杀菌剂生物测定技术

（1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列 梯度浓度，一般5~7个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如 真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜 （15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜。
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（3）待培养基冷至50℃左右（凭经验估计）， 迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后， 倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板。
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二、杀菌剂生物测定的应用
1 从大量合成化合物中筛选出有可能作为 杀菌剂的化合物
2 为特定的植物病害寻找有效的药剂，为 此需要进行筛选杀菌剂毒力的比较
3 杀菌剂作用方式及作用机制的研究
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4 杀菌剂抗性的研究 5 杀菌剂混用及剂型研究 6 杀菌剂抗雨水冲刷能力及残效作用的研究 7 某些杀菌剂（特别是农用抗菌素）的微量分析
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原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其 他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在 上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻 片上），在保温，保温条件下培养一定时间 后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢 子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可 获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。
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三、杀菌剂室内主要生测方法
孢子萌发法 含毒介质培养法
叶碟法
管碟法 滤纸片法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法
抑菌圈法
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1.孢子萌发法
孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用 的 杀 菌 剂 毒 力 测 定 方 法 。 早 在 1807 年 。 Prevost 就采用此法，后经不少学者改进， 使之日趋规范、合理。
对照萌发率－处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）＝－－－－－－－－－X100
对照萌发率
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LC50 和LC95的计算
将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y； 药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归， 求得回归方程Y＝a+bx，可得LC50和LC95.。
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孢子萌发法的适用范围
孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans） 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）
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抑菌圏法的优缺点
抑菌圏法的优点
精确度高 操作简单
抑菌圏法的缺点
溶解性 扩散性
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抑菌圈法示意图
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含有孢子 的培养基
不同浓度 的药液
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根据施加药剂在洋菜培养基表 面的方式，抑菌圈法又分为管碟法 Leabharlann Baidu牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法。
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管碟法 又称牛津杯法
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2.含毒介质培养法
有3种： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法
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（1）抑菌圈法的原理
基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基 （通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管 碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接 触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩 散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受 到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大 小来比较不同杀菌剂的毒力大小。
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水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae） 等。
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注意事项
上述操作应尽量在无菌条件下进行，
以防污染
操作室的温度最好在26～28℃左右，
如室温太低，则50℃左右的培养基在操作 过程中迅速冷凝，无法制作平板
十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误
差
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滤纸片法
（1） 配制不同浓度的药液
孢子萌发的标准
以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。 用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养， 培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低倍 镜下，每处理随机检查200个孢子。
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抑制率计算
孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。
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（4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个 不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。 内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1 个管为对照，其余5管为5个不同浓度的药液， 在适合的温度下培养一段时间，取出用十字 交叉法测是抑菌圈的直径。
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抑菌圈法示意图
第三章 杀菌剂生物测定技术
供试菌种 杀菌剂生测的应用 杀菌剂生测方法 杀线虫生测方法 杀菌剂盆栽试验 杀菌剂田间药效试验
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杀菌剂室内生物测定的主要内容 是将杀菌物质作用于细菌、真菌或 其他病原微生物，根据其作用的大 小来判定药剂的毒力。或将杀菌物 质施于植物，对病害发生的有无或 轻重观察比较来判定药剂的效果。
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一、供试菌种
供试病原菌要求
在分类上有一定代表性，最好是重要的农 业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。
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常用的供试菌种
番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）