家畜传染病学实验指导：牛传染性鼻气管炎的实验室诊断 免费

实验二十三牛传染性鼻气管炎的实验室诊断

目的

掌握牛传染性鼻气管炎的实验室诊断方法。

内容及方法

对本病的诊断结合流行病学和临诊诊断，即可作出初步诊断。为了确诊，尤其在新发病区，必须依靠病毒的分离鉴定或特异的血清学诊断。

一、病毒的分离与鉴定

牛传染性鼻气管炎是牛的一种呼吸道传染病，患牛康复后仍长期带毒。隐性感染的公牛，精液中含有病毒。病毒的分离可确诊本病或检验牛体带毒情况。 1．材料准备

(1)病料的采取，用灭菌棉拭子伸入鼻道采集其分泌物，放入含青霉素每毫升l 000单位，链霉素1000μg／ml，pH7.2的Earle's液中，也可刮取眼分泌物，处理方法相同；或棉拭子采取脓疱性外阴阴道炎(早期病变)的阴道粘液，处理方法与上述相同；刚死亡的胎儿，立即以无菌采集肺、肾、脾等组织放入每毫升含青霉素1000单位，链霉素1000μg／mlpH7.2的Earle's液中，或取胸水。采集的病料置4℃冰箱保存，并在24h内送到实验室供病毒分离。

(2)病料的处理棉拭子样品，先冻融两次，并充分摇动，挤于拭子，将样品经10000r／min离心10min，取上清液作为细胞培养的接种材料。若是组织样品，经玻璃砂研磨碎后，用Hank's液制成20％悬浮液，经10 000r／min离心10min取上清液供病毒分离。胸水直接经10000r／min离心10min，取上清液供病毒分离。

2．病毒的分离取经处理过的样品0.2ml，接种于已长好单层的犊牛肾或牛睾丸原代或次代细胞培养瓶中，每份样品接种4瓶，置37℃吸附1h后，倾去接种液，用Hank's液洗3次，最后加入含3％犊牛血清(不含IBR抗体)的细胞培养维持液lml，于37℃培养，逐日观察细胞病变。若按种后第?天仍不出现细胞病变，则收取其培养物接种于新制备的细胞培养上，盲传3代，观察细胞病变。出现细胞病变者，收取培养物供作病毒鉴定。细胞病变的特征是细胞变圆，聚合呈葡萄串状，拉网，最后脱落。

3．病毒的鉴定取上述有细胞病变的培养物，经冻融裂解两次后，以10000r ／min离心10min，取上清液作中和试验进行鉴定。其方法，用IBR阳性血清(效价l：32)和阴性血清分别与该分离物等量混合(固定血清、稀释病毒法)，在37℃

的终点。作用60min后；接种于细胞培养，按Reed—Muench法计算分离物TCID

50

若分离物能引起典型的IBR细胞病变，但经细胞中和试验，其阴性血清和阳性血清组的TCID

的对数之差≥2.5者，则判该分离物为牛传染性鼻气管炎病毒。

50

二、常量血清中和试验

本试验是用一定量的已知牛传染性鼻气管炎病毒，检查被检血清中的中和抗

体。

(一)材料准备

1．细胞制备用原代或次代犊牛肾细胞或牛睾丸细胞，一般不超过5代，按常规胰酶消化法制备。原代细胞的培养液为10％犊牛血清，90％的0.5％水解乳蛋白—Earle's氏液，每毫升200单位青霉素，200μg／ml链霉素，用7.5％NaHC0

3

调pH至7.0。次代细胞的营养液为含10％犊牛血清，40％的Earle氏液(MEM)，50％的Earle's液，每毫升200单位青霉素，200μg／ml链

霉素，用7.5％NaHC0

3

调pH至7.0。将细胞分装在扁瓶(15ml装)供继代培养，或小瓶内(1ml装，供中和试验用)培养。细胞中和试验时，应选择生长良好，90％以上形成单层的细胞。接种前，细胞先用内含每毫升200单位青霉素，200μg ／m1链霉素，pH7.1～7.2的Earle's液洗1～2次。

2．抗原制备种毒繁殖是用牛传染性鼻气管炎Baitha—Nu／67弱毒株，接种于原代或次代犊牛肾细胞上培养繁殖，当80％～90％细胞产生典型细胞病变时，收获细胞培养物，冻融2次，经3 000r／min离心10min，取上清液冻结或

冻干保存，并测定病毒滴度 (TCID

50

)，一般不低于10-3／0.1ml，即为抗原。

病毒TCID

50

的测定法，首先将病毒按10倍递增稀释即10-1……10-8。每个滴度病毒稀释液接种4瓶细胞培养瓶，每瓶接毒0.1ml(接种前将瓶中原营养液弃去)，在37℃吸附lh，然后加入含3％犊牛血清的Earle's细胞维持液0.9ml，37℃继续培养，每天定时观察两次，按细胞出现病变的情况做好记录，

一般需观察一周。TCID

50

终点测定按Reed—Mueneh方法计算。

3．标准阳性血清效价不低于1：32。

4．标准阴性血清不含牛传染性鼻气管炎抗体的健康牛血清。

5．血清处理被检血清，阳性、阴性血清，不经稀释，用前均于56℃灭能30min。

(二)操作方法

1．试验时，将已知病毒滴度的新鲜抗原，用含每毫升200单位青霉素，200μg／ml链霉素的Earle's液稀释成100TCID50／0.1ml工作抗原。例如抗原滴度

为TCID

50＝10-6／0.1ml，则工作抗原稀释成TCID

50

＝10-4／0.1ml。

2．取灭能的被检血清原液0.5ml(用于检疫)或经对倍稀释后各种稀释度的被检血清 0.5ml(测定抗体效价)加入0.5mll00TCID

50

0.1ml工作病毒抗原。 3．将抗原一血清混合物充分混匀，置37℃中和1L，其间轻微振荡数次，作用后取出抗原血清混合物．接种于原代或次代细胞瓶中，每份被检血清样品(或每个血清稀释度样品)接种4瓶，每瓶接种0.2ml，置37℃吸附1h后，每瓶加入内含3％犊牛血清，每毫升200单位青霉素，200μg／ml链霉素，pH7.1～7.2的Earle's维持液0.8ml，置37℃继续培养， 72h后观察细胞病变。

4．对照：试验时应设正常细胞，阴性血清加抗原，阳性血清加抗原对照，操作方法同

试验组。被检血清毒性对照，每份血清样品原液0.1ml接种两瓶细胞，吸附1h