医疗器械微生物检验课件201012

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供试液制备
液体供试品、固体、半固体或黏稠液供试品 取10ml或10g用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1：10 10ml或10g用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀 水溶性液体亦可用混合供试品原液作为供试液
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实验器具
仪器 超净工作台、光学显微镜、恒温培养箱、压力蒸 汽灭菌器、薄膜过滤装置、比浊仪等。 用具 试管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精 密pH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、 pH试纸、滤膜、滤杯、剪刀、镊子、无菌服、 牛皮纸等。
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实验准备
实验环境保证 实验试液 培养基 灭菌方法
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计数培养基适用性检查
培养基接种 金黄色葡萄球菌2 金黄色葡萄球菌2个平皿 大肠埃希菌2 大肠埃希菌2个平皿 枯草芽孢杆菌2 枯草芽孢杆菌2个平皿 白色念珠菌2 白色念珠菌2个平皿 黑典霉2 黑典霉2个平皿
营养琼脂培养基
玫瑰红钠琼脂培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌2 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基：白色念珠菌2个平皿
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计数培养基适用性检查
结果判定 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照 培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态 培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态 大小应与对照培养基上的菌落一致，判该 培养基的适用性检查符合规定。
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样品准备
供试品进入无菌实验室前应作表面消毒， 用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻 底消毒。 检验数量：应从2 检验数量：应从2个以上最小包装单位中抽 取供试品，膜剂还不得少于4 取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小 包装单位）的3 包装单位）的3倍量供试品。
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样品准备
检验量：除另有规定外，一般供试品的检 验量为10 g或10ml；化学膜剂100cm 验量为10 g或10ml；化学膜剂100cm2；贵重 药品、微量包装药品的检验量可以酌减。 要求检查沙门菌的供试品，其检验应增加 20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试 20g或20ml（其中10g或10ml用于阳性对照试 验）。
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药典》 项目 《药典》2010
细菌 真菌 大肠 埃希菌 大肠 菌群 沙门菌 定量：营养琼脂培养基 2个平皿 定量：玫瑰红钠琼脂培养基 至少2个平皿 72h 至少2 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 胆盐乳糖培养基 、MUG培养基 MUG培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 胆盐乳糖发酵培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康 凯琼脂培养基 、乳糖发酵培养基 营养肉汤 、四硫酸钠亮绿培养基 、胆盐硫乳琼脂（或 沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红 亚蓝琼脂）培养基 、三糖铁琼脂培养基 胆盐乳糖 、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 、氧化酶 试验 、绿脓菌素试验、 亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基 亚碲酸钠（钾）肉汤（或营养肉汤）培养基 、卵黄氯 化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基 、血浆凝 固酶试验 庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基 庖肉培养基、含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基 、过 氧化氢酶试验 / 沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、念 珠菌显色培养基、1%聚山黎脂80珠菌显色培养基、1%聚山黎脂80-玉米琼脂培养基、芽 管试验
医疗器械微生物限度检验
何燕英 heyy2006@ 广东省医疗器械质量监督检验所 2010年12月 2010年12月
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概述
微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂 及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
细菌、真菌菌落数 细菌、 微生物限度检查 控制菌
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概述
微生物：形体微小，结构简单，通常要用光学显 微镜和电子显微镜才能看清楚的生物 特点： 1、 个体微小，一般<0.1mm 个体微小，一般<0.1mm 2、构造简单，有单细胞的，简单多细胞 的，非细胞的 3、进化地位低 分类：原核类：二菌，四体（细菌、放线菌、螺旋体、 支原体、立克次氏体、衣原体） 真核类：真菌，原生动物，显微藻类 非细胞类：病毒，亚病毒
非水溶性供试品 ：乳化或萃取 膜剂供试品 ：取供试品100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 ：取供试品100cm ，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠冲液100ml浸泡，振摇，作为1 10的供试液 冲液100ml浸泡，振摇，作为1：10的供试液 肠溶及结肠溶制剂供试品：取供试品10g ，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 肠溶及结肠溶制剂供试品：取供试品10g ，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 (用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml， 用于肠溶制剂)PH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂）至100ml， 置45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1：10的供试液 45℃水浴中，振摇，使溶解，作为1 10的供试液 气雾剂、喷雾剂供试品 ，经处理后同第一项制备供试液 贴剂供试品 具抑菌活性的供试品 ：培养基稀释法 、离心沉淀法 、薄膜过滤法 、 中和法
