糖化酶活力测定(精)
发酵实验报告二、根霉曲糖化能力的测定
发酵工程学实验报告实验二根霉曲糖化能力的测定学院生命科学学院专业应用生物教育班级12应生A班姓名李顺昌学号124120218实验课程根霉曲的制备指导教师许波开课学期2014—2015学年下学期实验二根霉曲糖化能力的测定小组合作：是小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤一、实验目的1.了解标准曲线的制作和使用方法2.掌握DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定糖化酶活力的基本原理和方法3.学会计算糖化酶的糖化DE二、实验设备与材料1.设备：天平、烧杯、三角瓶、水浴锅、离心机、722分光光度计等2.材料：根霉曲、柠檬酸缓冲液、DNS、0.1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液三、实验原理1.淀粉：由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成，其水解需淀粉酶和糖化酶的作用；淀粉酶的作用：首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖；糖化酶的作用：其次通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降解为还原性的单糖。
2.DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。
3.DE（Dextrose Equivalent，葡萄糖值）：是糖化液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分比，工业上用DE值表示淀粉的水解程度或糖化程度。
四、实验方法步骤1.绘制标准曲线的方法先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定吸光度A。
以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。
然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。
2.待测酶液的制备烘干：把发酵产物倒于平皿中，50℃烘干；制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；制备酶液：称取1g根霉曲粉，充分溶解于30mL缓冲液(即稀释30倍)，纱布（4层）过滤去除杂质，滤液备用。
葡萄糖淀粉酶的活力测定
葡萄糖淀粉酶的活力测定一．原理：葡萄糖淀粉酶（糖化酶）在一定的条件下能水解生成葡萄糖，葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠氧化。
过量的碘用硫代硫酸钠滴定。
从碘的减少量计算葡萄糖的量，从而计算酶活力。
二．试剂与材料：1.2%可溶性淀粉液：称取可溶性淀粉2g，以少许蒸馏水调匀，侵入80ml的沸水中，继续煮至透明状，冷却后，加水定容至100ml2.PH4.6，0.1mol/L醋酸缓冲液：0.1mol/L苏酸溶液与0.1mol/L醋酸钠溶液等体积混合。
3.0.1mol/L碘液：称取36g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中，加入14g碘，逐渐溶解，加3滴盐酸，定容至1000ml4.0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g NAOH，用水溶解，定容至1000ml5.1mol/L硫酸溶液。
量取56ml浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至1000ml6.0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：称取25g硫代硫酸钠，0.2g碳酸钠，溶于1000ml煮沸冷却后的水中，存于棕色瓶。
放置一周后，用0.1mol/L重络酸钾滴定。
7.0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉用少量水调匀。
倒入80ml沸水中，继续煮至透明，冷却后，定溶100ml三．操作方法：1.吸取2%可溶性淀粉液10ml，加入PH4.6醋酸缓冲液5ml，混匀后于40℃水浴中预热10min2.加入酶液1ml，于40℃，反应10min。
反应结束时，沸水中煮10min，以终止酶反应。
3.吸取上述反应液5ml于碘量瓶中，加入0.1mol/L碘液5ml及0.1mol/L NAOH溶液5ml，混匀，于室温下暗处放置15min，加入2mol/L硫酸酸化。
4.以0.5%可溶性淀粉液作为指示剂，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至蓝色消失为终点。
记录0.05mol/L硫代硫酸钠消耗的毫升数（A），以及空白试验消耗的硫代硫酸钠毫升数。
四．结果计算：在上述条件下，每小时催化淀粉水解生成1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶力单位。
