发现,哺乳动物基因进化过程中聚腺苷酸化位点(p o l y a d e n y l a t i o n s i t e s,P A S)选择对A P A施加进化压力的基因特征包括基因年龄㊁基因表达模式和基因功能㊂本研究鉴定到的基序与其他物种中A P A位点上游的基序均不相同,推测可能是由于高分化细胞一般倾向于使用远端P A S,导致具有较长3'U T R的转录本表达,而生长较快的细胞则倾向于使用近端P A S,产生较短的3'U T R,从而导致产生的转录本具有潜在的高表达水平[43]㊂A S 在基因的功能多样性中扮演着重要的角色,由A S 产生的蛋白质异构体在酶活性㊁定位或稳定性等方面存在差异,从而影响细胞的活动[44]㊂本研究共鉴定到吞噬与包囊作用相关基因的296次A S事件,说明中蜂吞噬与包囊作用相关基因广泛发生A S㊂其中,最丰富的A S事件类型是A3S S(131次),其次是I R(85次),数量最少的为E S(10次)㊂在硝酸盐胁迫条件下,大豆(G l y c i n e m a x L.)根系中R I 和A3S S是最常见的A S类型,其中A3S S产生的剪接异构体的相对表达量在不同硝酸盐条件差异显著[45]㊂L e v e s q u e等[46]报告了第一个关于癌症中A3S S使用的全基因组研究,强调了乳腺癌中数百个不同剪接的事件,表明A3S S在乳腺癌整体剪接网络中具有重要作用㊂I R和A3S S主要涉及调节前体m R N A产生不同的成熟剪接体,调节细胞中基因的表达,然后影响编码蛋白的功能[47]㊂本研究通过R T-P C R对随机选择2种A S事件类型进行验8西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷证,结果显示L O C107999764和L O C107999286均能扩增出2条转录本,大小与基于测序数据的预测结果一致,表明中蜂吞噬与包囊作用相关基因的A S 事件真实可靠㊂[参考文献][1]曾志将.养蜂学[M].北京:中国农业出版社,2017.Z e n g Z J.A p i c u l t u r e[M].B e i j i n g:C h i n a A g r i c u l t u r e P r e s s, 2017.[2] D e a m e r D,A k e s o n M,B r a n t o n D.T h r e e d e c a d e s o f n a n o p o r es e q u e n c i n g[J].N a t u r e B i o t e c h n o l o g y,2016,34(5):518-524.[3] W a n g Y,Z h a o Y,B o l l a s A,e t a l.N a n o p o r e s e q u e n c i n g t e c h n o-l o g 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[20]杜宇,付中民,祝智威,等.基于蜜蜂球囊菌纳米孔测序数据的基因非翻译区延长㊁S S R位点发掘及未注释基因和转录本鉴定[J].昆虫学报,2020,63(11):1345-1357.D u Y,F u Z M,Z h u Z W,e t a l.E l o n g a t i o n o f g e n i c u n t r a n s-l a t e d r e g i o n s,e x p l o r a t i o n o f S S R l o c i a n d i d e n t i f i c a t i o n o fu n a n n o t a t e d g e n e s a n d t r a n s c r i p t s b a s e d o n t h e N a n o p o r e s e-q u e n c i n g d a t a s e t o f A s c o s p h a e r a a p i s[J].A c t a E n t o m o l o g i c aS i n i c a,2020,63(11):1345-1357.[21] A b d e l-G h a n y S E,H a m i l t o n M,J a c o b i J L,e t a l.A s u r v e y o f9第3期郭思佳,等:中华蜜蜂细胞吞噬与包囊作用相关基因全长转录本鉴定及分析。
中科院853遗传学考试大纲
中科院研究生院硕士研究生入学考试《遗传学》考试大纲本《遗传学》考试大纲适用于中国科学院研究生院生命科学相关专业的硕士研究生入学考试。
遗传学的主要内容包括经典遗传学、细胞遗传学、分子遗传学和发育遗传学等。
要求考生掌握基本概念、原理，从个体、细胞、和分子水平对遗传学有较完整和系统的认识，掌握遗传学的基本规律和应用，熟悉遗传学的基本概念及规律，并能综合、灵活运用所学知识分析问题和解决问题。
考试主要内容和要求(一)遗传的染色体学说1.理解细胞分裂的意义2.掌握有丝分裂与减数分裂的异同，了解染色体在有丝分裂和减数分裂中的行为3.掌握染色体学说的主要内容(二)经典遗传学1．理解孟德尔的分离定律和自由组合定律的2．理解伴性遗传的规律3．熟练运用基因的连锁与交换定律进行重组频率的计算，掌握三点测交法对基因定位。
4．熟练掌握系谱的遗传分析方法5．了解性染色体决定性别的几种类型6．理解剂量补偿效应的概念7．掌握基因型（genotype），表现型(phenotype)，外显率(penetrance)，表现度(expressivity)的概念，掌握表型比率的计算方法。
8．了解基因突变互作类型及分子基础(三）基因的结构与功能1.了解基因概念的发展，掌握基因的类型，理解基因与DNA的关系。
2.掌握基因组结构特点和功能的对应关系。
3.理解等位基因的实质4.掌握用重组测验确定突变的空间位置关系，及用互补测验确定突基因功能的原理和方法。
5.掌握缺失作图的原理和方法。
(四)遗传分析1.掌握基因突变类型及其分子基础。
2.理解互补检测的机制和作用。
