实验讲义

实验讲义

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵

酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。此作用即酒精发酵。

C6H12O6(葡萄糖)→2 C2H5OH(酒精)+2 CO2↑

在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。目前，利用聚乙烯醇（PV A）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PV A-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。

【实验一】

一、酵母菌的分离与培养

一、【实验目的】

学习用选择性培养基分离酵母菌。

二、【实验原理】

大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH值为4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。

三、【实验仪器和材料】

1、实验材料：成熟葡萄

试剂：0.1%吕氏(Loeffier)美蓝染液

配制方法：A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3 g, 95%乙醇30 ml；

B 液：0.0l% KOH l00ml。

混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。

2、培养基：

（1）乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH 值4.5。

配制方法：

1）先将豆芽称60 g加蒸馏水300 ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250 ml左右，制

成20%的豆芽汁；

2）加入葡萄糖，用乳酸调pH值至4.5左右，然后加蒸馏水定容至300 ml；

3）分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 ℃，20 min。

（2）YPG培养基（500 ml）：酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5～6.8。

配制方法：

1）称取酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，放入500 ml烧杯中，然后加入400 ml蒸馏水；

2）使用HCl及NaOH调整pH值6.5～6.8，加蒸馏水定容至500 ml，再放入琼脂10 g；

3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。高压蒸汽灭菌，于115 ℃，20 min，冷却至50-55℃左右

时倒入无菌平皿。

3、器材

烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片

四、【实验步骤】

1、富集培养（第1天）：取葡萄皮于90 ml无

菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，

取出后稍静置。用无菌枪头吸取上清液1 ml

接入9 ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同

时做一个不接菌液的空白对照管一起培养。

置28～30℃培养箱中培养20-24小时（第2，

3天）。

2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片

中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片

制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵

母菌的形态和出芽生殖情况。活酵母菌可使

美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可

判断酵母菌的死活。（第2天）

水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小

滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴

水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，

盖上盖玻片。

3、镜检：取少许富集的菌液观察酵母菌的形态。

（第2天）

4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5 ml富集菌液，

加入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸几

次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。

再用1 ml无菌枪头，吸取10-1稀释液0.5 ml，

移入装有4.5 ml无菌水的试管中，吹吸混

匀，即成10-2稀释液。同样做法再一次，做

成10-3稀释液。

5、倒平板培养（第2天）：倒YPG培养基平板，

凝固待用。用无菌枪头分别吸取10-2、10-3

浓度的稀释液0.1 ml于YPG平板上，用涂

布棒将菌液在平板上涂抹均匀。平放桌面30

min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板

倒转，置28～30 ℃再培养24 h或稍长(过长

则霉菌长出)（第3，4天）。

6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的酵

母菌菌落，用接种环挑取一环的酵母菌，在

YPG平板中采用划线分离法分离酵母菌。

并同时制片做纯度检查。若不纯，应进一步

挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养

体为止。涂片镜检，菌落观察。（第4，5天）

7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于YPG斜

面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 ℃

下保存。（第4，5天）

五、【注意事项】

1、美兰染色浓度和时间严格掌握；

2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。

六、【思考题】

1、绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。

2、说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间对死活细胞数的影响。

【实验二】

二、发酵菌株的筛选

一、【实验目的】

学习用显色剂及杜氏小管判断各分离酵母菌的发酵能力。

二、【实验原理】

TTC(2，3，5一氯化苯基四氮哇)是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低。在一定培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂后会显不同颜色，产酒精能力强的酵母菌落成深红色，次之为粉红色。

酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。