牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白主要抗原区域的高效表达纯化与鉴定

· ７８ ·
生物技术
中国畜牧兽医 ２０１３年第４０卷第３期
为模板，进 行 ＰＣＲ 扩 增，ＰＣＲ 反 应 体 系 为 ５０μＬ： ５μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，４μＬ ｄＮＴＰ，引 物 Ｐ１、Ｐ２ 各 １μＬ，ＥｘＴａｑ 酶 １ μＬ，５ μＬ ＤＮＡ，加 水 至５０μＬ。 ＰＣＲ 反应 条 件 为：９５ ℃ 预 变 性 ５ ｍｉｎ；９５ ℃ 变 性 １ｍｉｎ，５８ ℃ 退 火 １ ｍｉｎ，７２ ℃ 延 伸 １ ｍｉｎ，３５ 个 循 环；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ，４ ℃终止。 １．２．４ 构建ｇＤ 基因原核表达载体 将 ＰＣＲ 扩增 产物在１０ｇ／Ｌ 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 后，利 用 ＤＮＡ 多功能胶回收试剂 盒 回 收 目 的 基 因 片 段，将 回 收 纯
化 的 基 因 片 段 与 ｐＥＴ－３０ａ 原 核 表 达 载 体 分 别 用 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切于３７ ℃作用４ｈ，胶回收 酶切后的基因片段用 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶于 ２２ ℃ 连接 ８ｈ，取连接产物 转 化 ＤＨ５α 感 受 态 细 胞，用 质 粒 提 取试剂盒 提 取 重 组 质 粒，经 ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ 双 酶 切鉴定正确后，送生 工 生 物 工 程 （上 海）有 限 公 司 进 行序列测定。
中国畜牧兽Байду номын сангаас ２０１３年第４０卷第３期
生物技术
· ７９ ·
后 的 上 清 中 ，即 以 可 溶 形 式 表 达 ；将 上 清 液 采 用 镍 离 子亲 和 层 析 法 纯 化，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电 泳 显 示，纯 化 后 的 ｇＤ 蛋白具有较高的纯度。 ２．５ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 活 性 检 测 结 果 取 纯 化 后的 ｇＤ 蛋白经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 后，转 印 至 硝 酸 纤 维 素 膜上，分 别 与 ＩＢＲＶ 阳 性、阴 性 血 清 作 用，同 时 设 ｐＥＴ－３０ａ空载体菌表达作对照。由图 ４ 可知，ｇＤ 重 组蛋白能 与 ＩＢＲＶ 阳 性 血 清 发 生 强 反 应，与 ＩＢＲＶ 阴性 血 清 不 反 应，而 ｐＥＴ－３０ａ 空 载 体 表 达 菌 与 ＩＢＲＶ 阳性和阴性血清都不发生反应。
切 ；２，ｐＥＴ３０ａＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ 。
２．３ ｐＥＴ－ｇＤ 重组蛋白的高 效 表 达 由 图 ３ 可 知， ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电 泳 分 析 结 果 显 示，ｇＤ 蛋 白 在 ＢＬ２１ （ＤＥ３）中得到 了 高 效 表 达，表 达 蛋 白 分 子 质 量 约 为 ４０ｋｕ，与 预 期 大 小 相 符 。
图 ４ 表 达 产 物 的 免 疫 印 迹 分 析 注：１，纯 化 蛋 白 与 ＩＢＲＶ 阳 性 血 清 作 用；２，空 载 体 表 达 菌 与
ＩＢＲＶ 阳性血清 作 用；３，纯 化 蛋 白 与 ＩＢＲＶ 阴 性 血 清 作 用； ４，空载体表达菌与ＩＢＲＶ 阴性血清作用。
约８４６ｂｐ的目的片段（图 ２），测 序 结 果 表 明 该 重 组 表达载体的序列和阅读框均正确。
图１ ＲＴ－ＰＣＲ 扩增结果 注：Ｍ，ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｇＤ ＰＣＲ 扩 增 结 果；２，阴 性
对照。
图 ２ 重 组 表 达 载 体 酶 切 鉴 定 注：Ｍ，ＤＬ１５０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐＥＴ－ｇＤ ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ 酶
收 稿 日 期 ：２０１２－０８－２２ 作 者 简 介 ：乃 德 合 （１９７１－ ），男 ，青 海 人 ，兽 医 师 ，研 究 方 向 ：传 染
病防治。
