中和试验

固定血清稀释病毒法：
已知效价的抗血清 （通常为阴性对照）
测定
未知效价的抗血清
结果以中和 指数表示
试验组LD50 (EID50、TCID50) 中和指数 = ────────────────── 对照组LD50 (EID50、TCID50)
固定病毒稀释血清法：
已知效价（滴度） 的病毒
测定
抗血清的效价
病毒中和试验 Virus Neutralization Test
2012.7.17 张文昌
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背景 原理 方法 应用 各种方法利弊分析 发展趋势 质量控制
（一） 背景介绍
1.当病原微生物侵入机体时会诱导机体体液 免疫产生相应的抗体。 2.病原微生物入侵细胞时需要依赖病原体自 身表达的特定分子与细胞上的受体结合，才 能感染细胞，并进一步扩增。 3.病毒完整的复制周期 艾滋病病毒复制.flv
图1.中和抗体作用机制
• Antibodies can neutralize viral infectivity in a number of ways, as summarized in the illustration. They may interfere with virion binding to receptors, block uptake into cells, prevent uncoating of the genomes in endosomes, or cause aggregation of virus particles. Many enveloped viruses are lysed when antiviral antibodies and serum complement disrupt membranes.
结果以血清中 中和抗体滴度表示
(四) 应用
1.蚀斑减少中和实验（Plaque Reduction Neutralization Test PRNT）
蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种 敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少 50％的血 清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒（ 100PFU）与不同稀释度的等量血清混合后感作,接 种预先准备好的单层细胞,再覆盖上营养琼脂置37℃ 二氧化碳培养箱培养,数天后分别统计蚀斑数,用 Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。
图2.登革热病毒感染敏感细胞出现的蚀斑
2.快速微量中和试验
一种人巨细胞病毒中和抗体效价快速检测方 法的建立
HCMV感染具有严格种属特异性，一般体外采用 HELF（人胚肺成纤维细胞）增殖该病毒，体外的感染实 验也多在一些成纤维细胞如MRC-5上进行。但是HCMV完 整的增殖周期比较长， 一般一周左右才能裂解细胞释放 病毒粒子。IE1是病毒进入细胞后最早表达（2-4h)的蛋白 之一，6小时便可在细胞核中检测到。IE基因对病毒的E基 因以及L基因的表达乃至整个病毒的复制周期都有非常重 要的作用。
以HCMV中和抗体效价测定为例
2倍稀释血清样 品，终体积 0.2ml 200PFU HCMV每孔 0.2ml 孵育1h
加到
24孔板中以长 成单层MRC-5 细胞
37℃孵育1h
弃去液体， PBS洗三 次
含0.3%琼脂的 维持液覆盖
3-5天再次覆盖
14天甲醛 固定
甲基蓝染色
中和抗体效价 的测定
同时设病毒对照和细胞对照，病 毒对照组只加病毒不加血清，细胞对 照组用维持液代替血清和病毒。 病毒对照组细胞全部病变 （100%），细胞对照组不出现噬斑。
6.病毒中和试验：Neutralization of a virus is defined as the loss of infectivity through reaction of the virus with specific antibody. • 以测定病毒感染力为基础，以病毒受免疫 血清中和后残存的感染力为依据，来判定 免疫血清中和病毒的能力。 • 常用于检测患者血清中抗体消长情况，抗 原免疫原性评价，也可用来鉴定未知病毒 或对病毒进行半定量等。
实验流程
血清灭活
56℃ 30分钟，不同来源的 血清灭火温度和时间可能 不同
步 骤 一
用维持液2倍稀释血清 每孔终体积25μl
步 骤 二
与等体积已知滴度的 病毒混合，37℃ 中和不同时间
45min 60min 75min 90min
动物血清中，含有多种蛋 白质成分对抗体中和病毒 有辅助作用，如补体、免 疫球蛋白和抗补体抗体等。 为排除这些不耐热的非特 异性反应因素，用于中和 试验的血清须经加热灭活 处理。
补充
• 病毒感染细胞的判断 判断细胞被病毒感染的方法最直接的就 是CPE（cytopathic effect），此外还有细 胞内病毒蛋白的免疫印迹；非特异的化学 方法如病毒感染导致细胞死亡MTT法。
参考文献
[1]A rapid microneutralization assay for cytomegalovirus Journal of Virological Methods, 14 (1986) 37-41 [2] A rapid microneutralization assay for the measurement of neutralizing antibody reactive with human cytomegalovirus Journal of Virological Methods, 23 (1989) 157-168 [3] Effect of Previous or Simultaneous Immunization with Canarypox Expressing Cytomegalovirus (CMV) Glycoprotein B (gB) on Response to Subunit gB Vaccine plus MF59 in Healthy CMV-Seronegative Adults [4] Rapid Quantitation of Cytomegalovirus and Assay of Neutralizing Antibody by Using Monoclonal Antibody to the Major Immediate-Early Viral Protein JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Mar. 1988, p. 504-507