糖化酶发酵、提取及活力测定
SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ发酵工艺学实验报告糖化酶发酵、提取及活力测定实验学院：生命科学学院专业班级：生物工程1602项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻指导教师：王丽娟2018年6月糖化酶发酵、提取及活力测定实验何健雨王丽娟生命科学学院生工1602班1. 实验目的(1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺；(2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。
(3)学习并掌握糖化酶活力测定方法2. 实验原理葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。
糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。
生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。
黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。
首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。
酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。
3. 实验材料优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）；0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。
4. 方法步骤待测酶液的制备:称取酶粉1-2g,精确至0.0002g,先用少量的乙酸缓冲液溶解,并用玻璃棒捣研,将上请液小心倾入容量瓶中。
实验十四糖化酶活力的测定
实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。
2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。
二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。
本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。
碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。
I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。
原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。
试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。
倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。
2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。
3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。
取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。
以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。
4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
糖化酶
三 糖化酶的性质
• 糖化酶对淀粉的分解能力与酶活力、吸附 性、解支能力、原料的性质、温度、pH等糖化 工艺条件有关。底物的水解速率主要受底物分 子的大小及结构的影响,同时也受水解碳链序 列中下一个键的影响。其底物亲和性与底物的 碳链长度呈线性关系,碳链越长底物亲和力就 越大;糖化酶所水解的底物分子越大其水解速 度就越快,而且酶的水解速度还受到底物分子 排列上的下一个键影响,邻近α-1,4链的α1,6糖苷键较独立的α-1,6链更易被打开。
1 糖化酶在白酒酿造中的应用
我国传统白酒的生产用固态发酵法,大多 使用淀粉质原料,一般以曲为糖化剂,成本高、 产酒率低。原因是因为淀粉质原料的糖化不完 全所致,而糖化是发酵的基础,因而糖化不好就 成了影响出酒率的首要问题。随着白酒工业的 发展,利用糖化酶代替部分曲,以提高出酒率, 降低生产成本,已被众多白酒企业普遍采用。 尤其近几年活性干酵母的出现,更使糖化酶在 白酒中的用量飞速增长。
5 糖化酶在冰冻食品生产中的应用
一般膨化雪糕中的总固体含量为 18%～28%,总固体含量低会影响膨化雪糕 的膨胀率,产品口感变差。要提高冷食品 中的总固体含量就势必增加白砂糖、奶 粉、淀粉、奶油等的用量,从而导致原料 成本增加。但当淀粉的含量超过3%时,冷 冻食品贮藏一段时间后,淀粉易发生老化 返生现象,出现生淀粉味,这也限制了淀 粉在冷冻食品中的用量。