控制提供技术支持。 １ 材 料 与 方 法 １．１ 材 料 １．１．１ 菌 （毒 ）种 与 血 清 ＤＨ５α 菌 种 、ＢＬ２１（ＤＥ３） 菌种、ｐＥＴ－３０ａ原核 表 达 载 体 均 由 青 海 省 动 物 疾 病 中心实验室 保 存；ＩＢＲＶ（ＢａｒｔｈａＮｕ／６７ 株）及ＩＢＲＶ 阳 性 、阴 性 血 清 均 购 自 中 国 兽 医 药 品 监 察 所 。 １．１．２ 试 剂 ＥｘＴａｑ、ＢａｍＨⅠ 和 ＨｉｎｄⅢ 限 制 性 内切酶、Ｔ４ 连 接 酶、低 分 子 质 量 蛋 白 质 Ｍａｒｋｅｒ均 购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组 ＤＮＡ 快速提取试剂盒购 自 北 京 某 生 物 科 技 有 限 公 司；预 染低分子质量蛋白质 Ｍａｒｋｅｒ购自北京索莱宝科 技 有限公司；ＤＮＡ 多功能胶回收试剂盒与质粒提取试 剂盒购自北京百泰 克 生 物 科 技 有 限 公 司；辣 根 过 氧 化物酶（ＨＲＰ）标记兔抗牛ＩｇＧ 购自 Ｓｉｇｍａ公司。 １．２ 方 法 １．２．１ 引 物 设 计 与 合 成 根 据 ＧｅｎＢａｎｋ 公 布 的 ＩＢＲＶ（ＢａｒｔｈａＮｕ／６７ 株 ）基 因 组 序 列，用 ＤＮＡＳｔａｒ 生物学软件分析 ｇＤ 基 因 的 抗 原 区 域 与 亲 水 区，设 计合成１对针对 ｇＤ 蛋白主 要 抗 原 区 域 的 特 异 性 引 物 ，Ｐ１：５′－ＣＣＧＧＧＡＴ－ＣＣＣＣＧＡＴＧＣＣＧＣＧＡＴＡＣ－ ＡＡＣＴＡ－３′；Ｐ２：５′－ＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＴＴＣＧＧＧ－ ＧＧＴＣＴＧＡＣＴＣＴＣ－３′（下 划 线 部 分 表 示 引 入 的 ＢａｍＨⅠ和 ＨｉｎｄⅢ酶切位点）。引物送生工生物工 程 （上 海 ）有 限 公 司 合 成 。 １．２．２ 提 取 ＩＢＲＶ 基 因 组 ＤＮＡ 按 病 毒 基 因 组 ＤＮＡ 快 速 提 取 试 剂 盒 提 取 ＩＢＲＶ 基 因 组 ＤＮＡ， －２０ ℃保存。 １．２．３ ＰＣＲ 扩增 ｇＤ 基因 以提取的ＩＢＲＶ ＤＮＡ
中国畜牧兽医 ２０１３年第４０卷第３期
生物技术
· ７７ ·
牛传染性鼻气管炎病毒ｇＤ 蛋白主要抗原区域的 高效表达、纯化与鉴定
乃德合
（青 海 省 黄 南 州 泽 库 县 泽 曲 镇 兽 医 站 ，青 海 黄 南 ８１１４００）
摘要：参照ＩＢＲＶ 基因组序列，设计合成１对特异 性 引 物，扩 增 了 长 约 ８４６ｂｐ 的 ｇＤ 基 因 片 段。 将 目 的 片 段 定 向 克 隆 到 ｐＥＴ－３０ａ原核表达载体，酶切及测序鉴定均正确后，转化 ＢＬ２１（ＤＥ３）表达菌，经ＩＰＴＧ 诱导得到了以可溶性形式表达的重组蛋 白。重组蛋白纯化后，经免疫印迹检测证明具有良 好 的 抗 原 性 和 特 异 性。 本 研 究 利 用 原 核 表 达 系 统 成 功 表 达 具 有 良 好 抗 原 性的 ｇＤ 蛋白，为ＩＢＲＶ 的深入研究及诊断试剂的研制奠定了物质基础。
图３ 纯化蛋白的 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 注：Ｍ，标准蛋 白 质 Ｍａｒｋｅｒ；１，ｐＥＴ３０ａ 诱 导 表 达 产 物；２，ｐＥＴ－
ｇＤ 诱导 表 达 产 物；３，超 声 破 碎 后 沉 淀；４，超 声 破 碎 后 上 清； ５，纯 化 蛋 白 。
２．４ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 纯 化 图 ３ 可 知，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳分析结果显示，ｇＤ 蛋白主要在细胞破 碎
１．２．５ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 诱 导 表 达 将 酶 切 及 序列 测 定 均 正 确 的 ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 质 粒 转 化 ＢＬ２１ （ＤＥ３）感 受 态 细 胞，同 时 设 ｐＥＴ－３０ａ 空 载 体 转 化 ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细 胞 做 对 照，挑 取 单 菌 落 过 夜 增 菌，次日 以 １∶１００ 比 例 增 菌 至 Ｄ６００ｎｍ 为 ０．６～０．７ 时，加入ＩＰＴＧ 使 其 终 浓 度 为 １．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，继 续 培 养５ｈ，经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳分析表达情况。 １．２．６ ｐＥＴ－ｇＤ 重 组 蛋 白 的 纯 化 将 已 鉴 定 表 达 的诱导菌液以 ５０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ ｍｉｎ，收 集 菌 体， ＰＢＳ洗 涤 ２ 次 后，采 用 超 声 波 破 碎 细 胞，破 碎 后 １２０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ２０ ｍｉｎ，同 时 取 上 清 与 沉 淀 进 行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳分 析 目 的 蛋 白 在 细 菌 中 的 存 在 形 式。