肿瘤相关基因突变的临床意义及其检测方法

显微切割 + 直接测序 直接测序法 荧光定量PCR法 Mutation-riched PCR PCR-SSCP ……
激光捕获显微切割
（laster capture microdissection, LCM）
工作原理：
利用紫外激光对生物样本进行 切割和分离，通过弹射装置将目 的细胞收集于EP管内。
DNA洗脱收集
核酸保存
• 浓度：100－300ng/ul • 纯度：避免杂质导致DNA在储存过程中的降解 • 温度：分装-20℃保存 • 溶解DNA Buffer：TB Buffer 或者Tris缓冲液
DNA检测方法－紫外分光光度法
纯度（ OD260-320 /OD280-320 ）
紫外分光光度计测量
RNA提取方法
硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸 TRIZON：一步法
样本种类
血液学样本：抗凝血液、血浆、血清、全血、骨髓 组织学样本：新鲜组织、冰冻组织、石蜡包埋组织 脱落细胞：胸腹水、痰液、宫颈诊刮LCT、TCT
石蜡组织基因组DNA提取流程
硅胶膜吸附法（吸附柱法）
样本裂解
加入吸附柱
缓冲液漂洗
• 选择稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间：
• OD260 /OD280 < 1.7 OD260 /OD280＝1.7～1.9 OD260 /OD280 > 1.9
有蛋白的污染 纯度很好 部分降解或有RNA污染
DNA检测方法－内参检测法
石蜡包埋组织GAPDH扩增产物电泳图
第二部分
基因突变检测方法
PCR反Leabharlann Baidu耗时约90分钟
con 12 12 12 12 12 12 13 ala asp arg cys ser val asp
荧光定量PCR特点
针对固定的已知突变 操作简便、耗时短（2h） 结果分析直观 敏感性：
10%以上突变体 条件优化困难
标本类型
手术标本
活检或穿 刺标本
T790M (2369位点C>T碱基置换突变)
敏感 敏感 耐药
21exon
置换
L858R (2573位点T>G碱基置换突变) L861Q (2582位点T>G碱基互换突变)
敏感 敏感
EGFR基因突变检测方法
直接测序 定量PCR ADx-ARMS
测序图 EGFR-exon18测序峰图
18号外显子G719C突变
肿瘤相关基因
与肿瘤的发生发展密切相关的基因
ras、 braf、PIK3CA、p53 、EGFR、HER-2、 kit 、PDGFRA、cMET、PTEN …
从分子水平认识肿瘤
指导肿瘤的诊断、治疗及预后预测
肿瘤相关基因致瘤过程改变
致瘤过程：癌基因激活、抑癌基因失活、 相关基因扩增、过表达
基因突变：点突变、缺失、插入 基因过表达 基因扩增
野生型
EGFR-exon19 测序峰图
开始出现套峰
△E746-A751del 2240-2254位点，15bp缺失
功 能：
通过从诊断明确的组织中切取 获得的细胞或细胞成份，提取核 酸，可用于PCR、DHPLC等
切割之前的目的癌巢
切割之后，可见目的癌 巢已取走
直接测序法
原理：双脱氧终止法 仪器：PCR仪、电泳仪、测序仪
CEQ8000: 工作原理：标记终止物法
直接测序法的特点
直接测出碱基序列，明确突变类型 检测条件要求高：仪器、组织质量、操作、结果分析 耗时长：2~3天 敏感性有限制：10~30% 突变体
Nature Review 2007, 7:169
EGFR主要突变
外显子 18exon
突变类型 置换
突变位点 G719A (2156G>A碱基置换突变)
对TKI敏感性 敏感
19exon 20exon
缺失 置换
△E746-A750del 2235-2249位点，15bp缺失突变
△E747-A753del 2240-2257位点，18bp缺失突变
EGFR
EGFR (epidermal growth factor receptor)，又称HER – 1 位于人 类Chr7的短臂 含EGFR激活性突变的NSCLC对 TKI敏感 突变多发生于EGFR激酶区
配体 EGFR
EGFR-TK
EEGGFFRR--TTKKII
增生 侵袭血 管 生 成
转移 细胞凋亡
测序法检测突变的基因
EGFR:18、19、20、21号外显子 c-kit：9、11、13、17号外显子 PDGFRA:12、18号外显子
荧光定量PCR
原理：Taqman探针 仪器：荧光定量PCR仪
基于定量PCR检测工作流程
提取肿瘤 组织DNA
对突变与对照的反应 进行比较以完成分析
每个DNA样本均加到几 个独立的试管中并放入 实时PCR仪器
汇总
例数 924 520 1444
成功检出
阳性检出
917 （99.2%）257（28.0%）
493 （94.8%）144（29.2%）
1410（97.6%）401（28.4%）
荧光定量PCR法检测突变的基因
EGFR：19、21号外显子 KRAS：12、13号密码子 BRAF：15号外显子
第三部分
肿瘤相关基因突变的临床 意义及其检测方法
中山大学肿瘤防治中心 分子诊断科 王芳
一、核酸DNA提取 二、基因突变常规检测手段 三、肿瘤相关基因突变简介 四、核酸扩增技术其他用途 五五、、新新基基因因介介绍绍
第一部分
基因组DNA提取方法
硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸 磁珠法：独特包埋的磁珠 传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低
测序法流程
提取肿瘤 组织DNA
病理学评估
PCR反应扩增
琼脂糖凝胶 电泳纯化
高质量的 PCR 反应原液
DNA测序仪上机
2000
测序结果影响因素分析 500 200
石蜡包埋组织提取DNA的片段化 100
直接测序法：肿瘤组织中混杂不同程度非肿瘤细胞， 影响测序敏感性
显微切割+测序：不适于普通实验室开展 传统PCR易于产生污染 产物纯化及DNA测序不可控
Chiu et al, 2003
INFORM研究成果
1。 治疗组无进展生存期明显 延长（4.8个月：2.6个月） 疾病进展风险下降了58%
中国ASCO会议第一人
2。EGFR突变的亚组： 中位无进展生存期延长（16.6月： 2.7月） 疾病进展风险下降了84%
非小细胞肺癌中EGFR酪氨酸激酶区突变