细胞生长状况有关指标的检测方法

细胞生长状况有关指标的检测方法

一、细胞计数

这是细胞培养中常用的基本技术之一。所用材料为细胞计数板。巴氏吸管和显微镜。步骤如下。

l 取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻擦干。

l 取细胞悬液0.3ml，加入0.9结晶紫染液，混匀后滴半滴于细胞计数板内，以充满不外溢为宜。也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡。

l 在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数。代入下式得出细胞密度。

细胞数（ml）=（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数

台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率。一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝。

细胞存活率=[4大格活细胞数/（4大格活细胞数+4大格死细胞数）]×100%

在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时，需重制细胞悬液，重新计数。

二、细胞生长曲线和生长倍数

细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数的对数为纵坐标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反映出细胞生长的动态。

测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板，分7组，每组3孔，培养1周（7天），期间逐日检测一组，计数，最后把7天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。

也可采用MTT法来进行生长曲线测定。

标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后衰老。

细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度，经1个生长周期达到最大活细胞浓度比例。

生长倍数=培养后最大活细胞数浓度/接种时的活细胞浓度

三、细胞分裂指数

细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标。它以被测的1000个细胞中的分裂细胞数来计算。其方法为：用秋水仙素将细胞处理1-2h后，玩染色制片法制片并染色，计算1000个细胞中分裂象的数目，重复4次取平均值，用百分比表示。

l 细胞准备。用支持物盖片培养法。

l 每24h取出一个小盖片，按常规方法进行固定，吉姆萨染色或HE染色，封片，制成永久标本。

l 显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数。逐个视野进行，对每一时间组的盖片各取细胞多、中、少的区域各一个，共计算1000个细胞，计算出平均分裂细胞所占百分比。观察时要掌握好分裂象标准，主要是确定好划分间期和前期，末期和间期等的界限，以减少误差。

细胞分裂指数=分裂细胞数/细胞总数（1000）×1000

[next]

四、细胞接种存活率

细胞接种存活率又称细胞贴壁率。它是下拨被制成分散的悬液后，以低浓度（2-5个/cm2）接种到底物上，贴壁并能存活生长形成细胞小群（克隆）的细胞百分数值，用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力。

l 取对数生长期细胞，用消化法制成细胞悬液，计数后按检测细胞生长曲线接种细胞的原则，将细胞接种于培养瓶中，接种12-15瓶。

l 每2h取出一瓶，倒掉培养科，然后加入胰酶消化已贴壁细胞，计数已贴壁细胞，用下面的公式逐个计算每个时间上的贴壁率。每2h一次，共观察24h即12次。

接种存活率（贴壁率）=（贴壁村活细胞数/接种细胞数）X 100%

五、克隆形成率

细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增值活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增值能力两个重要性状，由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率低，传代细胞系高；二倍体细胞克隆形成率低，转化细胞系高；

正常细胞克隆形成率低，肿瘤细胞高。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在皿中，持续1周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

1、平板克隆形成试验

l 取对数生长期的单层培养细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在含10%胎牛血清的RPMI培养基中备用。

l 将细胞悬液做梯度倍数稀释，以适当的细胞浓度接种于培养皿中。一般按每皿50个、100个、200个细胞的梯度密度接种于含10ml 37℃预温培养基的皿中，并轻转动，使细胞分散均匀。置于37℃、5%CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2-3周。

l 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养，弃去上清，用PBS小心浸洗2次。加纯甲醇或醋酸/甲醇（1：3）5ml，固定15min。然后去固定液，加适量吉姆萨应用染液染10-30min，然后用流水缓慢洗去染液，空气干燥。

l 将培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜下计数大于10个细胞的克隆。最后计算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆数/接种细胞）×100%

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料的瓶。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2、软琼脂培养克隆形成试验

l 取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1X10^6个/L。然后根据试验要求做梯度倍数稀释。

l 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低熔点软琼脂，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。

l 按1：1比例让1.2%的琼脂糖液和2XDMEM培养基混合后，取3ml混合液注入直径6cm平皿中，冷却凝固作为底层琼脂，置CO2恒温箱中备用。

l 按1：1比例让0.7%琼脂糖液和2XDMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2ml细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层的平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃、5%CO2恒温箱中培养10-14天。

l 把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计算克隆形成率。