Nbn基因对出生后小鼠海马发育的影响

Nbn基因对出生后小鼠海马发育的影响

作者：王堃,张蕊,郭敏作者单位：辽宁医学院：1. 附属一院;2. 基础学院，辽宁锦州121001

【摘要】目的通过观察神经特异性Nbn基因敲除(Nbn CNS Del)和对照(Nbn CNS Ctr)小鼠海马发育的形态学变化，探讨DNA损伤修复基因Nbn在生后小鼠海马发育过程中的作用。方法应用光镜连续切片和体视学方法对生后(postnatal day, P)7、14、21d的实验组和对照组小鼠海马进行系统地形态学观察和定量分析。结果Nbn CNS Del小鼠海马发育比Nbn CNS Ctr明显滞后，至P21d椎体层和齿状回(DG)颗粒层的截面面积均减小(P<0.05)，DG颗粒层和多形层及CA4区的体密度差异均有统计学意义(P<0.05)。结论DNA损伤修复基因Nbn是小鼠海马发育的一个重要基因，影响小鼠海马椎体层成熟和DG颗粒细胞的发育与成熟。

【关键词】Nbn;小鼠;海马发育;体视学

Effect of Nbn gene on hippocampus development in postnatal mice

WANG Kun, ZHANG Rui, GUO Min

(Liaoning Medical University, 1. First Affiliated Hospital; 2. Basic College, Jinzhou 121001, China)

ABSTRACT: Objective To investigate the role of neuro specific DNA repair gene Nbn in mouse hippocampus development by observing the morphological differences in Nbn CNS Del and Nbn CNS Ctr mice. Methods Serial sections and stereology were used to quantitatively analyze the development of mouse hippocampus on postnatal day 7, 14 and 21. Results Compared with that of the control group, the hippocampus development of Nbn CNS Del mice lagged behind. In Nbn CNS Del mice, on day 21, the profile area of pyramidal layer of hippocampus and granular layer of dentate gyrus decreased (P<0.05), and the volume densities in granular layer and polymorphic layer of dentate gyrus, and CA4 had significant differences (P<0.05). Conclusion DNA repair gene Nbn, an important gene in mouse hippocampus development, affects the development and maturation of hippocampus and granular layer of DG in mice.

KEY WORDS: Nbn; mouse; hippocampus development; stereology

Nbn(在人类称之为NBS)是一种重要的DNA修复基因，其表达的蛋白Nibrin参与DNA损伤修复[1]，如小头畸形、智力发育延迟、组织退化、对DNA损伤剂敏感、染色体不稳定、易患肿瘤等[2 3]，都与DNA损伤修复密切相关。本研究应用光镜连续切片结合体视学方法对Nbn基因敲除(Nbn CNS Del)和对照(Nbn CNS Ctr)小鼠海马发育进行系统观察和定量分析，了解其不同发育阶段的形态学变化，为进一步认识DNA损伤修复基因Nbn对小鼠海马发育的影响及其研究提供基本的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物选择和标本制备

选用P7、14、21d的(129/SV×C57/BL/6)Nbn基因条件敲除的突变系[4 5]小鼠，每组6只，对照组取

相应的同窝仔鼠，雌雄各半，共36只，体重18～20g，以上动物提供及测交试验均由中国医学科学院实验动物中心支持完成。仔鼠经100mL/L水合氯醛麻醉后取出脑组织，沿矢状缝纵向切开，入40g/L中性多聚甲醛固定过夜，常规光镜标本制备，石蜡定向包埋，取连续矢状切片厚3μm，HE染色，光镜观察。

1.2 体视学指标的测定

每个动物的脑组织等间隔选取切片，采用方格测试系统，点计数法，按公式AC=ΣPX•a2测算出海马椎体层和DG颗粒层的截面积，∑Px 为方格系统落在同一海马组织块所有切片上的点数和，a为方格系统中每一小格的边长，在10×10倍光镜下相当于实际长度0.01mm;按公式VV=PX/PC分别测算出海马椎体层、CA4区和DG区颗粒层、多形层的体密度，PX为方格系统落在所测结构的点数，PC为方格系统落在参照系的点数(均以各自的海马为参照系)[6]。

1.3 统计学处理

采用统计软件SPSS16.0对所测各项数据进行析因设计的方差分析和独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜观察

海马结构(简称海马)由海马(即CA区，由CA1、CA2～3和CA4组成)和DG构成。由外向内有分子层、椎体层和多形层三层结构，在大脑半球矢状切面上，呈双重“C”形环抱外形，大“C”即为海马，开口朝向腹内侧，小C代表齿状回，位于海马沟背内侧，开口向背外侧。主要由主细胞层和非主细胞层组成，主细胞层由位于海马的锥体层和DG的颗粒层组成,锥体层由锥体细胞组成,颗粒层由颗粒细胞组成,非主细胞层主要由神经纤维组成[7 8]。

小鼠海马Nbn CNS Ctr组，P 7～21d，均可见大“C”形外形，结构已发育完全，各分区各层截面面积均随时间推移逐渐增大，海马椎体层细胞因分区不同而发育不同步，表现为CA2～3区细胞比CA1区分化早，分化程度好，分化速度快。此外，在同一区也有一定的规律：位置较深的细胞(近多形层)比较浅的(近分子层)分化早，且分化程度好，分化速度快;Nbn1 CNS Del组与Nbn CNS Ctr组相比，P7～21d，大“C”外形和海马各区分层仍清晰可见，但截面面积明显减小约4倍;同时海马CA区还伴有椎体层细胞层数和数目的减低(图1)。

DG区Nbn CNS Ctr组颗粒层细胞排列密集，小“C”形，P7d颗粒层细胞从外臂向内臂染色逐渐加深，越向内侧胞体越小，胞浆深染;CA4及DG多形层内有较多的细胞分布。P14d颗粒层增厚，外臂细胞胞体变大，胞浆内尼氏体丰富呈颗粒状，内臂仍有数层染色较深的细胞;多形层内细胞数目减少，与CA4之间的分界清晰。P21d颗粒细胞均匀的密集分布于颗粒层，染色均匀，内臂消失;CA4细胞数进一步减少，多形层增宽。Nbn1 CNS Del组与Nbn CNS Ctr组相比较，P7d颗粒层小“C”结构部分形成，颗粒细胞稀疏的分散于颗粒层，无明显的内外臂之分;多形层与CA4之间的分界不清晰。P14d “C”形结构清晰可辨，颗粒层细胞厚度明显较Nbn CNS Ctr组变薄，伴有细胞层数和数目的明显减低;无明显内外臂之分;多形层内细胞较多，与CA4之间分界不清。P21d颗粒细胞层细胞数目较前增多，较密集的分布，内侧的内臂所在区仍可见少量的胞体较小的深染区;多形层和CA4区仍有较多的细胞分布(图2)。