• 采用糖化酶对冷冻食品中的淀粉进行水解, 并用糖化酶糖化使其生成葡萄糖。由于葡萄糖 的增加降低了浆料的冰点,使冷冻食品组织状 态更加完善;同时由于改变淀粉的分子结构,可 以防止淀粉老化返生,消除淀粉味感。这种方 法可以适当降低白砂糖、奶粉、奶油的用量, 并增加淀粉的用量,从而降低了产品的生产成 本;同时可使产品的口感细腻、柔软,质量得到 改善。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9)UV—2802SH型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司；2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
表1 葡萄糖标准曲线制作将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min ，取出，冰浴冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL ，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。
酶活力的测定
4. 抑制剂和激活剂
抑制剂和激活剂是影 响酶活力的其他因素 。抑制剂会抑制酶的 活性，而激活剂则会 增强酶的活性。在测 定酶活力时，需要排 除抑制剂和激活剂的 影响，并进行适当的 样品处理和数据处理 以确保实验结果的准 确性
酶活力的测定
酶活力的测定
三、实验步骤与操作要点
酶活力测定的实验步骤包括样品准备、反应体系配制、温度控制、时间记录、产物或底物 浓度测定等。在操作过程中需要注意以下几点
酶活力是指酶催化特定化学反应的能力， 通常以单位时间内转换底物的摩尔数来 表示
通过测定酶活力，可以了解酶的性质、 作用机制以及底物特异性等方面的信息一、酶活力测 定的基本原理
酶活力测定的基本原 理是利用酶催化的化 学反应速率与酶浓度 成正比的性质，通过 测定反应速率来推算 酶的浓度和活力。常 用的方法有终点法、 动力学法和连续监测 法
酶活力测定结果受到多种因素 的影响，包括温度、pH值、底 物浓度、抑制剂和激活剂等。 为了获得准确的测定结果，需 要严格控制实验条件，并进行 适当的样品处理和数据处理
酶活力的测定
1. 温度
温度是影响酶活力的 重要因素之一。大多 数酶在一定的温度范 围内具有最佳活性， 温度过高或过低都会 影响酶的活性。因此 ，在测定酶活力时， 需要选择适当的温度 ，并进行温度控制以 确保实验结果的准确 性
酶活力的测定
四、时间记录
时间记录是酶活力测定的关键步骤之一。在酶促反应过程中，需要准确记录反应时间，以 便计算反应速率和产物生成量。在时间记录过程中，需要注意控制反应时间，避免过长或 过短的反应时间对实验结果的影响
酶活力的测定
五、产物或底物浓 度测定
产物或底物浓度的测定是酶活力 测定的关键步骤之一。通过测定 产物或底物的浓度，可以计算出 酶的活性。在浓度测定过程中， 需要注意选择适当的测定方法， 并进行准确的浓度计算。常用的 浓度测定方法有分光光度法、色 谱法等
糖化酶活力测定
3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意： 加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧 化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处 放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱 农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和 对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖 化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行 反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测 定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生 成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶 的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所 差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温 度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋 酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。
05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)精选全文
可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。