对重组蛋白采 用 镍 离 子 亲 和 层 析 法 纯 化，ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 电泳检测纯化蛋白的纯度。 １．２．７ ｐＥＴ－ｇＤ 重组蛋白的 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ活性 检测 取 ｐＥＴ－３０ａ空 载 体 表 达 菌、重 组 ｇＤ 纯 化 蛋 白经 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电 泳 后，转 印 至 硝 酸 纤 维 素 膜，经 ５％脱脂奶粉封闭 ２ｈ 后，分 别 加 入 １∶１００ 稀 释 的 ＩＢＲＶ 阳性血清和ＩＢＲＶ 阴性血清于３７ ℃作用１ｈ， 加入１∶５０００倍稀释 ＨＲＰ 标记兔 抗 牛ＩｇＧ 抗 体 于 ３７ ℃作用１ｈ，在 二 氨 基 联 苯 胺 （ＤＡＢ）缓 冲 溶 液 中 显 色 ，纯 化 水 冲 洗 终 止 反 应 。
２ 结 果 与 分 析 ２．１ ＰＣＲ 扩增结 果 ＰＣＲ 扩 增 产 物 在 １０ｇ／Ｌ 的 琼 脂 糖 凝 胶 上 电 泳 ，约 ８４６ｂｐ 处 可 见 明 显 的 基 因 片 段 （图 １），与 试 验 的 预 期 大 小 相 符 。 ２．２ ｐＥＴ－ｇＤ 表 达 载 体 的 鉴 定 构 建 的 ｐＥＴ－ｇＤ 重组表达载体经 ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切可以切出
关键词：牛传染性鼻气管炎病毒；ｇＤ 蛋白；原核表达；鉴定 中 图 分 类 号 ：Ｑ７８ 文 献 标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１６７１－７２３６（２０１３）０３－００７７－０３
牛 传 染 性 鼻 气 管 炎 （ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａ－ ｃｈｅｉｔｉｓ，ＩＢＲ）又 称 “牛 病 毒 性 鼻 气 管 炎 ”（ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒａｌ ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ，ＢＶＲ）、“坏 死 性 鼻 炎 ”（ｎｅｃｒｏｔｉｃ ｒｈｉ－ ｎｉｔｉｓ，ＮＲ）、“红 鼻 病 ”（ｒｅｄ ｎｏｓｅ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＮＤ），由 牛 传染 性 鼻 气 管 炎 病 毒 （ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｈｉｎｏｔｒａ－ ｃｈｅｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＩＢＲＶ）引 起 （Ｇｉｂｂｓ 等，１９９７；滕 英 娟 等，２０１１）。该病呈 世 界 性 分 布，世 界 动 物 卫 生 组 织 将其列为 Ｂ 类动物传染病，每年都给全球的养牛 业 带来十分巨大的经济损 失（Ｃｏｗｌｅｙ等，２０１１；Ｏｌｉｖｅｉ－ ｒａ等，２０１１；Ｃｒｏｏｋ 等，２０１２）。 中 国 大 陆 于 １９８１ 年 从新 西 兰 进 口 奶 牛 中 分 离 到 ＩＢＲＶ （周 泰 冲 等， １９８１），目 前 该 病 毒 是 中 国 进 出 境 动 物 的 重 点 检 疫 对 象（邹 世 颖 等，２０１２）。ＩＢＲＶ 又 称 牛 疱 疹 病 毒 １ 型 （ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １，ＢＨＶ－１），属 于 疱 疹 病 毒 科 （Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）α疱疹 病 毒 亚 科 （ａｌｐｈａ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉ－ ｎａｅ）水 痘 病 毒 属 （Ｖａｒｉｃｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）（Ｓｃｈｗｙｚｅｒ 等， １９９６；霍志 云 等，２０１２；郭 利 等，２０１２）。ＩＢＲＶ 基 因 组编码１１ 种糖蛋白，其中 ｇＤ 糖蛋白是ＩＢＲＶ 的 主 要结构蛋白，在病毒 吸 附 和 侵 入 宿 主 细 胞 过 程 中 发 挥 重 要 作 用 ，为 病 毒 复 制 的 必 需 基 因 ，同 时 诱 导 体 液 免疫和细胞免疫，是ＩＢＲＶ 的主要免疫原性蛋白，是 ＩＢＲ 诊断试剂 和 亚 单 位 疫 苗 研 制 的 首 选 蛋 白 （Ｐｅｒ－ ａｌｔａ等，２００７；Ｖａｓｉｌｅｎｋｏ 等，２０１２；Ｒｕｉｚ 等，２０１２）。 鉴于此，本研 究 对 ｇＤ 蛋 白 主 要 抗 原 区 域 进 行 了 原 核 表 达 ，并 对 表 达 蛋 白 进 行 了 纯 化 和 活 性 鉴 定 ，旨 在 为开发ＩＢＲ 诊断试剂盒奠定基础，为ＩＢＲ 的预防及