一株沼泽红假单胞菌对氮磷的同化能力

一株沼泽红假单胞菌对氮磷的同化能力摘要:采用单因素和正交试验研究了不同营养成分对一株沼泽红假单胞菌氮磷同化能力的影响｡结果表明,KH2PO4对沼泽红假单胞菌同化氮磷的能力有显著的影响｡在同等发酵生物量的情况下,当NH4Cl为0.05 g/L､KH2PO4为1.40 g/L､酵母抽提物为1.00 g/L时,可使沼泽红假单胞菌的氮磷同化率分别由原来的32.51%和5.98%提高到48.02%和7.76%｡关键词:沼泽红假单胞菌;浓度梯度;生物量;氮磷同化The Nitrogen and Phosphate Assimilating Capacity of a Rhodopseudomonas palustris StrainAbstract: The effect of different nutriednt types on assimilative capacity to nitrogen and phosphate of a Rhodopseudomonas palustris strain was studied through single element and orthogonal experiments. The results showed that KH2PO4 was a notable factor affecting the assimilative capacity of this bacterium to nitrogen and phosphate. In condition of same fermented biomass, the assimilation efficiency of R. palustris for nitrogen and phosphate could raise up to 48.02% and 7.76% instead of 32.51% and 5.98% respectively, when the content of NH4Cl was 0.05 g/L, KH2PO4 was 1.40 g/L and yeast extracts was 1.00 g/L.Key words: Rhodopseudomonas palustris; concentration gradient; biomass; assimilation of nitrogen and phosphate目前,沼泽红假单胞菌被广泛应用于海水､淡水鱼类､虾类及贝类等的养殖和育苗,它能将水体中的有机质和氮磷等物质同化为菌体成分存在于水中,同时消解硫化物[1],减少水体污染物,减少有毒分解产物[2,3]｡沼泽红假单胞菌还能与异养微生物共同作用,高效率地降解废水中的有机物,同时还能调节水体的pH在适宜的范围内,增加水体中的溶解氧含量[4]｡有学者曾对沼泽红假单胞菌的氮磷代谢生理特性进行了研究,相关文献报道沼泽红假单胞菌具有降氮除磷的能力[3,5],固定化的沼泽红假单胞菌对废水中氮磷的去除率可以分别达到61.9%和73.0%[6]｡但对于沼泽红假单胞菌同化氮磷适宜条件的研究相关报道较少,而且也不是很全面｡为此,对保藏的一株沼泽红假单胞菌的氮磷同化能力在实验室条件下进行了初步研究｡1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌种沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)由华中农业大学生命科学技术学院发酵工程室保藏｡1.1.2 光合细菌初始培养基NaCl 5.00 g,NH4Cl 1.00 g,酵母抽提物 1.00 g,CH3COONa·3H2O 5.00 g,KH2PO4 1.75 g,H2O 1 000 mL,溶解后调pH至7.0,高压､121 ℃灭菌30 min｡试验所用试剂均为分析纯｡1.2 试验方法1.2.1 培养基不同浓度梯度影响试验配制不同浓度梯度培养基:将初始浓度培养基分别稀释20､40､60､80和100倍,调pH为7.0｡以10%(V/V)的接种量将沼泽红假单胞菌种子液(只含菌体)接入容积为550 mL的带胶塞透明玻璃瓶中,内含稀释培养基500 mL,置于28 ℃恒温培养室中用40 W白炽灯连续光照培养5 d｡每一浓度梯度3个平行,每天取样测定培养基中残留的氮磷量(菌体已滤除)｡1.2.2 不同营养成分的单因素试验1)NH4Cl对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响｡将初始培养基中的NH4Cl分别稀释20､40､60､80和100倍,其他组分不变,按照1.2.1的方法进行培养,5 d后测定其OD660nm及TN､TP同化率｡2)KH2PO4对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响｡将KH2PO4分别按0.35､0.70､1.05､1.40和1.75 g/L添加于培养基中,其他组分不变,按照1.2.1的方法进行培养,5 d后测定其OD660nm及TN､TP同化率｡3)酵母抽提物对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响｡将酵母抽提物分别按0.60､0.80､1.00､1.20和1.40 g/L添加于培养基中,其他组分不变,按照1.2.1的方法进行培养,5 d后测定其OD660nm及TN､TP同化率｡1.2.3 不同营养成分的正交试验在沼泽红假单胞菌生长过程中,直接影响氮磷同化率的因子分别为NH4Cl､KH2PO4和酵母抽提物｡为研究KH2PO4､酵母抽提物和作为氮源的NH4Cl对沼泽红假单胞菌生长培养基的综合效应,进行L9(34)正交试验(表1)｡1.2.4 验证试验将沼泽红假单胞菌种子液(只含菌体)以10%(V/V)接种量分别接入初始培养基和改良后的培养基内,每种培养基做3个平行｡28 ℃下用40 W 白炽灯连续光照培养5 d后,测其OD660nm及TN､TP同化率｡