由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。
2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。
三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。
大曲糖化力测定方法
大曲糖化力测定方法
大曲糖化力测定方法是用于评估大曲中糖化酶的活性和效果的方法。
主要通过测定大曲在特定条件下对淀粉的糖化程度来确定糖化力。
以下是一种常用的大曲糖化力测定方法的步骤：
1. 准备样品：从大曲中取出一定量的颗粒或粉末样品，并对其进行研磨，使其尽可能均匀。
2. 制备试样：将一定量的样品（通常是5-10g）与适量的水混合，并在一定温度下搅拌一段时间，以使大曲中的酶完全溶解。
3. 糖化反应：将制备好的试样加入含有淀粉的反应液中，反应液的温度通常为50-60°C。
然后用水浴或恒温箱等设备将反应
液保持在一定温度下，进行糖化反应。
4. 反应时间：根据需要可设置不同的反应时间，常见的糖化反应时间为24-48小时。
5. 终止反应：用热水或其他方法迅速升温至85-95°C，以终止
糖化反应。
6. 反应产物分析：采用不同的分析方法，如高效液相色谱、薄层色谱等，对反应液中产生的糖类进行分析，并计算糖化率或糖化度。
通过这些步骤，可以获得大曲样品的糖化力数据，用于评估其对淀粉的糖化效果。
糖化酶执行标准
糖化酶执行标准本标准规定了糖化酶的酶活力定义和测定方法、酶活力单位定义、糖化酶的活性范围、糖化酶的底物特异性、糖化酶的活性稳定性、糖化酶的存储条件及保质期、糖化酶的外观及物理性质、糖化酶的使用方法及注意事项。
本标准适用于糖化酶的生产、检验和使用。
1.酶活力定义和测定方法糖化酶的酶活力定义为：在规定的反应条件下，每分钟催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
糖化酶活力的测定方法为：将一定量的糖化酶加入底物溶液中，在规定的温度和时间下反应，用葡萄糖氧化酶-DNS法测定反应生成的葡萄糖含量，计算出酶的活力。
2.酶活力单位定义糖化酶的酶活力单位（U）定义为：在规定的反应条件下，每分钟催化底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。
3.糖化酶的活性范围糖化酶的活性范围为：适宜温度范围为40℃-85℃，适宜pH范围为4.0-6.5。
4.糖化酶的底物特异性糖化酶的底物特异性为：能水解淀粉的α-1,4-葡萄糖苷键，生成葡萄糖，但不能水解纤维素和其他多糖。
5.糖化酶的活性稳定性糖化酶的活性稳定性为：在规定的储存条件下，糖化酶的活力保持稳定，有效期不低于2年。
6.糖化酶的存储条件及保质期糖化酶的存储条件为：密封、干燥、阴凉、避光。
糖化酶的保质期为：在上述存储条件下，有效期不低于2年。
7.糖化酶的外观及物理性质糖化酶应为无色至淡黄色的固体或液体，无异味。
其物理性质包括：相对分子质量低于100kDa，溶解性良好，不溶于有机溶剂和水。
8.糖化酶的使用方法及注意事项使用方法：将所需用量的糖化酶加入底物溶液中，搅拌均匀，按照规定的温度和时间进行反应。
反应结束后，用葡萄糖氧化酶-DNS法测定生成的葡萄糖含量。
根据测定结果计算出糖化酶的实际用量。
使用时应遵守使用说明和安全规定。
注意事项：操作时应避免直接接触皮肤和眼睛，若不慎接触，应立即用清水冲洗。
储存和使用时应避免污染和交叉污染。
测定糖化酶活性的方法
测定糖化酶活性的方法测定糖化酶活性的方法是通过测量糖化酶在一定条件下催化底物转化为产物的速率来确定其活性的一种实验方法。
糖化酶活性可以反映糖化酶催化糖化反应的效果和能力，因此在糖化酶的研究和应用中起到重要的作用。
下面将介绍几种常用的测定糖化酶活性的方法。
1. 连续监测法（Continuous Monitoring）连续监测法是一种通过连续监测糖化酶催化反应中底物消失或产物生成的速率的方法。
常用的连续监测方法包括紫外吸收光谱法、荧光分光光度法和电化学法等。
紫外吸收光谱法是利用糖化酶催化反应底物或产物在特定波长下的吸光度改变，通过测定光强变化来间接测定糖化酶活性。
荧光分光光度法是通过测定糖化酶催化反应中产生的荧光物质的荧光强度变化来测定糖化酶活性。
电化学法是利用糖化酶催化反应中产生的电流变化来直接测定糖化酶活性。
2. 间断监测法（Discontinuous Monitoring）间断监测法是一种通过在催化反应开始与结束时测定底物或产物的浓度变化来测定糖化酶活性的方法。
常用的间断监测方法包括酶抑制法、血红蛋白法和多糖沉淀法等。
酶抑制法是通过在糖化酶催化反应中添加一种特定的抑制剂，抑制糖化酶的活性，然后在一定时间内测定抑制前后底物或产物的浓度变化，从而间接测定糖化酶活性。
血红蛋白法是通过测定糖化酶催化反应中产生的血红蛋白含量的变化来测定糖化酶活性。
糖化酶可以将底物中的血红蛋白逐步降解，通过比较血红蛋白的降解速率来测定糖化酶活性。
多糖沉淀法是通过将糖化酶催化反应中的产物与多糖结合形成沉淀，然后通过测定沉淀的质量来测定糖化酶活性。
3. 反射光度法（Reflectance Photometry）反射光度法是一种通过测量糖化酶催化反应中产生的反射率变化来测定糖化酶活性的方法。