3.了解真、原核生物基因组序列的类型和各自的特点。
4.掌握真核生物基因的包装模型。
5.理解基因家族的概念和功能，了解常见的基因家族。
6.了解基因的丢失，扩增，重排的意义。
7.理解遗传标记的特点及应用。
（五）遗传重组1.掌握同源重组，位点专一重组的特点。
2.掌握基因转变（conversion）的概念和分子机制，能用分子机制解释基因转变的结果。
遗传病相关个体化医学检测技术指南(试行)
遗传病相关个体化医学检测技术指南（试行）目录1. 本指南适用范围 (2)2. 标准术语 (2)3. 遗传病检测概述.......................................................................................................5 3.1 遗传病的分类及分子基础 (5)3.2 遗传病诊断技术发展概况 (6)4. 遗传病分子检测前质量控制...................................................................................7 4.1 遗传咨询 (7)4.2 知情同意 (9)4.3 样本采集 (10)4.4 样本运输、提取与保存 (12)4.5 样本的质量控制 (14)4.6 样本信息采集与录入 (15)5. 遗传病的细胞、分子诊断技术及质量控制.........................................................15 5.1 染色体核型分析技术.......................................................................................165.2 FISH 技术 (17)5.3 实时荧光PCR 及相关技术 (19)5.4 MLPA 相关技术 (25)5.5 基因芯片技术 (27)5.6 Sanger 测序技术................................................................................................285.7 焦磷酸测序技术 (30)5.8 高通量测序技术 (33)5.9 时间飞行质谱生物芯片系统（Sequenom MassARRAY） (35)6. 常见遗传病及诊断方法选择.................................................................................37 6.1 染色体病...........................................................................................................376.2 核基因病 (39)6.3 线粒体病 (43)7. 遗传病诊断结果的报告和解释.............................................................................47 7.1 总体原则...........................................................................................................477.2 细胞遗传学实验的检测报告 (47)7.3 分子遗传学实验的检测报告 (48)8. 遗传病检测实验室设计要求.................................................................................50 8.1 细胞遗传学检测实验室的设计.......................................................................508.2 分子遗传学检测实验室的设计 (51)8.3 对检测实验室人员及设备的要求 (51)9. 遗传病个体化医学检测的质量保证.....................................................................53 9.1 标准操作程序（Standard Operation Procedure，SOP） (53)9.2 质控品和室内质量控制 (54)9.3 室间质量评价 (55)10. 常见遗传病分子诊断示例................................................................................56 10.1 Duchenne 肌营养不良（DMD/BMD）基因诊断指南 (56)10.2 地中海贫血基因诊断指南 (63)11. 附录 A 产前诊断相关知情同意书................................................................7112. 附录 B 基因检测知情同意书........................................................................7413. 附录 C 不同诊断方法的优缺点....................................................................771前言遗传病是指由于基因突变或染色体数目或结构变异导致的疾病。
基因型鉴定原理
基因型鉴定原理基因型鉴定是通过对个体的基因组进行检测和分析，以确定其基因型的方法。
基因型是指个体在某一位点上所拥有的基因的组合形式。
基因型鉴定可以用于确定个体的遗传特征，包括疾病易感性、药物反应性等，具有广泛的应用价值。
基因型鉴定的原理基本上可以分为两种方法，一种是直接测序法，另一种是基于PCR的方法。
直接测序法是通过对个体的基因组进行测序分析，以确定其基因型。
在进行直接测序之前，首先需要提取个体的DNA，然后进行PCR 扩增，得到目标基因片段。
接下来，使用测序仪对PCR产物进行测序，获取每个碱基的信息。
