《食品安全国家标准 食品中三甲胺的测定》编制说明

食品安全国家标准《食品中三甲胺的测定》

编制说明

一、标准起草的基本情况

1、任务来源：国家卫生和计划生育委员会（原卫生部）

2、项目编号：spaq-2012-61 标准名称：食品中三甲胺的测定

3、标准起草单位：国家食品安全风险评估中心，湖北省疾病预防控制中心

4、主要起草人：蒋定国，杨大进，闻胜，周妍，刘潇，毛燕妮，罗苹，陈明

简要起草过程：根据《2012年卫生标准制（修）订项目委托协议书》要求，标准起草小组自2012年7月起，依据标准制定程序和要求，查阅国内外的文献资料，对方法的技术参数进行了研制，按标准化工作导则编写标准检验方法和编制说明，并对本方法进行了验证，发放了检验方法征求意见稿，通过广泛征求意见，增强标准的科学性和可操作性。按照协议要求，于2013年12月底完成国家标准送审稿，按期提交。

二、与我国有关法律法规和其他标准的关系

氧化三甲胺广泛分布于猪肉、鱼和虾等动物性食品中，在微生物和酶的作用下会降解生成三甲胺和二甲胺。我国在GB 2730-2005腌腊肉卫生标准中规定了三甲胺氮的25mg/kg限量值，相当于三甲胺105.5 mg/kg。为了解决准确测定三甲胺的含量问题，需要建立更为灵敏和准确的色谱检测方法，同时扩大检测食品范围，此次建立的检测方法是作为卫生标准的配套检测方法。

三、标准的重要内容及主要修改情况

（一）方法条件的选择

1、提取方法的选择

为了更准确地检测，需要先用提取溶液把三甲胺提取出来，再与标准溶液一样进行顶空方法检测。由于三甲胺在酸性条件下可以形成铵盐，易溶于水溶液，同时动物性食品含有大量脂肪、蛋白质，而三氯乙酸有利于沉淀蛋白质，因此通过实验研究，最终选择5%三氯乙酸水溶液作为提取溶剂。在顶空处理时，加入碱液将铵盐转化为挥发性的胺，使三甲胺在气液两相达到动态平衡，而其他酸类物质留在溶液中，进入气相色谱柱的干扰就少。

对于提取方式的选择，研究表明均质机匀浆提取，每次提取1分钟就可以使提取溶液较好地进入组织内部，迅速提取目标物，提取效率高，因此选择均质机匀浆提取方式。

2、仪器条件的选择

（1）色谱柱的选择

GC-FID的色谱柱：比较了HP-5 30m（长）×0.32mm（内径）×0.5µm（膜厚）（含5%二苯基）、DB-WAXetr 30m（长）×0.32mm（内径）×0.5µm（膜厚）（聚乙二醇）、FFAP 30m （长）×0.32mm（内径）×0.5µm（膜厚）（含改性聚乙二醇）3种色谱柱的分离效果，实验结果表明：DB-WAXetr和FFAP 色谱柱都能较好地将实验样品中脂类、其他胺类等干扰物与三甲胺完全分开，其中DB-WAXetr分离效果最好，因此选择DB-WAXetr作为GC-FID的色谱柱。

GC-MS的色谱柱：根据GC-FID的色谱柱实验结果，本方法测试了与DB-WAXetr固定相相同的质谱柱HP-INNOWAX 30m（长）×0.25mm（内径）×0.25µm（膜厚），结果表明HP-INNOWAX 柱的分离效果满足分析要求。

（2）升温程序的选择

因三甲胺沸点比较低（3℃左右），DB-WAXetr色谱柱最低使用温度为40℃左右，因此初始温度选择了40℃，保持3min，三甲胺已出峰，然后以30℃/min速率升至220℃，保持1min，样品中各成分均已出峰，在色谱柱中无残留，因此升温程序最高温度选择为220℃。同理，GC-MS的HP-INNOWAX柱升温程序也选择为：40℃保持3min，以30℃/min速率升至220℃，保持1min。