在糖化酶催化反应中，底物被转化为产物后，产物的光学性质会发生变化，测量其反射率的变化可以确定糖化酶活性。
总之，测定糖化酶活性的方法很多，选择合适的方法应根据实验的具体目的、测量条件、仪器设备和操作方便性等因素来综合考虑。
β-葡聚糖酶活性测定(精)
β-葡聚糖酶活性测定β-葡聚糖是由葡萄糖单体通过β-1，3和β-1，4糖苷键连接而成的D型葡萄糖聚合物，它主要存在于单子叶禾本科谷实中的糊粉层和胚乳细胞壁中。
β-葡聚糖酶属于水解酶类，能有效地降解β-葡聚糖分子中的β-1，3和β-1，4糖苷键，使之降解为小分子。
由于在饲料中，大麦的β-葡聚糖含量较高，难以被单胃动物消化利用，而且对饲料中各种养分的消化利用具有明显的干扰和抑制作用，成为麦类饲料中的抗营养因子。
在饲料中添加β-葡聚糖酶，能有效地消除β-葡聚糖的抗营养作用，促进饲料中各种养分的消化和吸收利用，增进畜禽健康。
在啤酒生产中，添加β-葡聚糖酶可以加快麦汁和啤酒的过滤速度、提高麦汁得率、增加可发酵糖的含量。
此外，β-葡聚糖酶在造纸工业、日化工业等其它许多方面也有着广泛的应用，对β-葡聚糖酶的研究将越来越受到人们的重视。
β-葡聚糖酶活力的测定方法主要有3种：还原糖测定法（分光光度法）、粘度测定法和底物染色法。
其中还原糖测定法简便实用，比较准确，而且结果重复性好，是广泛使用的一种酶活测定方法。
其原理是：β-葡聚糖酶能将β-葡聚糖降解成寡糖和单糖，其具有的还原基团在沸水浴条件下可与DNS试剂发生显色反应，显色的深浅与还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-葡聚糖酶的活力成正比，因此，可以利用比色测定反应液的吸光度值来计算还原糖的生成量，从而得出β-葡聚糖酶的活力。
但在该测定方法的具体操作中存在一些影响酶活力测定结果的因素，本文即对还原糖法测定β-葡聚糖酶活力的几个重要影响因素进行研究，并得出最佳测定条件。
1 材料与方法1.1 菌株与培养基1.1.1 发酵产酶菌株黑曲霉（Aspergillus niger）A47菌株，由本实验室保藏。
1.1.2 固态发酵培养基麸皮70 g、米糠27 g、NH4NO3 2.95 g、微量元素液0.05 ml、蒸馏水100 ml，pH值5.0，121 ℃灭菌20 min。
糖化酶活力测定
七、注意事项
1. 注意操作安全; 2. 滴定操作时要仔细和准确。糖化酶水解可
溶性粉溶液与滴定后至蓝色消失的溶液两 者色泽的对比。 3. 实验完成以后及时清扫整理； 4. 认真完成实验报告 。
反应试剂配制方法
（1）2%可溶性淀粉 称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸
糖化酶在工业生产中的应用：
糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主 要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时， 淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为 大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发 酵。
糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制 取，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生 产。糖化酶是我国产量最现方式做保护处理对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑并不能对任何下载内容负责
实验三
糖化酶活力的测定
指导老师： 孙运军 研 究 生： 赵 渊
徐妙
一、目的和内容
目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法
内容：１. 学习糖化酶活力的原理． ２. 测定并计算糖化酶活力．
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 粉溶液水解生成1μ mol葡萄糖的酶量定义为1个 酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）×（8/5） ×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中： 10-3—— ml换算成L。
106—— μ mol换算成mol。
五、实验报告
将重复3次测定的糖化酶活力结果记录在 实验报告中，并按提供的两种计算公式分 别计算出酶活力。
六、问题和思考
1. 糖化酶的作用有何特点？ 2. 你认为实验过程中哪些步骤关键，应注意
《生物化学》第四节 酶的活力测定及分离提取
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反竞争反应模式
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反竞争性抑制的速度方程
Vm [I]
· [S]
1 + Ki
=
Km
+ [S]
[I]
1 + Ki