（七）质量控制
因目前尚无CMV中和抗体的国家标准品，该方法的准确性无 法验证，下面分别对精密性，耐用性和专属性进行验证。 ① 精密性验证 重复性验证 对同一份CMV-IVIG样品在同一次试验中平行检测12次，计 算变异系数（CV） CV=σ/μ σ为方差，μ为平均值 中间精密性验证 A：不同操作者对同一份样品分别检测三次 B：同一操作者不同工作日对同一份样品检测三次 分别计算CV
步骤二
25μ l病毒
25μ l病毒
25μ l维持液
步骤三
50μ l混合液
50μ l混合液
50μ l混合液
图3.感染HCMV 的MRC-5 细胞的 体视Biblioteka Baidu微镜（B，× 25）图像
本实验的优点体现在以下几个方面
HCMV感染普遍存在，不管是患者血清学检 查或是开发HCMV特异中和抗体产品（如杂交瘤细 胞产中和抗体的检测或是成品的质控），快速准 确的测定样品中中和抗体效价都是关键。以往运 用普通的中和试验，观察典型CPE出现，需要6-7 天才能得出结果，离实际需要相差很远。 本实验采用96孔板里做酶联免疫检测病毒IE1 基因的表达，来确定病毒是否被中和抗体所中和 ，检测结果可在两天内读出。
通常滴定终点的判断还需要有经验，不同 操作者之间主观因素影响较大。 CPE只能在细胞水平反映病毒的感染状态 ，对于病毒是否进入细胞（中和抗体主要 作用是在病毒吸附和侵入阶段阻断病毒感 染），感染进程无法体现。
（六）发展趋势
中和试验自出现以来，一直在朝着快 速，准确，微量，重复性好等目标发展。 先后出现了，噬斑减少中和试验（PRNT） ,快速微量中和试验等。随着各种病毒感染 细胞周期事件的阐明，各种针对病毒蛋白 的单克隆抗体研制工艺的成熟。利用酶联 免疫检测病毒是否进入细胞，比以往的出 现CPE才认为是病毒进入细胞更准确，更 快速。而且能从分子水平反映细胞的实际 感染状态。
（二）原理
• 特异的抗病毒免疫血清（中和抗体）和病 毒作用后，使病毒失去感染的能力，一种 病毒只能被相应的免疫血清所中和。 • 中和一定量的病毒的感染力必须有一定效 价的中和抗体。
（三）方法
1.中和实验验可分为体内试验和体外试验
体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接 种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻 击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫 苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。
4.病毒的中和抗体（neutralization antibody ）指：针对病毒某些表面抗原的抗体，此类 抗体能与细胞外游离的病毒结合从而消除病 毒的感染能力。 5.中和抗体的作用机制：
①直接封闭病毒表面抗原，如与病 毒表面吸附蛋白（VAP）结合，从 而阻断病毒的吸附
②改变病毒表面结构
③病毒与中和抗体形成的免疫复 合物，易被巨噬细胞吞噬清除 ④有包膜的病毒表面抗原与中和 抗体结合后，激活补体，可导致 病毒的裂解
（五）各种方法利弊分析
体内试验能够更加真实的反映病毒和抗血 清在体内的作用状态。然而试验成本较高 ，而且实验受动物个体间免疫力差异影响 较大，实验结果不稳定，重复性也不如体 外实验。 中和试验滴定终点的判断通常以半数致死 剂量LD50（体内实验）或是半数致细胞病 变剂量CCID50为指标。然而很多病毒感染 敏感细胞并不出现典型的CPE或是CPE出 现比较晚，无法满足临床上需快速及时监 测患者血清学状态的要求。
抗HCMV IE单抗的出现促进酶联免疫法在HCMV 中和抗体效价检测中的应用，一些新型快速微量 中和试验相继建立，但结果需通过人工计数，检 测通量不高，本实验使用CCD进行图像采集和克 隆计数软件分析和计算，结果准确客观 本实验参照酶联免疫斑点法（ELISPOT），并使 用生物素-亲和素系统对信号进行放大，灵敏度有 所提高。 反应在96孔板中进行，样品用量仅为25μl，节约 成本。 无需昂贵的荧光显微镜，不受荧光信号容易淬灭 影响。
步 骤 三
加至已长成单层 的MRC-5细胞
16h，18h，20h 所铺细胞数目要求较高，防止细胞叠层
梯度乙醇固定细胞， 封闭30min
相继用IE1单抗， 生物素标记羊抗鼠IgG， 链霉亲和素-HRP， 以及底物显色
图像采集与数据处理
实验组
病毒对照
细胞对照
步骤一
25μ l血清
25μ l维持液
25μ l维持液
② 稳定性验证 同一份CMV-IVIG样品系列稀释后与等体积病毒液于 37℃分别孵育55,60，65min检测HCMV中和抗体效价 ③ 特异性验证 水痘带状疱疹病毒(vzv)感染MRC-5细胞，37℃培养 18h，固定后进行免疫染色观察感染细胞核内是否出现特 异性着色颗粒。 另取4份血浆样品，2份普通IVIG样品，4份CMVIVIG样品分别与MRC-5细胞37℃共同孵育18h，固定后进 行免疫染色，观察核内是否出现特异性着色颗粒，阴性对 照加等量培养基，阳性对照加等量病毒液。
疫苗或抗血清
适量病毒
一定时间
致死状态等 判断结果
体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条 件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚以 检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差 异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指 数，即中和抗体的效价。
2.根据稀释成分不同可分为两种方法。一为固定病
毒用量与等量一系列倍比稀释的血清进行中和试 验，以血清中和抗体滴度表示。二为固定血清用 量与等量一系列对数稀释的病毒进行中和试验。 结果以中和指数表示。