最后，通过比对测序结果和参考序列，确定个体的基因型。
基于PCR的方法是通过引物的选择和设计，使得特定位点的基因型在PCR反应中表现出不同的特征，从而实现基因型的鉴定。
常用的PCR方法包括限制性片段长度多态性（RFLP）、序列特异性引物扩增（SSCP）、串联重复序列多态性（STR）等。
这些方法通过引物的选择和PCR反应条件的优化，可以在特定的温度下选择性地扩增目标位点的不同基因型，从而实现基因型的鉴定。
除了上述的直接测序法和PCR方法，还有一些其他的基因型鉴定方法，如基于芯片的方法、基于质谱法等。
这些方法能够同时检测多个位点的基因型，具有高通量和高灵敏度的特点。
基因型鉴定在医学、生物学、法医学等领域有着广泛的应用。
在医学领域，基因型鉴定可以用于确定个体的疾病易感性，帮助医生制定个体化的治疗方案。
在生物学领域，基因型鉴定可以用于研究物种的亲缘关系、种群的遗传结构等。
在法医学领域，基因型鉴定可以用于亲子鉴定、鉴定犯罪嫌疑人等。
然而，基因型鉴定也存在一些限制和挑战。
首先，基因型鉴定需要大量的基因组测序数据和参考序列，而这些数据和序列在不同个体之间存在差异，可能导致鉴定结果的误差。
其次，在进行基因型鉴定时，需要考虑样本的纯度、DNA的质量等因素，这些因素都可能影响鉴定结果的准确性。
此外，基因型鉴定需要先对目标基因进行PCR扩增，然后进行测序或分析，整个过程比较繁琐，需要一定的实验技术和设备。
转基因、基因克隆与基因敲除技术
内切酶消化 线性化打靶载体
打靶载体
转染 基因组
纯合子小鼠 （基因剔除）
兄妹交配
杂合子小鼠
同源重组
正常小鼠
交配
杂合子小鼠
同源重组的胚胎干细胞
杂合子小鼠
植入
胚泡
假孕小鼠
黑色雌性大鼠
B 、 制 备 基 因 敲 除 动 物 （ 小 鼠 ）
来自褐色大鼠
1、Neor （neomycin-resistance gene)基因：阳性 筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（G418）能力。
1号发生位点同源重组，在G418培养基中生长；
2号为随机插入重组，带入tk基因，可在G418培养基中生长，但 在gangcyclovir培养基中被杀死；
3号未发生任何重组，为正常细胞，在G418培养基中被杀死。
抵抗G418的基因 1 2 tk基因 3
B、制备基因敲除动物（小鼠）
1、将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡 中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质） 2、将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。 3、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，胚胎干细 胞来自褐色小鼠，正常胚胎来自黑色小鼠。 4、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色 的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲 除。 5、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。
G418（也称遗传霉素）是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉 素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻 断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、 植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常 用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方 后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产 物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有 Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性 ,已在基 因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应 用。
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。
植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。
通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。
因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。
至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。
到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。
转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。
植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。
本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。
1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测1．1．1 常规PCRPCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。
经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。
