盐析法纯化免疫球蛋白
医学免疫学：血清免疫球蛋白的纯化
实验原理
• 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水 基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带 有电荷的情况决定的。
• 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化 膜层减弱乃至消失;同时，中性盐加入蛋白质溶液 后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
• 边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化， 当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体， 当数值下降到10时，停止收集。
• 将收集到的蛋白质液体用OD280和OD260测蛋 白质浓度。
实验结果
• 用紫外分光光度计测全血清和纯化后蛋白质溶液 的吸光度值，并求出蛋白质浓度。
蛋白质含量(mg/ml)= (1.45×OD280－0.74×OD260) ×稀释倍数
1.45和0.74是常数
注意事项
• 实验步骤中，用红色标出的地方。
实验原理—盐析
• 不同性质的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐 而分阶段从溶液中沉淀出来。
• 分离提纯IgG最常用的中性盐是硫酸铵。 • 30～50%的硫酸铵可以沉淀IgG。
实验原理—分子筛层析
• 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。它的突出优 点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温 度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成 分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质 有很好的分离效果。
液。置室温15min，离心3500rpm×10min，弃 上清。 沉淀物用2mlPBS重悬。
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化
牛血清免疫球蛋白的盐析法提取与纯化是一个复杂的过程，包括多个步骤。
以下是一个基本的流程：1. 盐析：首先，需要将牛血清中的免疫球蛋白通过盐析的方法进行提取。
这一步通常使用饱和硫酸铵溶液，通过调节溶液的pH值和离子强度，使得免疫球蛋白在盐析过程中沉淀下来。
2. 洗涤：将沉淀的免疫球蛋白进行洗涤，去除其中的盐分和其他杂质。
3. 溶解：将洗涤后的免疫球蛋白溶解在适当的缓冲液中，以保持其生物活性。
4. 纯化：通过凝胶过滤、离子交换等层析技术对免疫球蛋白进行纯化，去除其中的杂质和不同种类的免疫球蛋白。
5. 浓缩和干燥：将纯化的免疫球蛋白溶液进行浓缩，然后进行干燥处理，得到最终的产品。
需要注意的是，具体的提取和纯化步骤可能会因为实验条件、设备、原材料等因素而有所不同。
同时，为了保证免疫球蛋白的生物活性，需要在整个过程中保持适当的pH值、温度和离子强度等条件。
盐析法纯化免疫球蛋白
★★★★★盐析法纯化免疫球蛋白撰稿欧阳笑梅原理主要材料盐析的操作步骤影响盐析的因素(一) 原理蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
(二) 主要材料1. 试剂:(1) 正常人混合血清；灭菌生理盐水。
(2) 饱和硫酸铵溶液的配制:称(NH4)2SO4(AR)400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。
配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
(3) 萘氏试剂配制：称HgI11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20％NaOH 50ml。
(4) 0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:贮存液:A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4·12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4·2H２O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
(5) 0.1M, PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
(6) 20％磺基水杨酸。
2. 器材:普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5～9.0)、眼科镊子、小剪刀。
烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
实验一兔血清 免疫球蛋白分离与纯化
20ml，使成50%（NH4）2SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，
（3）用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加（NH4）2SO4饱和溶液
3ml，使成33%（NH4）2SO4溶液，充分混合，静置10min。 （4）3000r/min离心10min，弃上清。 （5）为进一步纯化，可重复步骤3 2~3次。
3 透析去盐
蛋白质工程实验课
综合实验一 兔血清免疫球蛋白 分离与纯化
主讲教师：申慧芳
岳续朋
生物工程教研室
实验课要求
预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不能喧哗，不做与实验无关的事 认真完成实验报告 值日要求：擦桌子、拖地、擦黑板、倒 垃圾、关灯和门窗
实验一 兔血清免疫球蛋白分离
蒸水煮沸10min）、饭盒（装碎冰）等。
4. 仪器：搅拌器、离心机等。
5. 溶液配制
三、实验试剂
饱和硫酸铵溶液的配制： 称（NH4）2SO4400～425克，以70～80℃之 蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。 冷却后以浓氨水（28%氨溶液）调PH至7.4。 配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
柰氏试剂
HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml； 搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为 20%的溶液NaOH 50ml。
四、实验步骤
1 兔免疫血清的制备
2 硫酸铵分级沉淀
（1）取制备好的血清20ml，逐滴加入（NH4）2SO4饱和溶液 静置10min。 （2）3000r/min离心10min，弃去上清。
二、实验原理一 盐析
当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和
力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜减弱甚
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
盐析沉淀法纯化血浆中的免疫球蛋白
实训4-1盐析沉淀法纯化血浆中的免疫球蛋白【实训目的】1、掌握盐析的原理。
