沼泽红假单胞菌

沼泽红假单胞菌

沼泽红假单胞菌，是地球上最古老的具有光能合成体系的原核生物，沼泽红假单胞菌是广泛自然界的微生物，是一类易广能为能源，利用自然界中的有机物、硫化物等为营养体，并能进行光合作用的生物。在生物学分类中属于真细菌纲、红螺菌目红螺菌科、红假单细胞菌属

。当前广泛应用于以下几个方面，○1高浓度工业有机废水的处理及资源化；○2水质净化剂，水产养殖的调控及促进健康生长；○3高营养饲料添加剂；○4农业生产中的高效活性菌肥。

沼泽红假单胞菌，别名：红假菌，是研究和应用较为广泛地一种光合细菌，属于外硫红螺菌科红假单细胞菌属，年幼单个的细胞呈杆状到卵形偶见稍弯，细胞直径0.6-0.9um,极生鞭毛运动或不运动，生长有极性，不对称出芽分裂。革兰氏染色阴性。厌氧液体培养物最初呈淡红色，后来变成红至褐红色，老培养物为暗棕红色。好氧培养物无色到粉红色。光能异氧菌，兼性好氧。可以在光下营厌氧生活，或在黑暗下好养生长。大多数菌种能长在洋菜平板或斜面上，虽然最初分离时，许多菌株表现对氧敏感，能在有简单的有机底物和碳酸氢钠及以对-氨基苯甲酸盐为生长素的无机盐培养基上生长。有的菌株还需要加入生物素。酵母膏有明显刺激生长的作用。PH范围，5.5-8.5；脂肪酸在PH7.0以下会抑制生长。最是生长范围30-37℃。作为碳源或光合作用的电子供体的底物，乙醇，脂肪酸，C4二羧酸，氨基酸，苯甲酸盐，环己烷羧酸，甲酸盐，分子氢和硫代硫酸盐只能在少量酵母膏时才能利用。不利用单糖类和糖醇类，硫化物。光合色素为叶绿素a、h和胡萝卜素。最佳生长方式是利用各种有机化合物作碳源和电子供体进行光照厌氧。厌氧条件下以氢、硫代硫酸硫酸钠、硫化氢等做电子供体可光自养生长。G+Cmol%为64.8-66.4.并具有适应性强，能耐受高浓度的有机废水和较强的分解转化能力，对酚、氰等毒物也有一定的耐受和分解能力等特点可用于水质净化、污水处理、饲料级微生物添加剂等。在琼脂培养基上培养，菌落形态为草帽性或圆形，表面光滑，少隆起，边缘整齐，棕红色显微镜下观察形态为短杆状或卵圆形，款0.5um-0.9um，长1.2um-2.0um，无芽孢无荚膜，单极鞭毛，可运动。革兰氏染色阴性。

一、实验目的

应用沼泽红假单胞菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离沼泽红假单胞菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。

二、实验原理

将待分离的菌落接种于培养基，然后进行反复的纯化，最后观察菌落的形态，按照细菌鉴定手册鉴定；按所需碳源、氮源、磷酸盐、酵母膏等因素进进行正交设计，优化出最佳的培养基配方，分离与纯化得到一株红红螺茵科沼泽红假单胞菌

三、实验器材和用品

○1生长培养基

丙酸钠3.0g

硫酸铵2.0g

磷酸二氢钾0.5g

磷酸氢二钾0.5g

硫酸镁0.2g

氯化钠0.5g

氯化钙0.1g

酵母膏1.0g

水1000ml PH自然厌氧光照培养，光照强度2000lx，温度29-31度

○2分离培养基

酵母膏3.0

蛋白胨5.0

氯化钠2.0

硫酸镁0.5

琼脂8g- 20g

水1000ml pH自然，厌氧光照培养，光照强度2000lx，温度29-31度

○3富集培养基

丙酸钠1.0g

硫酸铵1.0

磷酸二氢钾0.5g

磷酸氢二钾0.5g

硫酸镁0.2g

氯化钠0.5g

酵母膏0.1g

水1000ml PH5.5到8.5富集培养厌氧光照培养，光照强度2000lx，温度29-31度

A.革兰氏染色试剂

a)草酸铵结晶紫染液

A液：结晶紫(crystal violet) 1.0g

95%酒精20ml

B液：草酸铵(ammonium oxalate) 0.8g

蒸馏水80ml

混合A、B二液，静置48小时后使用。

b)2、卢戈氏(Lugol)碘液（革兰氏碘液）

碘片1.0g

碘化钾2.0g

蒸馏水300ml

先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即成。

3、95%的酒精溶液。

4、沙黄复染液

沙黄0.25g

95%的酒精10ml

蒸馏水90ml

将沙黄溶于乙醇中，再用蒸馏水稀释。

c)1%NaOH溶液、1%HCl、液体石蜡、0.9%NaCl

d)5ml的移液管、玻璃棒、试管5个、250ml的锥形瓶2个、培养皿10个、电

磁炉、高压灭菌锅、37度恒温培养箱、接种环、酒精灯无菌操作箱、电子天

平、100ml量筒、100ul移液枪

四、试验方法

A、取下水道污水按20%接种于约500ml灭菌的富集培养基的滴流瓶中，用灭菌的胶塞封口，28度下光照（1000lx）厌氧培养。到培养液棕红色时，再以同样方式转接一次使待分离菌占优势。再装有固体富集培养基的克氏瓶中划线，盖上灭菌胶塞用固体石蜡封口，同样条件下培养十五天。得单菌落。再以同样的方法分离纯化获得纯培养。

B、取材并稀释：取下水道污水10ml加入到灭菌后的试管○1中，在试管○2○3分别加9ml灭菌后的0.9%NaCl溶液，从试管○1中取1ml加入到○2中，震荡后再从○2中取1ml加入到○3中。

倒平板：按无菌操作要求，在洁净工作台或在火焰旁操作，取融化并冷却至不烫手的固

体培养基（约500C），倒入无菌培养皿，倒量以铺满皿底为限（15-20ml），平放待其

冷却凝固，备用。

涂布：用接移液枪分别从试管○1○2○3取100um分别接种到分离培养基上用石蜡密封并标记，

至于，光照强度为2000lx，温度为29-31度厌氧培养24h，

镜检：挑取形态为草帽性或圆形，表面光滑，少隆起，棕红色边缘整齐单个菌落做镜检。