基因型鉴定 中科院版

1.鼠尾DNA提取

第一天：

1.剪取小鼠尾尖（同样适用于脚趾，胚胎组织，卵黄膜等，若不立即提取，可以

放置4℃数日）放入1.5ml EP 管。

2.每管加入鼠尾裂解液 350ul +10ul 蛋白酶K（简称PK，10mg/ml，现用现加）。

3.55℃水浴消化过夜

第二天：

4.用劲将消化好的组织摇匀（可用振荡器摇匀）。

5.每管加入350ul 酚/氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇25:24:1，事先配好，4℃保

存）。

6.上下充分混匀，室温静置3分钟后，离心，12000转，30分钟。

7.取出离心后的EP管，可见液体分为三层，取上层无色水相液体约200μl于新

1.5ml EP管中，注意勿吸取中层液体。（不能将中间的蛋白层吸起来，否则会

对后续的实验造成影响。为防止压力过大，可使用切去尖端的枪头）。

8.向新EP管中加入400μl无水乙醇（为2倍于上清的体积），上下颠倒混匀，此

时应可看到白色丝状样的DNA。

9.离心12000转，10分钟。

10.可看到有白色沉淀，弃去上清，加入1ml的75%乙醇，将沉淀弹起，以便去除

DNA上过多的离子。

11.离心，12000转，10分钟。

12.弃去上清，倒置EP管于吸水纸上，室温干燥约15分钟（注意不能过分干燥，以免

基因组DNA难溶解）。

13.加入150-200μl (根据DNA沉淀的量)无菌蒸馏水或者是TE Buffer，可放置37℃助溶。

14.短期4℃，长期-20℃保存。

相关配方：

1.鼠尾裂解液配方

1000ml溶解液中含：

100mM Tris-HCl pH8.5

5mM EDTA

0.2%SDS

200mM NaCl

室温保存。

2.蛋白酶K溶液：

取100mg 蛋白酶K，加去离子水10ml使成10mg/ml，分装后冻存于 -20℃，用时溶解。

3.酚/氯仿：

取Tris平衡酚50ml，氯仿48ml，异戊醇2ml加入100ml棕色试剂瓶中混匀，4℃避光保存。

2.基因鉴定PCR反应

标准的PCR反应体系：

10×扩增缓冲液 10ul

4种dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA 0.1～2ug

Taq DNA聚合酶 2.5U

Mg2+ 1.5mmol/L

加双或三蒸水至 100ul

以我们实验室常用的PCR25ul体系为例：

10xbuffer： 2.5ul

dNTP 2ul

MgCl2： 1.5ul

Primer F： 1ul

Primer R： 1ul

Taq酶： 0.5ul

DNA模板： 1~3ul

去离子水加至： 25ul

退火温度根据引物合成说明书决定

PCR操作注意事项：

1)PCR的复合管配制需在冰上进行，尤其taq酶需始终放于冰上，或者在最后加入时

从-20°冰箱拿出，加完后立即放回。

2)PCR反应极为灵敏，操作过程应当注意避免样本之间的相互污染，吸取不同样本时应

当换枪头。

3.琼脂糖凝胶电泳

1.根据欲分离DNA片断大小用凝胶缓冲液（TAE 缓冲液）配制适宜浓度的琼脂糖凝胶，

以1%胶为例：称取琼脂糖1克，倒入通风橱内的锥形瓶中，尽量不要让粉末沾在内壁上。用量筒量取1×TAE100ml ，倒入锥形瓶，戴入一次性手套混匀。

2.戴一次性手套把锥形瓶放入微波炉，加热3min左右，使琼脂糖彻底溶解，看不到颗粒

为止。在此期间插好制胶的板槽和梳子。

3.迅速将锥形瓶置于通风橱内，冷却片刻，用通风橱内20μl枪，吸6~10ul（0.05%）的

EB，插入液面，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，注意避免产生气泡，如有气泡，应设法除去。（枪头应丢入指定垃圾箱）

4.等待30min冷却。

5.凝固后，戴一次性手套，先两端起开一点梳子，再将梳子完全拔出，将胶安放在电泳

槽内。

6.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法

除去。退掉一次性手套加样。

7.每个25ul样本加入6×buffer 5ul，混匀后，将样品缓冲液缓慢加入被浸没的凝胶加样

孔内。

8.加样后。带上一次性手套接通电源，插上+/ -极，切记DNA样品由负极往正极泳动。

设置电压，一般为60-100V，按下RUN开始电泳，电泳15-30分钟即可。

9.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；一般前端染料到2/3处即可。

10.电泳完毕后，戴一次性手套关掉电泳仪。拿出胶版，推出胶。在凝胶成像仪上观察电

泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。