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反竞争性抑制的双倒数方程
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反竞争性抑制的双倒数图形特征
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反竞争性抑制的特点：
⑴ 反竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的 分子结构类似；
⑵ 抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合； ⑶ 必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制
第四节 酶的活力测定及分离提取
一、酶活力的测定 （一）活力（性）的表示方法 （二）测定 二、酶的分离提取
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一、酶活力的测定
（一）活力（性）的表示方法 １、活力—— v
测定酶活力就是测定酶促反应速度。 v ：单位时间内产物的生成量。
单位时间内底物的消耗量。
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2、酶的活力单位（U）：一定条件下，单位 时间内催化一定量的底物起反应所需的酶 量。 1 个酶活力单位（U） ，是指在特定条件下， 在1 分钟内能转化1 微摩尔（μmol）底物的 酶量或是转化底物中1μmol 的有关基团的酶 量。
（3）低温时由于活化分子数目减少，反应速度降低， 但温度升高后，酶活性又可恢复。
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六、激活剂对υ的影响
能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激 活剂。 1、无机离子 阴离子 Cl－、Br－ ； 阳离子 H+
金属离子（Zn2+、Cu2+、K+等）。 2、中等大小的有机分子：GSH、Cys、VC、巯基
复合物结合，使酶的催化活性降低，称为 非竞争性抑制。
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反应模式
10-酶活性测定
酶活性测定---介绍酶活力、比活力的概念以及测定方法⏹酶活力（enzyme activity)●酶活力与酶反应速度酶活力指酶催化一定化学反应的能力，以测出的酶促反应速度表示酶的活力即测定单位时间、单位体积底物减少量或产物增加量来表示测定初速度，测定产物增加量[P]0 X 时间TVVX产物浓度产物浓度变化曲线反应初速度V o●酶的活力单位（U activity unit)酶活力单位（U）的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物的酶量。
国际单位：最适条件下，在1分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定为1个单位，即1IU=1μm/minKcat单位：最适条件每秒钟催化1摩尔底物转化为产物所需的酶量，定为1个Kcat单位.Kcat单位与IU单位之间的换算关系如下：1Kcat=60×106IU1IU=1/60uKcat=16.7nKcatBUT………•限制性核酸内切酶3种定义•用粘度法测活性：30℃，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。
•转化率法：5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。
•凝胶电泳法测活：37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。
⏹酶的比活力（specific activity)●每毫克蛋白质或每毫升蛋白质所含酶的活力单位数，用单位/毫克蛋白或单位/毫升来表示，n U/mg或n U/ml●代表酶的纯度:比活力越大纯度越高●可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力，酶产品质量评价中常使用的指标⏹酶活力的测定方法测定酶活力就是测定产物的增加或底物的减少，根据产物或底物的物理或化学性质来决定具体酶催反应的测定方法●分光光度法：利用底物和产物在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应中反应进行的情况，酶活力测定中最重要的方法。
优点：简便、节省时间和样品增加底物浓度213456780 2 4 6 8底物(m mole)产物80604020S+E↓P(在一定时间里)●荧光法：根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定优点是灵敏度高，缺点是易受其它物质的干扰。
05-01-014作业习题-糖化酶活力测定(精)
