糖化酶活力测定(精)

糖化酶活力测定
1. 定义
1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。

2. 原理
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。

3. 试剂和溶液
(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。

称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。

配好后用 pH 计校正。

(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。

(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。

(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。

(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。

(6硫酸溶液(2mol/L。

(7 20g/L可溶性淀粉溶液。

(8 10g/L淀粉指示液。

4. 仪器和设备
恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。

5. 步骤
(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先
用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。

沉
渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。

通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。

(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。

在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅
速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。

取出,加硫酸溶液 2ml ,立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定,直至蓝色刚好消失为其终点。

(3计算
X =(A -B c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×(A -B c×n
式中 X ——样品的酶活力(u/g或 u/ml
A ——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml
B ——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml
c ——硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L
90.05——与 1ml 硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L相当的以克表示的葡萄糖的质
量
32.2——反应液的总体积(ml
5——吸取反应液的体积(ml
1/2——吸取酶液 2ml ,换算为 1ml
n ——稀释倍数
2——反应 30min ,换算成 1h 的酶活力系数所得的结果表示至整数。