细胞各种染色方法

细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。

由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。

目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。

第一节培养细胞的常规检查和观察方法细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。

细胞常规检查观察的内容为：一、肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。

正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。

加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。

在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。

所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。

一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。

培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。

用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。

细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。

贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。

悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。

二、显微镜观察生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。

相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。

若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。

若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。

发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。

三、细胞的生长状态细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。

各种细胞增殖的时间不尽一致。

传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。

成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。

原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。

这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。

传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。

一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。

悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。

四、微生物污染细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。

一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等应怀疑是否有微生物污染，进一步观察检查并及时处理。

第二节培养活细胞的观察方法培养活细胞可用相差显微镜直接观察，也可用缩时摄影直接记录活细胞的动态变化，还可将离体活细胞染色。

一、相差显微镜直接观察法活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。

为了观察活细胞的结构，则需要通过其他途径提高结构的反差。

本世纪30年代，荷兰物理学家Zernike设计的相差显微镜(Phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而成功地解决了生物学上的大难题。

相差显微镜由相差聚光器和相差接物镜两个主要部分组成。

它与普通光镜相比多了两个部件，一个是在聚光器上增加一个环形光阑，使透过聚光器的光线形成空心光锥、聚焦到标本上。

另一个是在物镜的后焦面增加一个相板，相板有一个环形区，其大小恰好通过环形光阑束的直射光，相板各区镀以不同物质，使得通过环形区的光比通过相板其他部位的光超前或滞后1/4λ。

相差显微镜的基本原理是：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构之间的对比度，使标本的各种结构变得更清晰可见。

光线透过标本后，发生折射，偏离了未通过标本的光线的光路，这两组光线合轴后，则发生相互干涉现象。

透过生物标本发生折射的光线与未透过标本的光线之间产生了光程差。

前者被阻滞了1/4λ(波长)。

如果把光程差再增加1/4λ，则变为1/2λ，合轴后两束光线的干涉加强，使标本周围发生晕圈，提高了可见度。

用相差显微镜观察活细胞，并可在镜下连续拍摄记录体外培养细胞的活动，如细胞分裂、细胞迁移运动等过程。

相差显微镜观察活细胞的步骤如下：1、调整好相差显微镜首先调好相位板，使聚光器相位板号与接物镜放大倍数(相位板)相一致。

然后抽出接目镜，再换辅助望远镜，移动辅助镜筒并调整聚光器相位板，使视影中两个大小一样的光环相互吻合。

再重新换上原接目镜，即成相差图像。

当更换不同倍数接物镜时，需按上述过程重新调节。

2、观察瓶皿准备准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净，勿留任何残留污迹。

3、调光主要调整照明光的照明度和光轴，令视野照明均匀。

首先用低倍镜，并把照明灯虹彩光调至最小，使光落于视野中央；如有偏斜可用聚光器的调整螺丝进行调整。

然后打开虹彩使视野内呈均匀照明强度，并使目的物图像达到最大限度反差为止。

4、调焦与摄影较高级的相差显微镜视野中间都有双线十字，调焦前先转动目镜使十字的双线清晰，然后再用调焦旋扭调节物镜，使观察物体清晰。

在照相目镜上也要采用同样步骤调焦。

摄影目镜与观察目镜焦点不一致时，也要根据需要调焦，一般照相时以摄影目镜为主，观察时以观察目镜为主。

照相时应做好记录，把细胞种类、代数、观察内容、放大倍数、时间等一一记录下来，以备后查和对比。

5、细胞观察生长在瓶底上的细胞最适宜用倒置光相差显微镜观察，而且需附有长焦距集光器，才能观察厚度较大的培养瓶（或皿）。

若用油浸镜观察细胞微细结构，需用支持物培养法，把细胞培养在长形盖片上，观察时从瓶中取出制成临时标本。

方法为：取一大型载物片，再取一块优质滤纸剪成长方窗形，置于载物片上，用吸管向纸框中滴数滴培养液，使充满框内空间和浸湿纸框；把生长有细胞的盖片含细胞面向上放在纸框中，再覆以大盖片。

观察时应不断从标本测面滴加适量营养液，以防不断蒸发。

此法只限于短时间观察细胞之用。

用相差显微镜观察细胞应注意瓶（或皿）的厚度、均匀性、清洁度、气温等。

经标准化生产的培养板、培养瓶（或皿）一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。

天气较冷时，若与显微镜观察处温差较大，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，此时可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。

若对原代细胞培养进行相差显微照相，最好选择换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。

观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈振荡。

观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。

二、暗视野显微镜技术观察活细胞暗视野显微镜(dark field microscope)是利用特殊的聚光器，使照明光线斜射不能进入物镜，所以视野是暗的，只有经过标本散射的光线才能进入物镜被放大，在黑暗的背景中呈现明亮的像。

这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，甚至可以观察到5nm的微小质点。

这种观察方法主要观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，只适合于观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和霉菌等。

所以这种方法已较少应用。

三、缩时显微摄影观察这是随着现代科技发展而出现的一种新的观察方法。

缩时显微摄影术（time-Lapse Cinemicrophotagraphy,TLCM）可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。

如接上显微镜闭路电视系统或接上观察细胞变化的定格电视记录装置，则更直观地观察到细胞的变化。

但由于这套系统较昂贵，所以应用尚不普遍。

四、离体活细胞染色观察1、中性红染色中性红是常用的活体染色染料，常用的浓度为1:10000，用生理盐水(或Hanks液)溶解后进行高压蒸气灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。

因其毒性大，染色后细胞不能再培养。

2、结晶紫染色使用浓度为0.1%，可用生理盐水配制，室温保存。

该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。

3、台盼蓝染色用0.5%浓度的台盼蓝（Trypan blue）,用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。

第三节细胞固定观察法体外培养细胞除可直接观察活细胞外，还可以用固定细胞的方法将细胞制成永久标本进行观察。

固定染色观察，既可显示细胞形态，也可揭示细胞的微细结构，是细胞培养中常用的观察技术。

其基本技术为固定染色和观察。

一、细胞固定基本方法无论用双盖片悬浮培养、加盖片单层培养还是悬液培养，都能将细胞固定染色，其中以盖片培养最常用。

其步骤为：（1）培养时加入一清洁盖片。

(2)待盖片长满细胞或所需的适宜时期用镊子轻轻取出盖片，迅速投入37℃Hanks液中漂洗两次，每次3～5秒钟，以洗除血清防止其妨碍染色；如用悬液培养的细胞时，需离心(800rpm)，除去含血清的培养液，再向沉降细胞中加入少许温Hanks液，用吸管轻轻吹打漂洗后，留少许悬液，再做涂片，凉干后固定。

（3）固定将上述玻片浸于固定液15分钟。

常用的固定剂有甲醇/醋酸、FAA固定液、Carnoy。

甲醇/醋酸浓度为甲醇3分，冰醋酸1分，现用现配，适用于观察染色体和Giemsa 染色。

FAA固定液浓度为：80%酒精90.0mL，冰醋酸5.0mL，中性福尔马林(40%甲醛，用时向瓶中加过量MgCO3中和)5.0mL。

适用于盖片单层培养，固定效果好。

Carnoy是较好的非水溶性固定液，浓度为纯酒精60.0mL，氯仿30.0mL，冰醋酸10.0mL，适用于显示细胞化学成分等方法，如粘多糖等，对固定培养单层细胞效果很好。