（3）质谱条件的选择

三甲胺分子量为59，属于小分子，根据其性质和文献调研，选择EI源作为离子源，离子源温度对三甲胺的响应值影响不大，选择220℃为离子源温度，选择响应值较高的m/z 58、m/z 59和m/z 42三个离子作为定性离子，以丰度最高的m/z 58为定量离子。

3、顶空条件的选择

（1）氢氧化钠的加入量：因加入氢氧化钠固体溶解比较慢，而且称取和操作不太方便，因此试验表明氢氧化钠的用量为：顶空瓶加入2ml提取液或标准溶液，压盖密封，再用医用注射器注入5mL50%NaOH溶液。这样既可以防止三甲胺逸出，又能准确控制加入NaOH的量。

（2） 平衡温度：实验结果表明：提高平衡温度，虽对测定灵敏度有所提高，但温度越高，水蒸汽分压越大，对分析不利，且蒸汽过多进入色谱柱，易造成色谱峰拖尾和方法精密度下降。故本方法平衡温度选用40℃。

（3）平衡时间：实验结果表明：平衡时间对于三甲胺的释放有一些影响，猪肉和鱼肉样品在平衡40min后才到达平衡。因此本方法选定的平衡时间为40min。

（二）方法的线性范围和检测限

在1.0mg/L～40.0mg/L浓度范围，GC-FID法的三甲胺浓度-响应峰面积的线性回归方程为y = 85.631x - 79.034，R = 0.9997，GC-MS法的三甲胺浓度-响应峰面积的线性回归方

程为y = 344113x – 228785，R = 0.9995，均呈线性关系，均符合定量要求。

按标准曲线最低点计算方法的定量限，检出限定为定量限的0.3倍，因此当称样量为10g，定容体积为50mL，方法一（GC-MS）和方法二（GC-FID）的定量限均为5.0mg/kg，检出限均为1.5mg/kg，远低于火腿中105.5 mg/kg限量标准值，满足监管需要。

图8 三甲胺标准的质谱图

三甲胺

图10 三甲胺标准溶液（12.0mg/L）选择离子（m/z 58）图

图11 浓度为24.0mg/L的三甲胺标准图谱（GC-FID）

（三）方法的精密度和准确度

做了三种食品的三个浓度水平添加，加标浓度分别是 5.44 mg/kg、17.2mg/kg和25.0mg/kg，每个水平平行测定三次。实验结果表明：三种食品的平均回收率范围为94.67%～106.6%，总平均回收率为98.0%。

分别用方法一（GC-MS）和方法二（GC-FID）分析两个三甲胺水平浓度样品，每个浓度平行测定6次，结果表明：方法一（GC-MS）的精密度在2.72%～4.08%范围内，方法二（GC-FID）的精密度在3.4%～4.06%范围内。

（四）实际样品的检测

从市场购买猪肉、牛肉、羊肉等肉类，草鱼、虾仁和黄花鱼等动物性水产品，以及金华火腿、火腿肠等加工动物性食品，取肌肉部位，一部分于-18℃冷冻保存5天，另一部分于4℃冷藏5天，用上述两种方法检测，结果表明-18℃保存的样品三甲胺浓度能检出，但低于定量限，而4℃冷藏保存的样品中三甲胺浓度均有所提高，畜禽肉类中三甲胺浓度升高慢一点，但鱼和虾水产品三甲胺浓度升高较快。

（六）验证实验和盲样测试

为验证本方法的有效性和适用性，选择3家不同地区的食品检测机构对本方法进行验证，验证内容为方法的线性范围、定量限、精密度、准确度及盲样的检测。

3家验证单位测试了在1.0mg/L-40mg/L浓度范围内的三甲胺，浓度和标准峰面积呈线性，相关系数均r>0.999，方法定量限（LOQ）为5.0mg/kg。3家验证单位进行了三种食品的三个浓度添加水平的6个平行测试，回收率为95.69%～106.51%，相对标准偏差为2.19%～7.50%。3家验证单位对鸡肉、虾仁和火腿样品送检的3份样品进行测定，其相对偏差为