天津现代职业技术学院糖化酶活力测定作业一、选择题1、有关酶的各项叙述，正确的是（）A、蛋白质都有酶活性B、酶的底物均是有机化合物C、酶在催化时都不需辅助因D、酶不见得都是蛋白质2、从某组织提取液中提纯一种酶，最理想的酶制品的（）A、蛋白质含量最咼B、活力单位数最咼C、比活力最高D、Km值最低3、酶只所以能加速化学反应，是因为（）A、酶能使反应物活化B、酶能降低反应的活化能C、酶能降低底物能量水平D、酶能向反应体系提供能量4、米氏常数Km是一个可以用来度量（）A、酶和底物亲和力大小的常数B、酶促反应速度大小的常数C、酶被底物饱和程度的常数D、酶的稳定性的常数5、用DNS法测定糖化酶活力，其中使用0.2毫升20%氢氧化钠的目的是（）A、调节溶液pHB、终止反应的进行C、中和醋酸D、稳定反应体系二、填空题1、影响酶促反应速度的因素有_________ ， ______ 和__________ 。
2、糖化酶可以水解淀粉________ 键和________ 键，产物是________ 。
3、在用DNS法测定糖化酶活力过程中，反应体系中加入0.1M醋酸-醋酸钠缓冲溶液是为了达到_______________ 。
4、酶活力大小可以用在一定条件下酶促反应的________ 来表示，_______ 越快, 就表明酶活力越高。
三、应用题1、请说明在糖化酶催化底物淀粉水解的反应中应该注意什么？2、常用的终止酶促反应的方法有哪些？天津现代职业技术学院作业答案一、选择题1、D2、C3、B4、A5、B二、填空题1、温度pH抑制剂/激活剂等2、a -1,4糖苷键a -1,6糖苷键葡萄糖3、酶促反应的最适pH4、反应速率、反应速率三、应用题1、请说明在糖化酶催化底物淀粉水解的反应中应该注意什么？答：①注意提供酶反应的最适反应温度和最适pH,②注意严格记录时间并利用终止剂终止反应的进行，③注意空白管的设立：空白管的体系要与试验管的体系一致，但同时要使酶失活不能水解底物。
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糖化酶活力测定
1. 定义
1g 固体酶粉(或 1ml 液体酶,于 40℃、 pH 值为 4.6的条件下, 1h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖,即为 1个酶活力单位,以 u/g(u/ml表示。
2. 原理
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。
葡萄糖分子中含有醛基, 能被次碘酸钠氧化, 过量的次碘酸钠酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液滴定,计算酶活力。
3. 试剂和溶液
(1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 为 4.6。
称取乙酸钠(CH3COONa·3H2O 6.7g ,溶于水中,加冰乙酸(CH3COOH 2.6ml ,用水定容至 1000ml 。
配好后用 pH 计校正。
(2硫代硫酸钠标准溶液(Na2S2O3, 0.05mol/L。
(3碘溶液(1/2I2, 0.1mol/L。
(4氢氧化钠溶液(NaOH , 0.1mol/L。
(5 200g/L可溶性氢氧化钠溶液。
(6硫酸溶液(2mol/L。
(7 20g/L可溶性淀粉溶液。
(8 10g/L淀粉指示液。
4. 仪器和设备
恒温水浴锅、秒表、比色管、玻璃仪器。
5. 步骤
(1 待测酶液的制备称取酶粉 1~2g , 精确至 0.0002g (或吸取液体酶 1.00ml , 先
用少量的乙酸缓冲液溶解, 并用玻璃棒捣研, 将上清液小心倾入容量瓶中。
沉
渣部分再加入少量缓冲液,如此捣研 3~4次,最后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计酶活力在 100~250u/ml范围内,摇匀。
通过 4层纱布过滤,滤液供测定用。
(2测定于甲、乙两支 50ml 比色管中,分别加入可溶性淀粉 25ml 及缓冲液 5ml ,摇匀后,于 40℃恒温水浴中预热 5min 。
在甲管(样品中加入待测酶液 2ml , 立刻摇匀, 在此温度下准确反应 30min , 立刻各加入氢氧化钠溶液 0.2ml , 摇匀,将两管取出迅
速冷却,并于乙管(空白中补加待测酶液 2ml ,吸取上述反应液与空白液 5ml ,分别置于碘量瓶中,准确加入碘溶液 10ml ,再加氢氧化钠溶液 15ml ,摇匀,密塞,于暗处反应15min 。
取出,加硫酸溶液 2ml ,立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定,直至蓝色刚好消失为其终点。
(3计算
X =(A -B c×90.05×32.2/5×1/2×n×2=579.9×(A -B c×n
式中 X ——样品的酶活力(u/g或 u/ml
A ——空白消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml
B ——样品消耗硫代硫酸钠溶液的体积(ml
c ——硫代硫酸钠溶液的浓度(mol/L
90.05——与 1ml 硫代硫酸钠标准溶液(1mol/L相当的以克表示的葡萄糖的质
量
32.2——反应液的总体积(ml
5——吸取反应液的体积(ml
1/2——吸取酶液 2ml ,换算为 1ml
n ——稀释倍数
2——反应 30min ,换算成 1h 的酶活力系数所得的结果表示至整数。