实验三 叶绿体中色素的提取和分离

叶绿体中色素的提取和分离
方案一【实验原理】
（1）叶绿体中的色素能够溶解在有机溶剂丙酮中，所以，可以通过研磨法用丙酮提取叶绿体中的色素(若无丙酮亦可用酒精代替)。

（2）纸层析法：层析液（在60℃～90℃下分馏出来20份石油醚+ 2份丙酮+ 1份苯混合而成）是一种脂溶性很强的有机溶剂。

叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同(溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。

)这样，几分钟之后，叶绿体中的色素就在扩散过程中分解开来。

所以，可以用纸层析法分离出叶绿体中的色素。

【实验器材】
新鲜的绿色菠菜叶片，干燥的定性滤纸，烧杯，研钵，小玻璃漏斗，脱脂棉，载玻片，剪刀，小试管，培养皿盖，药勺，量筒，天平。

丙酮，层析液，二氧化硅，碳酸钙。

【实验过程】
（一）提取绿色叶片中的色素：
1、用天平称取5g绿色的叶片，用剪刀剪碎，放入研钵中；
2、向研钵中放入少许二氧化硅和碳酸钙，再加入5ml丙酮。

由于丙酮具有一定的毒性并且很容易挥发。

为了尽量少的吸入丙酮，可以将一片滤纸盖在研钵上，纸的中心穿一个洞，将杵棒套入洞口进行研磨。

※为什么要加入少许少许二氧化硅和碳酸钙？加入二氧化硅是为了研磨的更充分；加入少许碳酸钙是为了保护叶绿体中的色素，为是由于碳酸钙可以中和液泡破裂后释放出的有机酸，调节液体的PH，防止或避免色素被破坏。

※为什么要加入丙酮？丙酮是有机溶剂可以使色素溶解其中，作为色素的溶剂。

3、将研磨液迅速倒入小玻璃漏斗中进行过滤（漏斗基部放一小团脱脂棉）。

将滤液收集到一个小试管中，及时用塞将试管口塞紧。

（以防止滤液中的丙酮挥发）
※是否可以用滤纸来代替脱脂棉？不可以，滤纸对光合色素具有较强的吸附能力，使滤液的色素分子减少。

（二）制备滤纸条：
取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长6cm、宽1cm的滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，并在距这一端1cm处用铅笔画一条细的横线。

※在剪裁定性滤纸时，尽量注意双手不要接触纸面，以免手上的油脂或其他脏物污染滤纸，影响色素在纸条上的扩散。

※为什么要剪去滤纸条的两角？使层析液在滤纸条上的扩散更均匀。

（三）画滤液细线：
用滴管管吸取少量滤液，放置在一个载玻片上，用第二片载玻片推匀，第三个载玻片取液体沿铅笔线均匀地画出一条直的滤液细线。

画得越细越齐越好，但色素的量要多一些，否则色素带的颜色较浅，不利于观察。

因此，为了增加色素的量，重复画滤液细线二三次。

※重复画滤液细线时，应在上一次干燥以后，再画下一次。

为什么？有利于色素分子保留在细线上，而不会出现扩散现象，使色素带不均匀。

（四）分离叶绿体中的色素：
将3ml层析液倒入烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微斜靠烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培养皿盖盖上烧杯。

※放置滤纸条时要特别注意，不能让滤纸条上的滤液细线浸没在层析液中。

否则，层析液没及滤液细线时，就会使滤液细线中的色素溶解在其中，影响实验结果。

（五）观察实验结果：
几分钟后，取出滤纸条。

干燥后，就能看到色素的分层现象。

【实验结果和结论】
滤纸条上出现4条色素带，说明叶绿体中含有四种色素,胡萝卜素在最上端,呈橙黄色；其次是叶黄素，呈黄色；中间是蓝绿色的叶绿素a ；下端是黄绿色的叶绿素b。

结合实验原理可以知道：溶解度最高的是胡萝卜素，其它依次是：叶黄素、叶绿素a 、叶绿素b。

【重点提示】
1、实验成败的几个关键步骤：
①选材：选材时应注意选择鲜嫩、色浓绿、无浆汁的叶片。

如菠菜、棉花叶等。

②研磨：光合色素分子存在于叶绿体内囊状结构的薄膜上，只有充分研磨，破坏叶肉细胞的细胞壁、细胞膜以及叶绿体膜等，才能使色素被释放出来，并溶解在丙酮中。

③画滤液细线：应以细、直、均匀、颜色浓绿为标准，重复画线时必须等上次画线干燥后再进行，重复2—3次。

④层析时，滤液细线不能没入层析液中。

⑤研磨前加入的物质的量不能太多，一般用药匙一勺即，加丙酮也不能太多，过多会使滤液浓度过低。

2、保证安全的措施：
①研磨过程中，为了尽量少吸入丙酮，可以将纸盖在研钵上，纸中心穿一个洞，将杵棒套入洞口进行研磨。

②由于层析液易挥发，所以层析时烧杯上应盖培养皿盖，防止层析液挥发。

③滤液过滤到试管后，应用棉塞将试管口塞紧，以防止丙酮挥发和色素遇空气氧化。

3、若提取色素为淡绿色，可能原因有：
①研磨不充分，色素末能充分提取出来。

②丙酮加入量大多，稀释了色素提取液；
③末加或入加了碳酸钙，叶绿素分子已被破坏。

方案二：改变层析液：95%乙醇，观察实验结果，并比较两次实验结果。

方案二观察到的现象（色带颜色的顺序）：。