piRNA研究进展概述

PiRNA 研究进展非编码小RNA在正常的生物学过程和人类疾病中均有重要作用（Esteller, M et al., 2011），主要包括microRNAs（miRNA）、short-interfering RNAs （siRNA）和PIWI-interacting RNAs（piRNA）。

piRNA的发现得益于PIWI蛋白家族的研究，这种蛋白是动物繁衍后代所必须的。

目前，保守估计真核生物基因组上大约具有20,000个piRNA（Moyano, M et al., 2015）。

piRNA首次在果蝇的睾丸中被鉴定为一种新的长的siRNA( long siRNA)，可以沉默位于果蝇X染色体上的多拷贝基因Stellate (Arvain et al, 2001)。

后因与Argonaute蛋白家族亚族PIWI相结合发挥作用而得名，由Arvain等采用层析柱法从小鼠睾丸细胞中分离得到(Arvain et al, 2006)。

PiRNA是一类片段大小在26-31nt单链小RNA，大部分集中在29-30nt，5’端具有强烈的单磷酸尿嘧啶核苷酸倾向性，3’端（2ʹ-O- methyl）进行了甲基化修饰（Kirino et al., 2007）(Fig 1)。

Fig 1 structure of piRNApiRNA 生成机制研究进展已研究的大部分物种中，基因组上散在分布的基因座产生了绝大部分的piRNA，这些基因座被称为piRNA簇（piRNA cluster）。

PiRNA 簇根据能否从基因组上的两条链或一条链产生piRNA而分为双链簇和单链簇。

单链簇piRNA 是分布最广泛的也是默认的类型。

单链簇转录生成piRNA前体与经典的转录途径事实上是难以区分的，基于二者都具有以下几个转录特点：（1）启动子区域都有H3K4me2 (histon 3 lysin 4 dimethylation )标志；（2）转录由RNA聚合酶Ⅱ（pol Ⅱ）负责；（3）经典的RNA转录后加工（5’端帽子修饰、剪切、多聚腺苷酸修饰）（Goriaux C et al., 2014）。

单链簇转录模式在果蝇中研究的比较清楚。

目前，已发现的主要有两个单链簇20A 和flam（Brennecke J et al., 2007）20A 在体细胞滤泡细胞（somatic follicle cell）和生殖细胞中均表达，flam只在滤泡细胞中表达。

Flam具有几个显著的特点（Fig 2）: (1) 位于常染色质和异染色质的边界；（2）flam中含有gypsy家族的TEs ；(3) 启动子具有H3K4me2标记，簇体具有H3K9me2标记。

Flam的转录需要转录因子Ci (Cubitus interruptus)的参与，piRNA前体的剪切产生多个异构体，这些异构体可以通过UAP56和转运蛋白Nxf1和Nxt1转运到细胞质中的Yb小体进行piRNA的成熟和加工（Fig 3）。

Fig 2 flam cluster in the follicle cells of Drosopbila ovaryFig 3 the transcription of flam cluster双链簇是果蝇生殖细胞中piRNA生成的主要方式。

顾名思义，piRNA前体可以从基因组的两条链生成。

这种方式有别于经典的转录方式，是一种启动子非依赖的转录方式，并且不需要剪切和多聚腺苷酸形式的加工。

多项研究表明，Rhino（特异性的结合到piRNA簇的H3K9me2标记），一种异染色体蛋白1（HP1）的同源物(Yu, B et al., 2015)，是双链簇转录的灵魂蛋白。

Rhino被认为是一种“锚”，与Deadlock (Del) 和Cutoff (Cuff) 组成复合物。

Rhino-Del 招募Moonshiner 和TATA box 结合蛋白相关因子2（Trf2）到簇的YR元件起始转录(Malone, C. D. et al,2009; Andersen, P. R et al.,2015 )。

Rhino-Del-Cuff通过抑制剪切和转录终止来确保簇的转录的不断延伸。

转录完成后，piRNA前体通UAP5转运到胞质的nuage区域进行加工（Fig4）。

Fig 4 Fly germline dual-strand clusters’s transcriptionspiRNA前体的加工、成熟发生在特定的亚细胞区域，动物生殖细胞中称作nauge，需要PIWI蛋白的参与（Brennecke J et al.,2007; Lim AK et al., 2007 ）。

体细胞来源的果蝇卵泡细胞中被所谓的“Yb 小体”替代，位于核膜的胞质一侧（Murota Y et al., 2014; Qi H et al., 2011 ）。

依据最新的研究表明，成熟piRNA的生成根据是否依赖于Zuc而分成两种途径，一种是Zuc介导的途径，另一种是Zuc非依赖的生成途径。

核酸内切酶Zuc/MitoPLD，位于线粒体外膜，通过结构及小RNA遗传与生信分析表明。

其在piRNA生成途径中的核心地位。

Zuc不仅参与到了piRNA 5’端的形成，还直接或间接的参与到3’端的产生（Han, B. W et al., 2015）。

随着piRNA簇每隔25nt进行剪切时，果蝇中Zuc的活性表现出一种显著的持续性bi 变化。

此外，在整个加工过程中PIWI蛋白都参与其中，但是PIWI的加载和Zuc剪切之间的关联还不清楚。

Zuc介导的途径主要由以下两个阶段合作完成：（1）“乒乓循环机制”；（2）Zuc依赖的拖尾piRNA生成途径。

“乒乓循环机制”剪切piRNA前体转录本，产生5’端单磷酸基团的pre-pre-piRNA，为Zuc依赖的拖尾piRNA生成途径提供底物。

“乒乓循环机制”具体过程（Fig 5 ）：（1）Aub结合到piRNA（反义链）形成复合物去识别并剪切转座子mRNA，随后较短的剪切产物被装载到Ago3蛋白，发生剪切并产生Ago3-piRNA（正义链）复合体前体，通过Nbr对3’端进行修饰成熟。