2、掌握盐析的操作技术。
【实训原理】其原理是蛋白质在高浓度的盐溶液中，随盐浓度的逐渐增高，蛋白质表面的电荷被中和，水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而从溶液中沉淀析出。
【实训设备、材料和试剂】1.器材离心机2.试剂血浆、磷酸盐缓冲液（0.2mol/L,PH8.0）、Na2SO4。
【实训过程】1.血浆清蛋白与球蛋白分离①取血浆10ml置于100ml烧杯中，加磷酸盐缓冲液10ml搅拌10min。
②在搅拌下，慢慢加3.6g Na2SO4使终浓度达到18%。
③加完Na2SO4后继续搅拌20-30 min以充分沉淀蛋白质。
④3500r/min离心20min，弃去上清液（主要含清蛋白），沉淀中含有各种球蛋白。
2.IgG的分离①用8ml磷酸盐缓冲液溶解上述沉淀中的各种球蛋白，并转移到50ml烧杯中搅拌20 min.②3500r/min离心10-20min，取上清液（除杂质）。
③上述上清液中缓慢加入0.96g Na2SO4，使最终浓度达到12%，搅拌20min。
④3500r/min离心10-20min，弃去上清液。
⑤沉淀溶解于4ml缓冲液，搅拌20 min.⑥3500r/min离心10-20min，取上清液。
⑦上清液中缓慢加入0.48g Na2SO4，使最终浓度达到12%，搅拌20min。
⑧3500r/min离心10-20min，弃去上清液（主要含α-球蛋白和β-球蛋白）。
沉淀主要是IgG。
【思考题】1、盐析产物IgG中含有少量的Na2SO4，如何除去？2、如何测定盐析产物IgG的含量？3、用什么方法检测盐析产物IgG的相对分子质量？磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer, PB）试剂：NaH2PO4•2H2O Na2HPO4•12H2O配制方法：配制时，常先配制0.2mol/L的NaH2PO4和0.2mol/L的Na2HPO4，两者按一定比例混合即成0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（PB），根据需要可配制不同浓度的PB和PBS。
血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,IgG)的分离制备―盐析法
血清免疫球蛋白（Immunoglobulin，IgG）的分离制备―盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol /L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。
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盐析法纯化免疫球蛋白
原理
主要材料
盐析的操纵步骤
影响盐析的因素
(一) 原理
蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质四周亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。
当用中性盐加进蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子四周的水化膜层减弱乃至消失。
同时，中性盐加进蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
(二) 主要材料
1. 试剂:
(1) 正凡人混合血清；灭菌生理盐水。
(2) 饱和硫酸铵溶液的配制:
称(NH4)2SO4(AR)400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调PH至7.4。
配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。
(3) 萘氏试剂配制：
称HgI?11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加进20％NaOH 50ml。
(4) 0.02M, PH7.4磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:
贮存液:
A液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO4•12H2O 71.64克，加蒸馏水至1000ml；
B液: 0.2M NaH2P4：NaH2P4•2H２O 3.12克，加蒸馏水至1000ml；
应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。
(5) 0.1M, PH7.4磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer P配制:
将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。
(6) 20％磺基水杨酸。
2. 器材:
普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。
透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密PH试纸(PH5.5～9.0)、眼科镊子、小剪刀。
烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。
(三) 盐析的操纵步骤
取正凡人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加进与
稀释血清等量的饱和硫酸铵[终浓度为50％饱和(NH4)2SO4]
↓4℃，3小时以上，使其充分沉淀
离心(3000rpm), 20分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至Xml。
再逐滴加饱和硫酸铵Ｘ/２ml
↓置4℃，3小时以上［此时(NH4）2SO4的饱和度为
33％)］
重复上述第二步过程1?次。
将末次离心后所得沉淀物以0.02M
PH7.4 PBS溶解至Xml装进透析袋。
│对PBS充分透析、除盐换液3次，
↓至萘氏试剂测透析外液为无黄色
将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以751-G紫外分光光计测蛋白含量。
方法如下:
蛋白含量(mg／ml)＝(1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度。
注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。
(四) 影响盐析的因素
1. 蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
2. 离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。
4. PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH 改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
5. 温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操纵。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
6. 蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。