2 结果与分析2.1 培养基不同浓度梯度对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响随着培养时间的延长,沼泽红假单胞菌开始繁殖,初始培养基中的氮磷残留量逐渐下降,5 d时沼泽红假单胞菌吸收氮磷的含量分别为98.73､23.76 mg/L(图1)｡随着稀释倍数的不断增加,培养基中残留氮素呈先下降后上升的趋势,拐点出现在接种后第二或第三天,而培养基中磷素变化较小｡试验结果表明,沼泽红假单胞菌首先利用培养基中的氮磷合成自身组分,满足自身生长繁殖需要｡随着营养物质逐渐被消耗,菌体之间形成竞争关系而使部分菌体因营养贫乏而死亡,其体内氮磷又释放到培养基中,因此形成培养基残余氮磷浓度先降后升的趋势｡在稀释100倍时,培养基氮浓度较为接近湖水中的实际情况,其拐点在第二天出现,表现得较为提前,说明该菌株在实际应用过程中,投菌后两天内除氮效率最高｡这为如何更加经济地使用沼泽红假单胞菌提出了新的研究思路｡2.2 单因素试验结果分析2.2.1 NH4Cl对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响随着NH4Cl稀释倍数的增加,沼泽红假单胞菌的生物量在稀释0~60倍内变化不大,而在稀释20倍即浓度为0.05 g/L时,TN的同化率最高,达到42.08%,TP的同化率也处于一个相对较高值,达到5.11%(图2)｡因此,综合考虑选择稀释20倍即浓度为0.05 g/L的NH4Cl较好｡2.2.2 KH2PO4对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响随着KH2PO4浓度的增加,沼泽红假单胞菌菌体逐渐增大｡当培养基中KH2PO4的浓度为1.40 g/L时,其菌体生长和添加1.75 g/L KH2PO4时无显著差异;当KH2PO4浓度为1.05 g/L和1.40 g/L时,TN同化率分别达到43.28%和41.74%,TP同化率也达到了 6.34%和5.26%(图3)｡因此在保证发酵生物量的前提下,选择KH2PO4 1.40 g/L的浓度比较好｡2.2.3 酵母抽提物对沼泽红假单胞菌同化氮磷的影响随着酵母抽提物浓度的增加,沼泽红假单胞菌逐渐生长｡当培养基中酵母抽提物的浓度为1.0 g/L时,TN ､TP的同化率最高,分别达到41.46%和5.54%(图4),同时菌体生长与添加1.2和1.4 g/L酵母抽提物时无显著差异｡因此,从经济上考虑,选择添加1.0 g/L的酵母抽提物较好｡2.3 正交试验结果分析根据以上单因素试验结果选择不同水平合理安排正交试验｡通过极差､均值分析,可以得出沼泽红假单胞菌氮磷同化率的最优结果及主要影响条件｡从试验结果可以看出,B因素(KH2PO4)是影响沼泽红假单胞菌氮磷同化率的主要因素｡这可能是由于沼泽红假单胞菌的生长繁殖需要一定浓度的磷元素｡沼泽红假单胞菌对磷的同化率较低,因此在分析中以TN同化率作为主要判断依据,从而选出最优水平组合为A2B2C2,即选择NH4Cl 0.05 g/L,KH2PO4 1.40 g/L,酵母抽提物1.0 g/L(表2)｡2.4 验证试验结果分析经过研究发现,初始条件下培养基中氮磷浓度分别由303.69 mg/L､397.25 mg/L 下降到204.96 mg/L､373.49 mg/L,氮磷同化率分别为32.51%和5.98%｡而优化后可以在保证沼泽红假单胞菌发酵生物量的前提下降低氮磷浓度的起始量,培养基中氮磷浓度分别由118.64 mg/L､317.80 mg/L下降到61.67 mg/L､293.13 mg/L,氮磷同化率分别为48.02%和7.76%(图5)｡3 小结与讨论在满足最大发酵生物量的情况下,沼泽红假单胞菌生长培养基中的营养成分分别为NH4Cl 0.05 g/L､KH2PO4 1.40 g/L､酵母抽提物1.00 g/L时,可以提高该菌对培养基中氮磷的同化效率,其分别达到48.02%和7.76%｡周茂洪等[3]研究的试验结果表明沼泽红假单胞菌具有一定同化磷的能力,可以将培养基中的无机磷同化为有机磷｡在以乙酸钠或苹果酸为碳源的条件下,沼泽红假单胞菌可同化20 mg/L左右的磷｡试验也证实了这一点,同时还增加了沼泽红假单胞菌对氮素同化能力的研究｡试验中,研究的是沼泽红假单胞菌在培养基中的氮磷转化效率,未涉及到其在实际湖水中的氮磷同化能力｡在实际湖水中,其他不同种群微生物的共同作用[7]､藻类的竞争[8]､浮游动物[9]和鱼类的捕食[10]等都会不同程度地影响沼泽红假单胞菌对氮磷的转化效率,所以应在今后进行进一步探究｡参考文献:[1] 董秋明.利用光合细菌降解有机废水中硫化物的初步探究[J].环境与开发,1998,13(1):22-24.[2] 何剑丹,龙炳清,刘长根,等.光合细菌的应用现状与前景[J].四川师范大学学报(自然科学版),2005,28(1):114-116.[3] 周茂洪,赵肖为,吴学昌.光合细菌沼泽红假单胞菌同化磷能力的研究[J].科学通报,2002,18(2):142-146.[4] 丁爱华.光合细菌调控水产养殖业水质的研究[J].农业环境保护,2000,19(6):339-341,344.[5] 常会庆,王世华,寇太记,等.固定化光合细菌对水体富营养化的去除效果[J].水资源保护,2010,26(3):64-67.[6] 刘影.光合细菌的增殖培养及其处理城市污水中氮磷的研究[D].青岛:中国海洋大学,2006.[7] 季明.人工复合细菌对水体污染净化效果的实验研究[J].天津城市建设学院学报,2002,8(1):1-4.[8] 李保珍,冯佳,谢树莲.光合细菌对铜绿微囊藻生长的抑制效应[J].生态环境学报,2009,18(5):1736-1740.[9] 韩士群,范成新,严少华.固定化微生物对养殖水体浮游生物的影响及生物除氮研究[J].应用与环境生物学报,2006,12(2):251-254.[10] 张满隆, 杨绍斌, 潘玉. 光合细菌及其在鱼类养殖中的应用[J].水利渔业,2002,22(3):6-7.。