成熟的Ago3-piRNA（正义链）复合体识别和剪切piRNA前体转录本，剪切的产物又可以起始新一轮的循环，不断的产生Zuc依赖的拖尾piRNA生成途径的底物。

整个循环过程中，特定的复合物（如Vasa、Krimp、Qin、Spn-E）的装载确保剪切产物被装载到不同的PIWI蛋白（Aub/Ago3）上。

PiRNA的生成以3’方向的形式进行，Zuc以每隔25nt的形式剪切产生拖尾piRNA，该过程中由多个因子参与其中，但是其中的具体机制还不清楚（Fig 5 ）。

最后，Hen1 对拖尾piRNA进行修饰产生成熟的piRNA。

Fig 5 Biogenesis of piRNAs by Zuc-dependent pathwayZuc非依赖的piRNA生成途径主要在果蝇的卵巢中发现，哺乳动物和家蚕中很稀有。

上文提到，“乒乓循环机制”与Zuc介导的途径共同完成成熟piRNA的产生，事实上，“乒乓循环机制”也可以独立发挥功能。

Zuc不存在时，piRNA 5’端通过正常的剪切产生，3’端通过Nbr去尾修饰（Hayashi R et al., 2016）。

秀丽引杆线虫（C.elegans）中不存在“乒乓循环机制”，piRNA (21U-RNAs) 的产生于25-29nt前体，通过前体前两个核苷酸的切除和3’端修饰成熟（Gu W et al., 2012）。

PiRNA 功能研究进展PiRNA首先在生殖细胞中被发现大量表达，其功能是抑制转座子，维持基因组结构的稳定性。

随着体细胞和癌细胞中piRNA的发现，凸显了piRNA功能的多样性和重要性。

下文就piRNA已知的几项主要功能进行阐述。

转座子剪切通过研究piRNA序列发现，生殖系统来源的极大部分piRNA 是被从基因间区转录出来的，基因间区序列富集着大量的转座子序列碎片（Gunawardane LS et al., 2007）。

PiRNA对转座子剪切功能的实现主要体现在piRNA对反转座子RNA进行识别，识别后利用核酸内切酶活性对转座子进行切割，达到抑制反转座子转座目的。

生殖细胞发育过程中对反转座子进行调控是piRNA的主要功能之一。

果蝇的卵泡细胞中，piRNA-PIWI复合物通过识别转座子的初生转录本定位到转录位点，进而招募组蛋白甲基转移酶对H1组蛋白进行H3K9甲基化修饰从而抑制转录（Huang XA et al., 2013）。

PiRNA也可以通过诱导DNA发生甲基化而抑制其转座。

在小鼠的精细胞中，piRNA-PIWI复合体进入细胞核后识别LINE-1的初生转录本，通过一系列反应引起LINE-1 DNA 发生甲基化抑制其表达（Aravin AA et al., 2008）。

大量研究发现，piRNA在其生成过程中伴随着在转录后水平上对转座子的剪切。

这一过程主要通过“乒乓循环”生成途径完成（Saito K et al., 2009）。

表观调控近期研究表明，piRNA途径通过组蛋白修饰和DNA甲基化进行表观调控。

果蝇中，PIWI和Aub蛋白被发现是位置效应斑（position-effect variegation）的调控者，提示piRNA途径通过促进染色体的异染色质化沉默基因表达（Pal-Bhadra,M et al., 2004）。

在小鼠的配子发生中，卵母和精母细胞阶段PIWI和piRNA集中高表达，而这个阶段恰是这两种细胞处于表观修饰最低水平的状态，如DNA甲基化修饰、组蛋白的甲基化修饰等（Sasaki H et al., 2008）。

在诱导多功能干细胞（iPSC）中也发现有piRNA的存在。

iPSC具有分化成各类细胞的潜能，其中表观修饰决定着细胞分化的命运，piRNA与染色体和DNA的表观修饰有关，通过参与这一过程，使得细胞向定向的方向进行分化（Wang Y et al ., 2014）。

除了对基因组的转座子区域进行表观修饰，研究发现，在神经细胞中piRNA通过DNA甲基化影响神经突触的可塑性（Rajasethupathy, P et al., 2012）。

转录后水平调控piRNA对基因的转录后水平调控不局限于转座子。

果蝇卵巢、小鼠生殖组织、非洲爪蛙卵中发现一些编码蛋白的mRNA 3’ UTR区域同样可以产生piRNA。

这些3’ UTR区域含有转座子重复序列，提示，piRNA具有调控mRNA水平的潜能（Robine, N et al., 2009）。

多项实验证明，piRNA pathway 与 P-bodies 紧密相连，P-bodies 是一种胞质复合物-参与翻译调控。