根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。
中科院遗传所研究成果
目
录
一．实验室概况 ............................................................................................................................. 1 二．科研工作进展和成果 ............................................................................................................. 6 高等植物表观遗传学研究（曹晓风课题组） ......................................................................... 6 植物比较基因组学研究（陈明生课题组） ........................................................................... 11 植物对非生物胁迫应答调控的分子机制（陈受宜课题组） ............................................... 14 植物分子细胞遗传（程祝宽课题组） ................................................................................... 18 植物基因表达调控（储成才课题组） ................................................................................... 23 基因表达调控和植物生物技术（方荣祥课题组） ............................................................... 28 RNA 沉默和植物抗病机制（郭惠珊课题组） ...................................................................... 38 植物转录调控网络研究（焦雨铃课题组） ........................................................................... 43 茉莉酸的生理功能及作用机理研究（李传友课题组） ....................................................... 46 水稻理想株型基因的克隆与功能研究（李家洋课题组） ................................................... 50 植物对病原微生物的识别及信号转导（邱金龙课题组） ................................................... 53 植物天然产物代谢（王国栋课题组） ................................................................................... 56 生物信息学和系统生物学（王秀杰课题组） ....................................................................... 59 与植物重要农艺性状相关基因的结构和功能研究（夏桂先课题组） ............................... 62 植物胁迫信号传导的分子机制（谢旗课题组） ................................................................... 66 北方粳稻耐逆性的分子设计和新品种选育（姚善国课题组） ........................................... 70 乙烯信号传递与植物胁迫和生长发育反应（张劲松课题组） ........................................... 73 植物细胞壁形成及其生物学功能研究（周奕华课题组） ................................................... 77 水稻分化发育和抗病性的功能基因组研究（朱立煌课题组） ........................................... 82 植物遗传工程研究（朱祯课题组） ....................................................................................... 88 细胞分裂素信号转导和植物细胞的程序性死亡（左建儒课题组） ................................... 92 承担课题及当年经费到位情况 ............................................................................................... 95 三．人员情况 ............................................................................................................................. 119 四．学术交流 ............................................................................................................................. 129 五．运行管理 ............................................................................................................................. 141 六．2010 年学术年会纪要 ........................................................................................................ 145