细菌、霉菌及酵母菌计数用培养基应进行 培养基的适用性检查，成品培养基、由脱 水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
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计数培养基适用性检查
• • • • •
菌种 大肠埃希菌 ［CMCC（B）44 102］ CMCC（ 102］ 金黄色葡萄球菌 ［CMCC（B） 26 003］ CMCC（ 003］ 枯草芽孢杆菌 ［CMCC（B） 63 501］ CMCC（ 501］ 白色念珠菌 [CMCC(F) 98 001] 黑曲霉 [CMCC(F) 98 003] 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5 验证试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌 种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0 种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采 用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物 学特性。
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灭菌方式
湿热：115 湿热：115 ℃ ~121 ℃，15min~30min 物品切勿立即取出置冷处，以免急速冷却， 使灭菌物品内蒸气冷凝造成负压，以致染 菌。 干热：160 干热：160 ℃~ 170 ℃ ，2h 适于耐高温的玻璃、陶瓷或金属器皿的灭菌。 灭菌程序需要经过验证
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计数培养基适用性检查
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实验环境保证
环境清洁，表面消毒（ 75%(V/V)乙醇、新 75%(V/V)乙醇、新 洁尔灭(1：1000)溶液或其他适宜消毒溶液） 洁尔灭(1：1000)溶液或其他适宜消毒溶液） 空气过滤系统，紫外灯或臭氧空气消毒仪
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实验试液
稀释剂 1.0.9%氯化钠溶液 1.0.9%氯化钠溶液 2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 无菌磷酸盐缓冲液、 2.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 3.pH7.0氯化钠 蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性， 氯化钠pH至近中性 3.pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液：调解pH至近中性，其中蛋 白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌落数及控制菌测定。 白胨对菌细胞有保护作用，有利于菌落数及控制菌测定。 表面活性剂、 表面活性剂、中和剂或灭活剂 鉴定用试剂 1.靛基质试液 1.靛基质试液 2.1%二盐酸二甲基对苯二胺试液（氧化酶试液） 2.1%二盐酸二甲基对苯二胺试液（氧化酶试液） 3.三氯甲烷 3.三氯甲烷 4.1mol/l盐酸试液 4.1mol/l盐酸试液
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实验条件
无菌操作技术 实验环境 实验器材
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无菌操作技术
微生物学基础 微生物实践基础 无菌操作意识
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实验环境
洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空 气区域或隔离系统 定期按GB/T16292-16294-1996《 定期按GB/T16292-16294-1996《医药工业洁净 室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》 的现行国家标准进行洁净度验证 实验中监控：实验时将制备好的营养琼脂平板打 开放于实验台上，至实验结束收起，30 开放于实验台上，至实验结束收起，30 ℃ ~35℃ ~35℃ 培养48h，菌落平均数应小于1cfu 培养48h，菌落平均数应小于1cfu/φ90mm
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概述
按医疗用品与人体接触的性质以及对人体使用安 全性要求分三类： a)Ⅰ 类医疗用品：接触人体完整皮肤的医疗 用品 b) Ⅱ类医疗用品：接触人体未破损粘膜的医疗 用品 c) Ⅲ类医疗用品：进入人体无菌组织、器官和血液 以及接触破损皮肤和粘膜的医疗 用品
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常用检测标准
《中华人民共和国药典》 2010年版二部附录XI J 中华人民共和国药典》 2010年版二部附录XI “微生物限度检查法”。 微生物限度检查法” GB 15979-2002 《一次性卫生用品卫生标准》附录B 15979一次性卫生用品卫生标准》附录B
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பைடு நூலகம் 计数培养基适用性检查
菌液制备 细菌新鲜培养物（一般18h~24h，白念24h~48h 细菌新鲜培养物（一般18h~24h，白念24h~48h ， 黑曲霉 5~7天 ），用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 5~7天 ），用0.9%无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数50cfu~100cfu的菌悬液 （黑曲霉用含 含菌数50cfu~100cfu的菌悬液 50cfu~100cfu 0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液） 0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液） 菌悬液在室温下放置应在2 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在 2℃ ～8℃可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液 可以在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液 可保存在2 可保存在2℃ ～8℃，在验证过的贮存期内使用。
GB15979GB15979-2002
定量：营养琼脂培养基 5个平皿 定量：沙氏琼脂培养基 5个平皿 7天 定性：沙氏液体培养基 定性：沙氏液体培养基 7天 / 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂、乳糖发酵培 养基 /