基因型鉴定-中科院版
1.鼠尾DNA提取第一天：1.剪取小鼠尾尖（同样适用于脚趾，胚胎组织，卵黄膜等，若不立即提取，可以放置4℃数日）放入1.5ml EP 管。
2.每管加入鼠尾裂解液350ul +10ul 蛋白酶K（简称PK，10mg/ml，现用现加）。
3.55℃水浴消化过夜第二天：4.用劲将消化好的组织摇匀（可用振荡器摇匀）。
5.每管加入350ul 酚/氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，事先配好，4℃保存）。
6.上下充分混匀，室温静置3分钟后，离心，12000转，30分钟。
7.取出离心后的EP管，可见液体分为三层，取上层无色水相液体约200μl于新1.5ml EP管中，注意勿吸取中层液体。
（不能将中间的蛋白层吸起来，否则会对后续的实验造成影响。
为防止压力过大，可使用切去尖端的枪头）。
8.向新EP管中加入400μl无水乙醇（为2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此时应可看到白色丝状样的DNA。
9.离心12000转，10分钟。
10.可看到有白色沉淀，弃去上清，加入1ml的75%乙醇，将沉淀弹起，以便去除DNA上过多的离子。
11.离心，12000转，10分钟。
12.弃去上清，倒置EP管于吸水纸上，室温干燥约15分钟（注意不能过分干燥，以免基因组DNA难溶解）。
13.加入150-200μl (根据DNA沉淀的量)无菌蒸馏水或者是TE Buffer，可放置37℃助溶。
14.短期4℃，长期-20℃保存。
相关配方：1.鼠尾裂解液配方1000ml溶解液中含：100mM5mM EDTA%SDS200mM NaCl室温保存。
2.蛋白酶K溶液：取100mg 蛋白酶K，加去离子水10ml使成10mg/ml，分装后冻存于-20℃，用时溶解。
3.酚/氯仿：取Tris平衡酚50ml，氯仿48ml，异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中混匀，4℃避光保存。
2.基因鉴定PCR反应标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶UMg2+加双或三蒸水至100ul以我们实验室常用的PCR25ul体系为例：10xbuffer：dNTP 2ulMgCl2：Primer F：1ulPrimer R：1ulTaq酶：DNA模板：1~3ul去离子水加至：25ul退火温度根据引物合成说明书决定PCR操作注意事项：1)PCR的复合管配制需在冰上进行，尤其taq酶需始终放于冰上，或者在最后加入时从-20°冰箱拿出，加完后立即放回。
中科院遗传所03-07遗传学考博试题(含有整理答案,详细)
遗传学2007一、一个学生用转基因技术研究一个基因的功能。
该学生共得到30个独立的转基因株系，其中29个株系的表型与预测的功能基本吻合。
但其中一个株系的情况很特殊，在连续三代自交后代中无法获得任何纯合的转基因株系。
此外，转基因杂合体（其基因型已准确的确认）的自交后代中，仅出现杂合体和野生型（即不含有转基因的个体）两种群体，其比例大致为 2:1，但没有纯合体后代。
请解释该株系表型的遗传学基础，并通过实验验证你的解释。
答：该同学在对该株系转基因的过程中可能插入到一个重要的基因，该基因的失活可能会造成植株的致死。
假设我们研究的基因为A ，插入失活的基因为B 。
那么该同学获得的杂合转基因植株的基因型可能为AaBb 。
自交后代的基因型为：AABB 、AaBb 、aabb 。
其中aabb 是致死的，因此转基因杂合体的自交后代中，仅出现杂合体和野生型两种群体，其比例约为2:1。
实验方案：I 、扩增插入位点的旁临序列，在网上的相关数据库进行比对，看看是否是植株生长过程中重要的基因。
如果有相关报道是一个重要的基因，可以通过在正常植株中把该基因干扰掉，观察植株是否致死，如果致死，则证明所作的猜测是正确的。
II 、也可以通过遗传学的方法间接证明。
将该转基因株系中的杂合株和正常转基因株系中的隐性纯合株杂交，如图：就能够得到杂合型和纯合型，并且比例接近1:1。
如果是这样的结果，也可间接证明转基因过程中突变掉了一个与植株发育相关的重要的基因，导致无法得到纯合的转基因株系。
（转基因过程中除了插入到基因中造成突变，还有其他的如单碱基的突变造成基因突变？）该题目考查了转基因过程中出现的问题该如何解释，需要掌握转基因的原理、过程。
题干也给出了我们在研究某基因的功能的时候可以利用转基因的方法。
AaBb × aaBB AaBB aaBb P ：二、一个学生用某一材料的基因组DNA（genomic DNA）为模版，通过PCR 扩增克隆了一个基因。
小鼠基因型鉴定结果
小鼠基因型鉴定结果引言基因型鉴定是通过对生物体的基因进行分析，确定其基因组的具体构成。
小鼠是一种常见的实验动物，在科学研究中广泛应用。
基因型鉴定结果可以为科学家提供关于小鼠遗传特性的重要信息，有助于深入研究小鼠的生物学特性以及与人类疾病之间的关联。
小鼠基因型鉴定方法小鼠基因型鉴定的方法有很多种，其中常用的方法包括PCR（聚合酶链式反应）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、单核苷酸多态性分析（SNP）等。
这些方法可以通过特定的试剂和实验步骤，对小鼠的基因进行扩增、分离、测序等操作，最终得到基因型鉴定结果。
PCRPCR是一种常用的基因型鉴定方法，通过扩增目标基因片段，从而得到足够的DNA样本进行后续分析。
PCR的原理是利用DNA聚合酶酶解DNA双链，然后引物与目标序列特异性结合，DNA聚合酶在引物的作用下合成新的DNA链。
通过多轮循环反应，可以在短时间内扩增出大量目标基因片段。
RFLPRFLP是一种通过酶切DNA片段的方法进行基因型鉴定。
在RFLP分析中，首先将DNA样本进行限制性内切酶消化，然后通过凝胶电泳将酶切后的DNA片段进行分离。
由于不同基因型的DNA片段长度存在差异，因此可以通过凝胶电泳的结果判断小鼠的基因型。
SNPSNP是单核苷酸多态性分析的缩写，是一种通过检测DNA序列中单个碱基的变异来进行基因型鉴定的方法。
SNP分析可以通过PCR扩增目标区域的DNA片段，然后利用测序技术对扩增产物进行测序，最终确定小鼠的基因型。
小鼠基因型鉴定结果的意义小鼠基因型鉴定结果对于科学研究具有重要意义。
首先，基因型鉴定可以帮助科学家确定小鼠的遗传特性，包括其携带的基因突变和变异，这些特性对于深入研究小鼠的生物学功能至关重要。
其次，基因型鉴定结果可以为研究人员提供关于小鼠模型的有效性和可靠性的信息，有助于确定小鼠是否适合作为特定疾病模型的研究对象。
最后，基因型鉴定结果还可以为研究人员提供有关小鼠与人类疾病之间的关联的线索，有助于揭示疾病的发病机制和寻找新的治疗方法。
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1.鼠尾DNA提取
第一天：
1.剪取小鼠尾尖（同样适用于脚趾，胚胎组织，卵黄膜等，若不立即提取，可以
放置4℃数日）放入1.5ml EP 管。
2.每管加入鼠尾裂解液 350ul +10ul 蛋白酶K（简称PK，10mg/ml，现用现加）。
3.55℃水浴消化过夜
第二天：
4.用劲将消化好的组织摇匀（可用振荡器摇匀）。
5.每管加入350ul 酚/氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，事先配好，4℃保
存）。
6.上下充分混匀，室温静置3分钟后，离心，12000转，30分钟。
7.取出离心后的EP管，可见液体分为三层，取上层无色水相液体约200μl于新
1.5ml EP管中，注意勿吸取中层液体。
（不能将中间的蛋白层吸起来，否则会
对后续的实验造成影响。
为防止压力过大，可使用切去尖端的枪头）。
8.向新EP管中加入400μl无水乙醇（为2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此
时应可看到白色丝状样的DNA。
9.离心12000转，10分钟。
10.可看到有白色沉淀，弃去上清，加入1ml的75%乙醇，将沉淀弹起，以便去除
DNA上过多的离子。
11.离心，12000转，10分钟。
12.弃去上清，倒置EP管于吸水纸上，室温干燥约15分钟（注意不能过分干燥，以免
基因组DNA难溶解）。
13.加入150-200μl (根据DNA沉淀的量)无菌蒸馏水或者是TE Buffer，可放置37℃助溶。
14.短期4℃，长期-20℃保存。
相关配方：
1.鼠尾裂解液配方
1000ml溶解液中含：
100mM Tris-HCl pH8.5
5mM EDTA
0.2%SDS
200mM NaCl
室温保存。
2.蛋白酶K溶液：
取100mg 蛋白酶K，加去离子水10ml使成10mg/ml，分装后冻存于 -20℃，用时溶解。
3.酚/氯仿：
取Tris平衡酚50ml，氯仿48ml，异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中混匀，4℃避光保存。
2.基因鉴定PCR反应
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5U
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至 100ul
以我们实验室常用的PCR25ul体系为例：
10xbuffer： 2.5ul
dNTP 2ul
MgCl2： 1.5ul
Primer F： 1ul
Primer R： 1ul
Taq酶： 0.5ul
DNA模板： 1~3ul
去离子水加至： 25ul
退火温度根据引物合成说明书决定
PCR操作注意事项：
1)PCR的复合管配制需在冰上进行，尤其taq酶需始终放于冰上，或者在最后加入时
从-20°冰箱拿出，加完后立即放回。
2)PCR反应极为灵敏，操作过程应当注意避免样本之间的相互污染，吸取不同样本时应
当换枪头。
3.琼脂糖凝胶电泳
1.根据欲分离DNA片断大小用凝胶缓冲液（TAE 缓冲液）配制适宜浓度的琼脂糖凝胶，
以1%胶为例：称取琼脂糖1克，倒入通风橱内的锥形瓶中，尽量不要让粉末沾在内壁上。
用量筒量取1×TAE100ml ，倒入锥形瓶，戴入一次性手套混匀。
2.戴一次性手套把锥形瓶放入微波炉，加热3min左右，使琼脂糖彻底溶解，看不到颗粒
为止。
在此期间插好制胶的板槽和梳子。
3.迅速将锥形瓶置于通风橱内，冷却片刻，用通风橱内20μl枪，吸6~10ul（0.05%）的
EB，插入液面，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，注意避免产生气泡，如有气泡，应设法除去。
（枪头应丢入指定垃圾箱）
4.等待30min冷却。
5.凝固后，戴一次性手套，先两端起开一点梳子，再将梳子完全拔出，将胶安放在电泳
槽内。
6.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法
除去。
退掉一次性手套加样。
7.每个25ul样本加入6×buffer 5ul，混匀后，将样品缓冲液缓慢加入被浸没的凝胶加样
孔内。
8.加样后。
带上一次性手套接通电源，插上+/ -极，切记DNA样品由负极往正极泳动。
设置电压，一般为60-100V，按下RUN开始电泳，电泳15-30分钟即可。
9.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；一般前端染料到2/3处即可。
10.电泳完毕后，戴一次性手套关掉电泳仪。
拿出胶版，推出胶。
在凝胶成像仪上观察电
泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。